鸡胚种植肿瘤模型构建及其抗肿瘤药物药效评价.pdf
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1、 第3 2卷第3期2 0 2 3年9月江苏海洋大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f J i a n g s u O c e a n U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.3 2 N o.3S e p.2 0 2 3 D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.2 0 9 6-8 2 4 8.2 0 2 3.0 3.0 0 8鸡胚种植肿瘤模型构建及其抗肿瘤药物药效评价*吕金玉a,周娇娇a,左玲怡a,谢梦如a,王伟玲a,b,刘 彬a,b,吉 敬a,b(江苏海洋大学 a.
2、药学院;b.江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室,江苏 连云港 2 2 2 0 0 5)摘 要:肿瘤活体模型可以高度模拟人体内的肿瘤生长情况,从而评价药物在体内经过吸收、分布和代谢后的活性,因此,建立合适的临床前抗肿瘤药物研究模型至关重要。基于此,建立了一种新型鸡胚尿囊膜(c h i c k e n e m b r y o a l l a n t o i c m e m b r a n e,C AM)种植肿瘤模型并应用于评价抗肿瘤药物的疗效,为开发新的抗肿瘤药物及寻找肿瘤治疗新策略提供模型基础。通过监测鸡胚孵育期间对移植瘤的排斥反应,根据成瘤率和成瘤大小,探究最佳气室转移时间、种瘤时间及不同肿
3、瘤细胞系种瘤浓度,优化种瘤方式,以此构建鸡胚种植肿瘤模型。结果表明,鸡胚孵育第7天转移气室,孵育第8天硅胶环接种21 06个/颗H e p G 2或H e l a细胞、1.51 06个/颗A 4 9 8细胞、41 06个/颗MD A-MB-2 3 1细胞,能够建立稳定的鸡胚种植肿瘤模型。模型应用于抗肿瘤药物阿贝西利的药效评价,结果显示阿贝西利给药7 2 h后,给药组肿瘤随着给药浓度增加而逐渐减小,呈明显线性关系。鸡胚尿囊膜肿瘤模型或许是一种理想的抗肿瘤药物筛选模型,在药物疗效的临床前初步评价方面具有一定的应用前景。关键词:动物模型;异种移植;抗肿瘤药物;鸡胚尿囊膜 中图分类号:R 9 6 5
4、文献标志码:A 文章编号:2 0 9 6-8 2 4 8(2 0 2 3)0 3-0 0 4 9-0 7C o n s t r u c t i o n o f C h i c k e n E m b r y o I m p l a n t a t i o n T u m o r M o d e l a n d E v a l u a t i o n o f I t s A n t i t u m o r D r u g E f f i c a c yL J i n y ua,Z HOU J i a o j i a oa,Z UO L i n g y ia,X I E M e n g r ua,
5、WANG W e i l i n ga,b,L I U B i na,b,J I J i n ga,b(a.S c h o o l o f P h a r m a c y;b.J i a n g s u K e y L a b o r a t o r y o f M a r i n e P h a r m a c e u t i c a l C o m p o u n d S c r e e n i n g,J i a n g s u O c e a n U n i v e r s i t y,L i a n y u n g a n g 2 2 2 0 0 5,C h i n a)A b s
6、t r a c t:T h e i n v i v o t u m o r m o d e l c a n h i g h l y s i m u l a t e t h e t u m o r g r o w t h i n t h e h u m a n b o d y,s o a s t o e v a l u a t e t h e a c t i v i t y o f d r u g s a f t e r a b s o r p t i o n,d i s t r i b u t i o n a n d m e t a b o l i s m i n v i v o,s o i
7、t i s v e r y i m p o r t a n t t o e s t a b l i s h a s u i t a b l e p r e c l i n i c a l a n t i-t u m o r m o d e l.I n t h i s s t u d y,a n e w t u m o r m o d e l i m p l a n t e d w i t h c h i c k e m b r y o a l l a n t o i c m e m b r a n e w a s e s t a b l i s h e d a n d a p p l i e
8、d t o e v a l u a t e t h e e f f i c a c y o f a n t i n e o p l a s t i c d r u g s.I t p r o v i d e d a m o d e l b a s i s f o r d e v e l o p i n g n e w a n t i n e o p l a s t i c d r u g s a n d f i n d i n g n e w s t r a t e g i e s f o r t u m o r t r e a t m e n t.B y m o n i t o r i n
9、g t h e r e j e c t i o n o f t r a n s p l a n t e d t u m o r d u r i n g c h i c k e n e m b r y o i n c u b a t i o n,a n d a c c o r d i n g t o t h e t u m o r f o r m a t i o n r a t e a n d t u m o r s i z e,t h e o p t i m a l a i r c h a m b e r m e t a s t a s i s t i m e,t u m o r p l a
10、n t i n g t i m e a n d t u m o r c o n c e n t r a t i o n o f d i f f e r e n t t u m o r c e l l l i n e s w e r e e x p l o r e d,a i m i n g t o o p t i m i z e t h e t u m o r p l a n t i n g m o d e a n d e s t a b-l i s h a s t a b l e t u m o r i m p l a n t a t i o n m o d e l.T h e r e s
11、u l t s s h o w e d t h a t t h e s t a b l e c h i c k e n e m b r y o i m p l a n t a-t i o n t u m o r m o d e l c o u l d b e e s t a b l i s h e d b y i n o c u l a t i n g 2 1 06 H e p G 2 c e l l s o r H e l a c e l l s,1.51 06 A 4 9 8*收稿日期:2 0 2 3-0 2-1 3;修订日期:2 0 2 3-0 3-3 1作者简介:吕金玉(1 9 9 6
12、),女,江苏徐州人,硕士研究生,研究方向为药理学,(E-m a i l)1 5 2 8 5 8 4 0 4 3q q.c o m。通信作者:吉敬(1 9 9 1),女,江苏连云港人,副教授,博士,研究方向为神经退行性疾病的发病机制、蛋白质的翻译后修饰及其在疾病中的作用,(E-m a i l)j i j i n g j o u.e d u.c n。c e l l s,41 06 MD A-MB-2 3 1 c e l l s b y s i l i c o n e r i n g o n t h e 7 t h d a y a f t e r i n c u b a t i o n.I t w
13、a s a p p l i e d t o t h e e f f i c a c y e v a l u a t i o n o f t h e a n t i n e o p l a s t i c d r u g n a m e d A b e m a c i c l i b.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e t u m o r i n t h e t r e a t m e n t g r o u p d e c r e a s e d g r a d u a l l y w i t h t h e i n c r e a s
14、e o f d r u g c o n c e n t r a t i o n a f t e r 7 2 h o u r s.T h e r e w a s a n o b v i o u s l i n e a r r e l a t i o n s h i p.I t i s c o n c l u d e d t h a t t h e c h i c k e m b r y o a l l a n t o-i c m e m b r a n e t u m o r m o d e l m e y b e a n i d e a l m o d e l f o r s c r e e
15、n i n g a n t i n e o p l a s t i c d r u g s,a n d i t h a s a g o o d a p p l i c a t i o n p r o s p e c t i n t h e p r e l i m i n a r y p r e c l i n i c a l e v a l u a t i o n o f d r u g e f f i c a c y.K e y w o r d s:a n i m a l m o d e l;x e n o t r a n s p l a n t a t i o n;a n t i n e
16、o p l a s t i c d r u g s;c h i c k e n e m b r y o a l l a n t o i c m e m b r a n e 近年来,世界范围内的癌症发病率呈现逐年升高的趋势,癌症对人类生命健康安全构成了巨大威胁1。这种状况亟需研究者在癌症的预防和治疗方面加大投入,开发新的更有效的治疗方案。然而,现代生物医学领域仍面临抗肿瘤药物研发的诸多挑战,比如缺乏以人体为实验对象的临床前数据支持,因此动物模型成为不可或缺的研究工具和手段。肿瘤动物模型2能够高度还原人体内的肿瘤生长环境,从而反映体内药物经过吸收、分布和代谢后的药效,进而优化抗肿瘤药物的设计,为探
17、究肿瘤发生和转移的分子机制、筛选评价抗肿瘤药物的药理作用提供有效的手段。选择和建立适宜的临床前抗肿瘤模型对于癌症研究具有重要意义。目前,临床前模型最常见的是小鼠模型,包括诱发型小鼠肿瘤模型3、基因工程小鼠肿瘤模型4、病人来源异种移植肿瘤模型5(p a t i e n t-d e r i v e d x e n o-g r a f t s,P D X)、细胞系来源的异体移植肿瘤模型6(c e l l l i n e-d e r i v e d x e n o g r a f t,C D X)等。然而,小鼠模型存在成本高、操作复杂、建模困难等缺点。基于此,本研究通过总结研究各种动物肿瘤模型的优缺点
18、,提出了一种研究抗肿瘤药物疗效的理想体内模型 鸡胚尿囊膜肿瘤模型。鸡胚绒毛尿囊膜7(C AM)是受精卵内的一层胚外膜,位于蛋壳和胚胎之间。其血管化非常好,可以为移植肿瘤细胞系提供最佳的营养和生长因子8。此外,由于C AM不受神经支配,因此对C AM的任何操作都不会伤害胚胎。与其他3 D活体肿瘤模型相比,C AM移植模型更加简单、经济、快速,它克服了啮齿动物模型的许多缺点,提供了实时监测肿瘤生长的机会,让研究者能够在整个实验过程中实时监测C AM模型中的肿瘤生长,从而更加便于评估各种抗肿瘤药物对移植到C AM上的肿瘤生长的影响,并进一步推进个性化治疗方案。目前,鸡胚尿囊膜模型已经被国内外许多研究
19、者应用于胃癌、前列腺癌、结直肠癌等多种肿瘤研究9-1 1,甚至有研究者将其运用于药物对大脑的影响实验1 2,国内也有研究者将其应用于五味子多糖等中药对血管生成影响研究1 3-1 5,这为拓展该模型的应用提供了新的思路。总而言之,鸡胚尿囊膜肿瘤模型为研究癌症患者个体化治疗提供了新的选择,对于各种癌症的治疗也具有十分重要的意义。1 材料与方法1.1 主要材料和仪器乳腺癌细胞株MD A-MB-2 3 1、人肾癌细胞株A 4 9 8,购自国家生物医学实验室(北京);宫颈癌细胞系H e l a、肝癌细胞系H e p G 2,受赠于中国科学院药物研究所;细胞培养高糖型DMEM和MEM不完全培养基,购自江苏
20、凯基生物技术股份有限公司;胰蛋白酶(含E D T A),购自徐州微科曼得生物工程有限公司;灭菌 级 胎 牛 血 清(f e t a l b o v i n e s e r u m,F B S),购自新西兰N EWZ E RUM公司;质量均一受精蛋,购自安徽铜陵五峰山养鸡场;基质胶M a t r i g e l m a t r i x-3 5 4 2 3 4,购自美国康宁公司。移 液 器、细 胞 培 养 箱,美 国T h e r m o公 司;Z H J H-C 1 1 1 2 B超净工作台,上海智城分析仪器制造有限公司。1.2 细胞培养实验涉及的乳腺癌细胞株MD A-MB-2 3 1,宫颈癌细
21、胞株H e l a,肝癌细胞系H e p G 2,在含有1 0%(体积分数)胎牛血清(f e t a l b o v i n e s e r u m,F B S)的DMEM完全培养基中培养;人肾癌细胞株A 4 9 8,在含有1 0%(体积分数)F B S的MEM完全培养基中培养。将完全培养基培养的肿瘤细胞置于7 5 m L细胞培养瓶中,在3 7,5%C O2培养箱中无菌培养。培养过程中,依据肿瘤细胞生长情况对其进行换液、冻存和传代。所有操作均在无菌环境下进行。05江苏海洋大学学报(自然科学版)2 0 2 3年9月1.3 鸡胚孵育及气室转移选择质量和大小均一的受精蛋在2 03 5 的高锰酸钾水溶
22、液中消毒1 m i n后自然晾干,做好标记。室温中大头朝上静置2 h后,置于3 7.8 恒温恒湿培养箱中孵育培养,模拟母鸡的孵化方式,每2 h翻蛋一次(每天翻蛋至少4次)。孵育第61 0天,照蛋可明显看见气室与胚体之间界限分明,血管生长明显,基本布满半颗蛋表面,在第8天后隐约看见胎盘活动。在孵育第61 0天,强光手电筒照射观察标记气室和脐血管1 c m处,无菌环境下进行开窗。两处标记位置各扎一个针眼大小的孔,不能破坏鸡胚尿囊膜,洗耳球将受精蛋的原气室转移至脐血管处,此处血管生长密集,有利于后期的肿瘤生长,同时便于后期种瘤操作和肿瘤生长情况观察。将新气室处小洞的蛋壳和外壳膜去除,暴露血管,转移成
23、功后消毒膜封闭窗口,继续置于恒温恒湿培养箱中3 7.8 孵育培养备用。1.4 异种移植气室成功转移后的种蛋继续孵育,期间不需要翻蛋。取对数生长期的贴壁肿瘤细胞,弃去上层完全培养基液体,P B S清洗23次,加入2 m L胰酶消化,加入2 m L完全培养基终止消化,细胞计数板进行细胞计数,离心沉淀,加入完全培养基重悬细胞备用。根据计数情况,取适量细胞离心沉淀,加入基质胶与DMEM完全培养基体积比11的混悬液共6 0 L再次重悬细胞,置于3 7 孵育2 0 m i n,加入鸡胚尿囊膜脐血管附近血管密集区,封闭窗口,置于恒温恒湿培养箱继续孵育,观察鸡胚生长及成瘤情况,拍照、记录。所有操作均在无菌环境
24、下进行。1.5 数据统计学分析实验数据采用G r a p h P a d P r i s m 8软件进行统计学分析,组内比较采用单样本t检验法,以 P0.0 5作为差异显著性的判断标准。P0.0 5有统计学差异,P0.0 1有显著统计学差异。下文中,*表示P0.0 5,*表示P0.0 1;*表示P0.0 0 1。2 结果与分析2.1 鸡胚尿囊膜肿瘤模型建立2.1.1 鸡胚生长状态监测 鸡胚是指鸡的受精卵从开始孵化到雏鸡的阶段。该阶段正常情况下持续2 02 2天,蛋清和蛋黄为此提供营养物质和功能物质1 6。实验对其孵育过程全程监测。监测结果显示,鸡胚孵育34天开始出现血管,孵育56天血管逐渐生长
25、,如图1所示。鸡胚在孵育初期,自身免疫系统尚未完全建立,孵育第1 1天后才能检测到T细胞和B细胞,至第1 8天免疫系统方初步建立1 1。孵育早期不对异物产生排异反应,有利于移植物的生长,佐证鸡胚尿囊膜可作为移植人类恶性肿瘤的培养载体。因此,本研究将肿瘤细胞异种移植于鸡胚尿囊膜,以期获得一种更加简洁直观的肿瘤移植模型,来破解实体恶性肿瘤的生物学行为特点,构建理想的肿瘤研究模型。图1 孵育不同天数鸡胚血管生成情况F i g.1 A n g i o g e n e s i s o f c h i c k e n e m b r y o s i n c u b a t e d f o r d i f
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- 种植 肿瘤 模型 构建 及其 药物 药效 评价
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