基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 1858基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法陈天楠1,2,3,胡鲲1,2,3*(1水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学),上海201306;2国家水生动物病原库(上海海洋大学),上海201306;3农业农村部淡水水产种质资源重点实验室(上海海洋大学),上海201306)摘要:【目的】建立基于16S rRNA序列和gyrB基因串联DNA特征序列的属内菌种鉴定方法,为气单胞菌的种间区分提供技术支持。【方法】以20202021年在我国福建、江苏等地分离获得的水产源气单胞菌和NCBI已公布且完成全基因组测序的10种气单胞菌为研究对
2、象,分别以16S rRNA序列、gyrB基因及2个基因序列串联后得到的新DNA特征序列作为构建系统发育进化树的依据,比较不同系统发育进化树的鉴定结果,并以运动性试验、溶血性试验、糖发酵试验进行辅助鉴定。【结果】在基于16S rRNA序列构建的系统发育进化树中,中间气单胞菌、嗜水气单胞菌、达卡气单胞菌、肠源气单胞菌等聚类在不同分支上,未能形成独立的种属进化分支;在基于gyrB基因构建的系统发育进化树中,达卡气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌聚类在同一分支上,而异嗜糖气单胞菌和维氏气单胞菌聚类在另一分支上。将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树建树,能完
3、全有效分离气单胞菌属的不同菌株,将不同种的气单胞菌独立聚为一支,较好地实现种间区分。【结论】将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树,较基于16S rRNA序列或gyrB基因单独构建系统发育进化树具有更高的分辨力,是一种理想的保守序列相似性高的属内菌种鉴定方法。因此,在16S rRNA测序鉴定为气单胞菌的情况下可再次以gyrB基因为测序对象,获得序列信息后与16S rRNA序列串联构建系统发育进化树,能更加精确地将气单胞菌鉴定到种水平。关键词:气单胞菌;16S rRNA序列;gyrB基因;串联DNA序列;系统发育进化树中图分类号:S917.1文献标志码:
4、A文章编号:2095-1191(2023)06-1858-10收稿日期:2022-06-08基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项(2019YFD0900102);国家淡水水产种质资源库建设项目(FGRC:18537)通讯作者:胡鲲(1976-),https:/orcid.org/0000-0003-4541-2917,博士,教授,博士生导师,主要从事水生动物医学研究工作,E-mail:第一作者:陈天楠(1997-),https:/orcid.org/0000-0001-5626-8725,研究方向为水生动物医学,E-mail:南方农业学报Journal of Southern
5、 Agriculture2023,54(6):1858-1867ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.027Identification of Aeromonas based on 16S rRNA and gyrB genetandem DNA characteristic sequenceCHEN Tian-nan1,2,3,HU Kun1,2,3*(1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Educ
6、ation(Shanghai Ocean University),Shanghai 201306,China;2National Pathogen Collection Center forAquaticAnimals(Shanghai Ocean University),Shanghai 201306,China;3Key Laboratory of FreshwaterAquatic Genetic Resources,Ministry ofAgriculture andRuralAffairs(Shanghai Ocean University),Shanghai 201306,Chin
7、a)Abstract:【Objective】This work was aimed to establish a identification method of Aeromonas based on 16S rRNAsequence and gyrB gene tandem DNAcharacteristic sequence,and to provide research technical support for the differentia-tion of Aeromonas at the species level.【Method】The aquatic bacteria,whic
8、h were detected as Aeromonas later,isolatedfrom Fujian,Jiangsu and other places in China from 2020 to 2021 and ten different species of Aeromonas that have com-pleted genome sequencing on NCBI were taken as the experimental objects.The 16S rRNA sequence,gyrB gene and thenew DNA characteristic sequen
9、ces obtained from the tandem of the two sequences were used as the basis for the establish-ment of the evolutionary tree.The results were identified by comparing different evolutionary trees,meanwhile,exercise6期18590引言【研究意义】据统计,2020年我国渔业总产值达13517.24亿元,其中海水养殖3836.20亿元、淡水养殖6387.15亿元;淡水养殖面积5040.56千ha,而
10、受灾面积达808.79千ha,水产品损失1525996.46万元中除去台风及洪涝导致的1151197.81万元外,剩下的以病害损失最严重(208778.81万元)(农业农村部渔业渔政管理局等,2021)。鱼病是制约我国水产养殖健康发展的瓶颈问题,尤其是细菌性鱼病。气单胞菌(Aeromonas sp.)作为水产常见的条件性致病菌,能引起鱼类行动缓慢、吃食减少、鳍部充血、体表溃疡及腹水等症状(戴瑜来等,2019),目前已鉴定的气单胞菌有36个种、12个亚种(邓玉婷等,2019)。因此,开展水产气单胞菌鉴定分型研究,对预测防控水产养殖疾病及确保我国水产渔业持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】气
11、单胞菌最早于1893年被发现,1943年被划分入弧菌科(Vibrionaceae),在1984年版的 伯杰氏细菌鉴定手册 中气单胞菌仍归属于弧菌科,按其表型与致病性最初仅有3个种:嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、斑点气单胞菌(A.punc-tatus)和杀鲑气单胞菌(A.salmonides)。随着微生物学研究的不断深入,越来越多的气单胞菌被研究发现,在1994年版的 伯杰氏细菌鉴定手册 中新增了维氏气单胞菌(A.veronii)、中间气单胞菌(A.media)、舒伯特气单胞菌(A.schubertii)和嗜泉气单胞菌(A.eucrenophila)4种新的气单胞菌,但此时气单胞菌仍
12、归属于弧菌科。基于5S rRNA和16S rRNA序列的生物分类研究,有学者质疑气单胞菌与弧菌科的不同,并呼吁气单胞菌应独立成科(宋元鍉和何晓青,1990)。目前,气单胞菌在 国际系统与进化微生物 杂 志(International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology,IJSEM)的生物分类中隶属于气单胞菌目(Aeromonadales)气单胞菌科(Aero-monadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)。近年来,不断报道有新的气单胞菌被发现,包括A.simiae(Mokrac-ka et al.,2001)、A.cul
13、icicola(Pidiyar et al.,2002)、A.molluscorum(Miana-Galbis et al.,2004)、A.shar-mana(SahaandChakrabarti,2006)、A.bivalvium(Miana-Galbis et al.,2007)、A.tecta(Demarta et al.,2008)、A.aquariorum(Martnez-Murcia et al.,2008)、A.diversa(Miana-Galbis et al.,2009)、A.rivuli(Figuer-as et al.,2011)、A.staiwanensis、A.s
14、anarellii(Beaz-Hidalgo et al.,2012)等,对于日益增多的气单胞菌种类,亟待探索出更加精确的鉴定方法。【本研究切入点】在细菌鉴定中,目前最常用最准确的方法是分子生物学鉴定,其中16S rRNA序列因在原核生物中广泛存在且具有高度的保守性,已发展成为微生物鉴定的金标准(史斌等,2013;刘赛,2018;麻强生等,2020)。由于16S rRNA序列的高度保守性,细菌鉴定时能精确到属,但难以继续往下精确到种,因此需要额外的辅助手段来进一步鉴定。【拟解决的关键问题】以20202021年在我国福建、江苏等地分离获得的水产源气单胞菌和NCBI已公布且完成全基因组测序的10种
15、气单胞菌为研究对象,分别以16S rRNA序列、gyrB基因及2个基因序列串联后得到的新DNA特征序列作为构建系统发育进化树的依据,比较不同系统发育进化树的鉴定结果,并以运动性试验、溶血性试验、糖发酵试验进行辅助鉴定,旨在进一步优化16S rRNA细菌鉴定方法,为气单胞菌的种间区分提供技术支持。tests,hemolysis tests,and sugar fermentation tests were also be used for auxiliary identification.【Result】The resultsshowed that the combined tree had b
16、etter discrimination effect than the single gene tree.In the phylogenetic evolution treeconstructed based on single 16S rRNA sequences,A.media,A.hydrophila,A.dhakensis,and A.enteropelogenes weredispersed on different branches,and did not form independent species and evolutionary branches.In the phyl
17、ogenetic evo-lution tree constructed based on the single gyrB gene,A.dhakensis,A.caviae,and A.hydrophilawere clustered on thesame branch,while A.allosaccharophila and A.veronii were also clustered on the same branch.By combining 16S rRNAsequence and gyrB gene in tandem to form a new DNA characterist
18、ic sequence,the phylogenetic evolutionary tree wasconstructed,which could completely and effectively isolate different strains of Aeromonas,and cluster different speciesof Aeromonas into an independent branch,so as to achieve better interspecific differentiation.【Conclusion】The phyloge-netic tree co
19、nstructed by combining 16S rRNA sequence and gyrB gene in tandem to form a new DNA sequence has betteridentification ability than the phylogenetic tree constructed solely based on 16S rRNA sequence or gyrB gene.It is an idealmethod for genus species identification with high conserved sequence simila
20、rity.Therefore,in the case of the identifica-tion of Aeromonas by 16S rRNA sequencing,gyrB gene can be used as the sequencing object again,and after obtainingsequence information,the phylogenetic evolutionary tree can be constructed in tandem with 16S rRNA sequence to moreaccurately identifyAeromona
21、s to the species level.Key words:Aeromonas;16S rRNAsequence;gyrB gene;tandem DNAsequence;phylogenetic treeFoundation items:“Technological Innovation of Blue Granary”of National Key Research and Development Programof China(2019YFD0900102);National Freshwater Aquatic Germplasm Resources Bank Construct
22、ion Project(FGRC:18537)陈天楠等:基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法54卷南 方 农 业 学 报 18601材料与方法1.1试验材料Taq DNA聚合酶预混液、DNA分子量标准、6DNA Loading Buffer及细菌基因组快速抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司;Golden-ViewTM核酸染料购自北京博迈德基因技术有限公司;50TAE溶液购自北京酷来搏科技有限公司;盐酸四甲基对苯胺和水杨酸购自上海凛恩科技发展有限公司;七叶苷购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;琼脂糖、BHI液体培养基、AHM培养基、Kovacs试剂、葡萄
23、糖、蔗糖及阿拉伯糖购自青岛海博生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。菌株为20202021年辽宁、山东、江苏、上海、福建、新疆各地水产研究所上报的部分气单胞菌属菌株和上海海洋大学国家水生动物病原库自行分离的气单胞菌属菌株,详见表1。常见培养基:BHI固体培养基、LB液体培养基、AHM培养基、0.002 mol/L氢氧化钠溶液、溴甲酚紫指示剂均按说明进行配制。糖发酵试验管:各类糖粉末(g)蛋白胨(g)蒸馏水(mL)=1 0.5 100,分装于15 mL离心管中,滴加23滴溴甲酚紫指示剂,并以稀醋酸或碳酸氢钠溶液调节pH至7.0左右(溶液呈紫色)。121 高压灭菌15 min,超净台内放置备用
24、。脱纤维羊血琼脂培养基:在普通LB固体培养基温度降至50 凝固前,按脱纤维羊血 固体培养基=1 10比例加入脱纤维羊血,混匀,凝固后倒置于超净台内备用。1.2试验方法1.2.1细菌培养冻存菌株复苏活化:(1)从-80 冰箱取出菌株冻存管,解冻后用移液枪吸取100 L菌液接种至LB液体培养基中,30 复苏培养24 h。(2)以灭菌接种环蘸取少许已复苏的菌液,划线接种至LB固体培养基上,30 培养24 h。(3)判断菌株无污染后,挑取长势良好的菌落接种至新的LB液体培养基中,30 培养18 h后即可使用。1.2.2生理生化鉴定根据GB/T 186522002致病性嗜水气单胞菌检验方法,检测菌株的氧
25、化酶、运动性、吲哚、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、水杨苷等8项指标。同时,对LB固体培养基上生长成型的菌落滴加12滴1%盐酸四甲基对苯胺,静置观察其颜色变化;以灭菌接种环挑取LB固体培养基上生长成型的单菌落,水平穿刺接种至AHM半固体培养基上,30 培养24 h,观察细菌运动性;在长有菌落的AHM培养基顶部滴加45滴Kovacs试剂,观察管壁内颜色变化;用灭菌接种环挑取LB固体培养基上生长成型的少许菌落,分别接种到5管不同糖发酵试验管内,30 培养24 h,观察其颜色变化。1.2.3溶血试验以灭菌接种环蘸取少许新鲜菌液,在脱纤维羊血琼脂培养基上划分的3个区内各自划线接种,30 培养24 h,
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