心脏灌流.ppt

离体心脏灌流离体心脏灌流CardiacPerfusioninVitro南京医科大学南京医科大学 生理学系生理学系韩莹韩莹.离体心脏灌流的基本原理离体心脏灌流的基本原理将动物的心脏从体内取出放入特定的生理代用液中，根据不同的实验目的和不同种属动物特点进行恒温、通氧或恒温灌流及建立与动物机体内环境基本相似的人工环境，以保证心脏维持正常活动状态。.离体心脏灌流的意义离体心脏灌流的意义在离体条件下观察并记录心脏的生理活动、病理变化以及各种药物和试剂等施加因素对其生理生化及形态变化的影响。.离体心脏灌流的优点离体心脏灌流的优点1.排除在整体情况下体内各种复杂因素的干扰，直接观测离体心脏标本的各项指标。2.易于严格控制实验环境，方法简便精确，有利于分析作用机制及对药物的药效作定量研究。3.易于获得准确、精细的结果。.缺点和局限性失去了机体完整统一的内环境和神经体液调控作用，失去了体内各种组织、细胞之间的相互关系，不能完全反映心脏在整体情况下的活动规律与正常整体情况。.离体心脏灌流方法离体心脏灌流方法两栖类动物：蟾蜍、青蛙等Straub法、八木法哺乳类动物：大鼠、家兔、猫等Langendroff法.经典的离体蛙心灌流经典的离体蛙心灌流Straub法法灌流途径与正常循环途径不同，蛙心插管通过主动脉瓣直接插入心室腔内，灌流液通过同一蛙心插管进入心室腔和流出，前负荷和后负荷相等。.方方法法1.1.破坏脑脊髓，暴露心脏。破坏脑脊髓，暴露心脏。2.心室插管心室插管3.结扎静脉窦，游离蛙心结扎静脉窦，游离蛙心4.使用张力传感器使用张力传感器.5.5.改变灌流液成分改变灌流液成分 正常的蛙心搏动曲线 用0.65 NaCl替换任氏液 在任氏液中滴加2 CaCl2 1-2滴 在任氏液中滴加1%KCl 1-2滴 在任氏液中滴加1:10000 肾上腺素1-2滴 在任氏液中滴加1:10000 乙酰胆碱1-2滴 不能损伤或结扎静脉窦 插管一定要进入心室腔 出现作用后立即用新鲜任氏液换洗三次，以免心肌受损 蛙心插管内液面应保持恒定，以免影响结果注注 意意.八木法离体蛙心灌流八木法离体蛙心灌流 特点：灌流途径按正常循环途径设计，一根蛙心插管插入左肝静脉并进入静脉窦，另一根蛙心插管仅插入主动脉，并不穿过主动脉瓣进入心室腔内，可以根据实验要求设定不同的前负荷和后负荷。注意事项注意事项 不能损伤或结扎静脉窦；主动脉内的插管不要过深以免抵住主动脉瓣 两根插管有一定相对位置，插管前要考虑好方向，插管后应避免血管扭曲，保证灌流畅通 避免气泡进人心脏。哺乳类动物离体心脏灌流哺乳类动物离体心脏灌流Langendorff法法Langendorff首次描述了保持哺乳动物离体心脏存活的方法，采用恒压或恒流方式，从主动脉根部逆向用含氧灌流液灌流心脏，这种方式的逆向灌注关闭了主动脉瓣，使得灌注液经冠状动脉分布，并流入冠状窦和右心房。离体心脏灌流实验将动物心脏取出，连接到特定的灌流装置，用灌流液灌注，排除了神经和体液的控制，配合特别分析软件记录心室内压、动脉血压和心电信号，自动分析各项生理参数，用于病理生理情况下的心功能与血流动力学改变等研究，在生理、病理生理以及药理学研究中已得到广泛地应用。能够进行精确恒压或恒流灌注。完善的预热系统和充氧通路能够保证恒温环境和灌流液氧饱和状态，从而有效保持离体心脏的生理活性，使实验顺利进行。可测定心输出量、冠脉流量、左室内压、心率、心电及心肌收缩性能等相关指标，观察药物对哺乳类动物离体心脏活动的影响，研究心肌缺血、缺氧病理损伤机制等。哺乳类动物离哺乳类动物离体心脏灌流体心脏灌流Langendorff法法特点特点适用于大鼠、豚鼠以及兔的离体心脏灌流实验;u设计科学，结构简洁，可操作性强;u完善预热系统，可与超级恒温水浴相连，充分保证实验恒温环境;u充氧采用上进气模式，有效避免传统下进气模式因药物沉淀底部所导致的气路阻塞;u提供外径为1.8mm和2.2mm两种规格的主动脉插管;u可通过压力换能器连入生物信号采集系统来观察有关指标的变化。实验方法实验方法1.麻醉、取出心脏：在戊巴比妥钠麻醉和人工呼吸的情况下迅速取出心脏，置于盛满37 氧饱和的Ringers液的盘中，去除粘附的心包和肺组织，确定主动脉的位置，并恰好在其分支下方切断。2.主动脉插管：将一个玻璃或塑料的插管插入主动脉，注意插管不要过深以免损伤主动脉瓣，结扎固定。3.灌流：将心脏转移到一个双层壁的玻璃浴槽（类似于做离体小肠平滑肌灌流用的恒温浴槽或麦氏浴槽）中，浴槽内加入Ringers液或KrebsHenseheit缓冲液，利用恒温水浴使这一装置保持在37。经主动脉插管灌注氧饱和的Ringers液或KrebsHenseheit缓冲液，持续保持适当的灌注压。4.连接记录装置：将一特制的金属小钩固定在心尖部，利用张力传感器与多导记录仪相连并描记心脏收缩曲线和测定收缩力等指标。Langendorff离体心脏灌流装置可用于测定不同种生理学试剂和药物的直接效应，以及对这些药物的拮抗作用。还可观察冠脉流量的变化。取心脏和插管操作需迅速。插管不易过深，以免损伤主动脉瓣。灌流压大小恰当，压力过低则冠状动脉灌流量不足，过高则因主动脉根部过于扩张导致主动脉瓣关闭不全。灌流液温度恒定：37(95%O2+5%CO2饱和)。注意事项注意事项Langendorff法的缺陷与改进法的缺陷与改进由于在实验过程中心室不充盈，心室不按照容量压力曲线作功。后来其实验方法被不断改进，以适应各种不同研究的需要，如在按上述灌流方法进行灌流以保持心脏存活的同时，在用另一根插管插入右心房灌流心脏，则可研究压力容积作功关系。将可充水的小球囊固定在一根导管末端，经肺静脉、左心房和二尖瓣放入左心室。球囊内注水量与左心室容积相等，相当于前负荷大小，可根据实验要求选择预定的前负荷或改变前负荷。心脏收缩舒张过程给球囊一个有节律的压力，传导到压力传感器上。优点：压力变化和前负荷大小可以读出(mmHg)，可记录左心室收缩曲线，并记录心率。Gottlieb等的改进等的改进(1904)在肺静脉或左心房内插入另一根导管，灌流液经此导管进入左心房，并通过二尖瓣进入左心室，左心室收缩时将灌流液通过主动脉泵出，该方法可改变心脏的前后负荷，测定心输出量、压力容积作功关系等。Necly等的改进等的改进(1967)小球囊插入左心室，通过一个插管将球囊内的液体泵人一个体外的闭合循环通路中，并由两个弹性瓣膜控制其单向流动。每次心脏收缩时，由球囊排除的液体量相当于心脏的每搏输出量，可以通过顺序连接的一个流量计探头和一个积分仪进行测量。前负荷和后负荷可以分别调整。经主动脉逆灌进入冠状动脉的灌注液流量也可单独记录下来。Bardenheuer等的改进等的改进(1983)其它改进其它改进将微型压力传感器经肺静脉、左心房和二尖瓣放入左心室腔直接记录和测定左心室内压力变化，如左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）和左心室压力变化速率（LVdP/dP）等；利用放入肺动脉内的导管连接到PMH73酸碱血气检测仪上的电极测定冠状静脉的Po2,并可结合灌流液的Po2和冠状动脉流量计算心肌耗氧量；经过两根固定在心脏表面的电极可记录心外膜心电图；心脏内埋藏电极记录希氏束电图等。Radnoti离体工作心脏灌流系统离体工作心脏灌流系统(WorkingHeartSystem)灌流液从左心耳流入左心室，左心室收缩克服主动脉阻力将心室内液体射入模拟主动脉管道，使心脏在生理状态下进行灌流实验。在此装置中，左心室充盈压（前负荷）及主动脉柱压（后负荷）可以保持恒定，心率亦可通过电起搏装置加以控制。因此，可以根据需要将三者同时进行控制，观察药物对心肌收缩性能的影响，或控制其中两项，观察心肌收缩性与另一项的关系。此外通过测定冠脉流出液中某些物质，可以了解药物或其它因素对心脏生化方面的影响。可进行工作心脏实验，LANGENDORFF恒压，恒流，循环或非循环实验。实验可以是起博或自发心跳状态。配合不同的测量装置可测量：配合不同的测量装置可测量：左室压（LVP)心电温度心肌张力心输出量灌注压冠脉血流新陈代谢离子转基因研究冠状动脉结扎与心肌缺血再灌冠状动脉结扎与心肌缺血再灌Scholz等(1992,1993)在进行心肌缺血再灌实验时，用65mmHg恒定压力灌注离体工作心脏20min(缺血前期)后，夹闭左冠状动脉近端15min，造成急性心肌缺血(缺血期)，再重新开放血管夹再灌注并监测30min(再灌注期)。再灌注期发生室颤。取冠状动脉流出液检测乳酸、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)。实验完成后，可测量心肌组织中的糖原、乳酸、ATP和磷酸肌酐。在缺血前或再灌注前5min通过灌注液给予药物观察其对肌缺血再灌损伤的影响。在间接体内试验中，在准备处死大鼠制备离体心脏前1h经口服给予实验药物观察其对肌缺血再灌损伤的影响。