基于PERK_Nrf2通路探讨复方芪鹰颗粒治疗糖尿病周围神经病变的机制.pdf
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1、中国医药导报2 0 2 3年9 月第2 0 卷第2 7 期论著基于PERK/Nrf2通路探讨复方芪鹰颗粒治疗糖尿病周围神经病变的机制陈臣1胡燕1刘涛2胡晓灵21.新疆医科大学第四临床医学院,新疆乌鲁木齐8 30 0 11;2.新疆维吾尔自治区中医医院,新疆乌鲁木齐8 30 0 0 0摘要 目的基于PERK/Nrf2通路探讨复方芪鹰颗粒对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠的作用机制。方法将7 2 只体重18 0 2 2 0 g、8 周龄的SPF级雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、模型组、阳性药组及复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组,每组12 只。除正常对照组外,其余五组均持续喂食高脂饲
2、料,8 周后注射链脲佐菌素(30 m g/k g),然后选取空腹血糖 11.1mol/L的大鼠继续高脂饮食4周构建DPN模型。DPN造模成功后,复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组分别给予复方芪鹰颗粒1.17、2.34、4.6 8 g/kg,阳性药组给予氧化三甲胺(110 mg/kg),灌胃2ml/次,1次/d,正常对照组、模型组给予等量双蒸水。干预4周,比较六组干预前后的血糖变化,对六组坐骨神经进行苏木精-伊红染色,采用蛋白质印迹法检测六组坐骨神经中葡萄糖调节蛋白7 8(CRP78)蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、转录激活因子4(ATF4)、核转录因子红系2
3、相关因子2(Nrf2)、C/EBP同源蛋白(CHOP)胱天蛋白酶-3(caspase-3)表达水平。结果正常对照组有髓神经纤维结构完整、分布均匀、排列规则,轴索、髓鞘及神经膜形态结构良好、完整,神经内膜形态结构正常;模型组有髓神经纤维脱失、减少,部分排列紊乱,部分轴索变性,节段性脱髓鞘,神经膜增厚,神经内膜胶原纤维增生;复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组髓神经纤维轴索变性、脱髓鞘、神经膜增厚及神经内膜增生程度轻于模型组。DPN造模成功后,模型组血糖高于正常对照组(P0.05)。药物干预4周后,模型组血糖高于正常对照组,复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组血糖低于模型组,复方芪鹰颗粒中、高剂量组血糖低于复方芪
4、鹰颗粒低剂量组(P0.05)。模型组坐骨神经组织GRP78、p-PERK、A T F4、CH O P、caspase-3高于正常对照组,Nrf2低于正常对照组(P0.05)。复方芪鹰颗粒中、高剂量组CRP78、A T F4、CH O P低于模型组,Nrf2高于模型组;复方芪鹰颗粒高剂量组p-PERK、c a s p a s e-3低于模型组(P0.05)。复方芪鹰颗粒高剂量组ATF4、C H O P低于复方芪鹰颗粒低剂量组,复方芪鹰颗粒中剂量组CHOP低于复方芪鹰颗粒低剂量组(P0.05)。结论复方芪鹰颗粒具有一定的降血糖和保护神经的作用,其作用机制可能是通过抑制PERK/Nrf2通路,减轻了
5、内质网应激。关键词 复方芪鹰颗粒;糖尿病周围神经病变;内质网应激;PERK/Nrf2通路中图分类号 R587.2D01:10.20047/j.issn1673-7210.2023.27.01Discussion of mechanism of Compound Qiying Granules based on PERK/Nrf2 pathway in treating diabetic peripheral neuropathyCHEN Chen HU YanLIU TaoHU Xiaoling?1.The Fourth Clinical Medical College,Xinjiang Me
6、dical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830011,China;2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Uygur AutonomousRegion,Urumqi 830000,ChinaAbstract Objective To investigate the mechanism of Compound Qiying Granules on diabetic peripheral neur
7、opathy(DPN)rats based on PERK/Nrf2 pathway.Methods A total of 72 SPF male Wistar rats weight 180-220 g and aged eightweeks were divided into normal control group,model group,positive drug group,and Compound Qiying Granules low-dose,medium-dose,high-dose groups by random number table method,with 12 r
8、ats in each group.Except the normal control基金项目】国家自然科学基金资助项目(8 196 0 8 44);中国group,t h e o t h e r f i v e g r o u p s w e r e c o n t i n u o u s l y f e d h i g h-f a t d i-博士后科学基金面上资助二等项目(2 0 2 0 M673545)。et,and streptozotocin(30 mg/kg)was injected eight weeks lat-作者简介 陈臣(1999.7-),男,新疆医科大学第四临床医学e
9、r,a n d t h e n r a t s w i t h f a s t i n g b l o o d g l u c o s e 11.1m o l/Lw e r e院2 0 2 2 级中西医结合临床专业在读硕士研究生;研究方selected to continue high-fat dietfor fourweeksto buildDPN向:中西医结合治疗老年病。model.After the DPN modeling was successful,Compound通讯作者刘涛(198 1.10-),男,博士,博士后,副主任医师,Qiying Granules low-dose,m
10、e d i u m-d o s e,h i g h-d o s e g r o u p s硕士生导师;研究方向:中西医结合治疗老年病。were given 1.17,2.34,4.68 g/kg Compound Qiying Granules,CHINA MEDICAL HERALD Vol.20 No.27 September 2023文献标识码 A文章编号】16 7 3-7 2 10(2 0 2 3)0 9(c)-0007-05论著respectively,the positive drug group was given Trimethylamine Oxide(110 mg/kg),
11、2 ml/time,once a day,the normal controlgroup and model group were given the same amount of double steaming water.After four weeks of intervention,blood glucosechanges before and after intervention in the six groups were compared,and hematoxylin-eosin staining of sciatic nerve in thesix groups was ob
12、served.Glucose regulatory protein 78(GRP78),protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase(PERK),phosphorylated PERK(p-PERK),activating transcription factor 4(ATF4),nuclear factor-erythroid 2-related factor2(Nrf2),C/EBP homologous protein(CHOP),cysteine aspartic acid specific protease-3(caspas
13、e-3)in six groups of sciaticnerves were detected by Western blot.Results In the normal control group,the structure of myelinated nerve fibers wascomplete,the distribution was uniform,the arrangement was regular,the shape and structure of axons,myelin sheath,andnerve membranes were good and complete,
14、and the shape and structure of endoneurals were normal.In the model group,there were loss and decrease of myelinated nerve fibers,partial disordered arrangement,partial axonal degeneration,seg-mental demyelination,thickening of nerve membrane,and hyperplasia of endoneural collagen fibers.The degree
15、of degener-ation,demyelination,thickening of nerve membrane,and hyperplasia of nerve intima in Compound Qiying Granuleslow-dose,medium-dose,high-dose groups were less than those in model group.After the successful DPN modeling,theblood glucose of the model group was higher than that of the normal co
16、ntrol group(P0.05).After four weeks of drug intervention,the blood glucose of model group was higher than that of nor-mal control group,and those of Compound Qiying Granules low-dose,medium-dose,high-dose groups were lower thanthose of model group,and those of Compound Qiying Granules medium-dose,hi
17、gh-dose groups were lower than those inCompund Qiying Granules low-dose group(P0.05).GRP78,p-PERK,ATF4,CHOP,and caspase-3 of sciatic nerve tis-sues in model group were higher than those in normal control group,and Nrf2 was lower than that in normal control group(P0.05).GRP78,ATF4,and CHOP in Compoun
18、d Qiying Granules medium-dose,high-dose groups were lower than thosein model group,and Nrf2 were higher than those in model group;p-PERK and caspase-3 in Compound Qiying Granuleshigh-dose group were lower than those in model group(P0.05).ATF4 and CHOP of Compound Qiying Granuleshigh-dose group were
19、lower than those of Compound Qiying Granules low-dose group,CHOP of Compound Qiying Granulesmedium-dose group was lower than that of Compound Qiying Granules low-dose group(P 11.1 mol/L的大鼠作为糖尿病模型大鼠继续高脂饮食4周后,用Medi-tronickeypoint-4workstation肌电图仪评估DPN造模情况,以下肢坐骨神经感觉或运动传导速度减慢11%为造模成功。1.4分组与给药将实验动物采用计算机随
20、机数字法分为正常对照组、模型组、阳性药组及复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组,每组12 只。模型组、阳性药组及复方芪鹰颗粒低、中、高组构建DPN大鼠模型,造模成功后复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组分别予以复方芪鹰颗粒1.17、2.34、4.6 8 g/k g l 4,阳性药组予以氧化三甲胺110 mg/kg,2ml/次,灌胃1次/d,模型组及正常对照组给予等量的双蒸水。干预时间为4周,期间各组自由进食和水。1.5血糖测定及苏木精一伊红染色在DPN造模成功后及药物干预4周后,取大鼠尾部血,用Accu-Chek血糖仪测血糖。在末次给药后,所有大鼠禁食12 h,用3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)充分麻醉,俯
21、卧位固定于手术台上,手术留取坐骨神经标本15,并将组织一部分置于10%福尔马林溶液,一部分置于冻存管内,液氮速冻后于-8 0 冻存备用。将10%福尔马林溶液中坐骨神经标本固定1周后,进行石蜡包埋,最后切制成约5m切片。按照苏木精-伊红染色试剂盒上说明进行操作,分别在40、10 0、2 0 0及40 0 倍显微镜下观察大鼠坐骨神经病理学改变。1.6蛋白质印迹法检测相关蛋白根据课题组前期实验方法15 对各组坐骨神经组正常对照组阳性药组织进行蛋白质印迹法检测。一抗孵育:GRP78(1:1000稀释)PERK(1:8 0 0 稀释)p-PERK(1:6 0 0 稀释)、ATF4(1:8 0 0 稀释)
22、、Nrf2(1:8 0 0 稀释)、CH0P(1:8 0 0稀释)、caspase-3(1:10 0 0 稀释)、-actin(1:10 0 0稀释)。二抗兔抗(R)1:5000稀释,鼠抗(M)1:15000稀释。采用ChemiScopemini化学发光仪检测、拍照,用Image Lab图像分析。1.7统计学方法采用SPSS23.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数标准差(x土s)表示,两组比较采用t检验。多组计量资料比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P0.05为差异有统计学意义。2结果整个实验过程中,最终完成实验动物为46 只,其中正常对照组12 只、模型组6 只、
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