基于Hippo_TAZ信号通路探讨胃苏颗粒对幽门螺杆菌诱导的慢性萎缩性胃炎的作用.pdf
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1、Journal of Inner Mongolia Medical UniversityJune.2023Vol.45No.3基于Hippo/TAZ信号通路探讨胃苏颗粒对幽门螺杆菌诱导的慢性萎缩性胃炎的作用(1.榆林市中医医院 肝胆病科,陕西榆林719051;2.榆林市中医医院 老年病科,陕西榆林719051;3.榆林市中医医院 脾胃科,陕西榆林719051)【摘要】目的 探讨胃苏颗粒(WSG)对幽门螺杆菌诱导的慢性萎缩性胃炎(CAG)动物模型的影响及其作用机制。方法 将50只SD大鼠按随机数表法分为对照组、模型组和WSG低、中、高剂量组。除对照组外,其余组建立幽门螺杆菌感染的CAG模型。从第
2、8周开始,WSG低、中、高剂量组每日分别灌胃8 mg/kg、16 mg/kg、32 mg/kg的WSG,连续4周。试验结束时,通过HE染色评估胃黏膜损伤的组织病理学改变。采用qPCR和Western Blot分析胃组织中LATS2、TAZ 的mRNA和蛋白表达。用幽门螺杆菌感染GES-1细胞,并用WSG对其进行干预。采用CCK-8试验分析细胞活力,并分析Hippo/TAZ信号通路表达情况。结果 干预4周后,WSG各剂量组胃黏膜损伤明显减轻,胃黏膜糜烂长度明显缩短,UI评分和炎症评分均呈剂量依赖性降低,组间差异有统计学意义(P0.05)。幽门螺杆菌可显著增加TAZ的表达,并降低 LATS2的表达
3、。WSG治疗以剂量依赖的方式逆转了TAZ和 LATS2表达的变化,特别是与CAG组相比,WSG中、高剂量的TAZ和 LATS2蛋白和mRNA表达差异具有统计学意义(P0.05)。与幽门螺杆菌感染组相比,40 mol/L(83.445.46)和20 mol/L WSG组(75.478.31)的GES-1细胞活力显著增加,组间差异有统计学意义(P0.05)。qPCR和免疫荧光染色的结果显示,WSG干预增加了GES-1细胞中LATS2、WWC2表达,但降低了TAZ表达。WWC2 siRNA预处理削弱了WSG诱导的LATS2活化,并促进了TAZ的表达(P0.05)。结论 幽门螺杆菌诱导CAG的形成与H
4、ippo/TAZ信号通路有关,WSG可能通过抑制Hippo/TAZ信号传导发挥了其胃肠道的保护作用。【关键词】胃苏颗粒;Hippo/TAZ信号通路;幽门螺杆菌;慢性萎缩性胃炎中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:2095-512X(2023)03-0292-05惠桃1,柏江锋2,杭亮3*慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃癌的早期阶段之一。先前的研究表明1,CAG的发病机制与氧化应激、炎症、内皮和黏膜功能障碍有关。然而,其确切机制仍不清楚。幽门螺杆菌是在胃内定植并占据人体胃微生物群的优势菌种,导致多种胃肠道疾病,包括CAG、胃和十二指肠溃疡以
5、及胃癌等2。幽门螺杆菌感染时,组织内稳态调节Hippo信号通路被激活3。Hippo信号是一种进化保守的途径,它控制器官大小、细胞增殖、干细胞自我更新和组织再生4。转录共激活因子PDZ结合基 序(transcriptional coactivator with PDZ-bindingmotif,TAZ)是重要的受Hippo信号通路负调控的转录共激活因子,可诱导促生长基因的表达,从而促进损伤后器官再生5。因此,对TAZ的控制激活可用于再生医学。然而,由于 Hippo 通路的失调或TAZ的过度表达而导致TAZ的异常激活可以促进CAG的发展6。因此,药物抑制Hippo/TAZ信号通路可能是治疗 CAG
6、 的有效途径。胃苏颗粒(weisugranule,WSG)是临床治疗CAG的常用方剂之一,其能有效缓解临床症状,提高患者生活质量,但具体作用机制尚不清楚7。本研究拟观察WSG对幽门螺杆菌诱导的CAG动物模型的影响,并探讨其作用机制是否与Hippo/TAZ途径相关。现报道如下。1材料与方法1.1WSG制备WSG 由以下 8 种生药组成:紫苏梗、香附、陈皮、香橼、佛手、枳壳、槟榔、鸡内金,由扬子江制药股份有限公司生产(批号:20190406)。按人和大鼠间体表面积折算的等效剂量,WSG的给药剂量分为三组,分别为1.65 g/kgd(低剂量)、3.30 g/kgd(中收稿日期:2022-11-27;
7、修回日期:2023-03-04基金项目:陕西省自然科学基金研究计划项目(20200662)第一作者:惠桃(1982),女,本科,副主任医师。研究方向:消化病的中西医治疗及预防。E-mail:*通信作者:杭亮,男,副主任医师。研究方向:脾胃病的中西医治疗。E-mail: 292内蒙古医科大学学报2023 年 6 月第 45 卷第 3 期剂量)和6.60 g/kg d(高剂量)。1.2实验动物、模型建立与治疗方法无特异性病原体(SPF)雄性Sprague-Dawley大鼠(18020)g购自北京斯贝福生物技术有限公司(许可证号:SCXK-(京)2016-0002)。大鼠在SPF条件下温度:(250
8、.5),湿度:(555)%,明暗循环:12 h饲养,并提供无菌食物和水。参照文献方法建立幽门螺杆菌感染的大鼠CAG模型8。幽门螺杆菌(Hp菌株SS1,购自中国疾病预防疾控中心)生长在弯曲杆菌琼脂基(英国Oxoid公司)含有1%幽门螺杆菌选择性添加剂(英国Oxoid公司)和3%胎牛血清,在37 微需氧条件下(10%CO2、5%O2、85%N2)培养。培养4 d后,收集活菌并调整至108个菌落形成单位CFU/mL,在第1 d、3 d、5 d和7 d分别口服1.5108CFU/mL幽门螺杆菌。感染后8周,对胃组织进行组织学和组织培养计数幽门螺杆菌。证实了大鼠慢性萎缩性胃炎的感染状况和幽门螺杆菌诱导的
9、慢性萎缩性胃炎。随后将50只大鼠按随机数表法分为5组,分别为对照组、模型组(CAG)及低剂量组(WSG-L)、中剂量组(WSG-M)和高剂量组(WSG-H)。除对照组外,其余组建立CAG模型。各组大鼠均于上午8:00-10:00灌胃给予相应的药物,1次/d,最长4周。模型组和对照组给予等量生理盐水。4周后处死所有大鼠,分离胃黏膜标本,沿大曲度切成两半,用生理盐水冲洗。收集每只大鼠的血清和胃组织样本,并在-80 下保存,以检测mRNA、蛋白质的表达和组织学变化。1.3胃黏膜解剖及组织病理学分析取大鼠胃,用生理盐水清洗,并用游标卡尺测量胃黏膜区的长度和宽度。胃黏膜溃疡指数(UI)按Guth标准进行
10、:点蚀(1分)、糜烂长度3mm(5分);糜烂宽度1 mm,得分翻倍。将胃组织标本用10%中性福尔马林缓冲液固定至少24 h,二甲苯清除,石蜡包埋,切5 m厚切片。将切片用苏木精-伊红(HE)染色。用光镜摄影观察胃黏膜损伤的组织病理学改变。按既定标准评价胃炎程度:正常胃黏膜(1分),黏膜上皮细胞损伤(2分),腺体细胞损伤(3分),淋巴细胞浸润、水肿、充血(4分),对每个切片计算累积评分。1.4Western Blot分析用RIPA裂解缓冲液从胃组织或细胞中提取总蛋白,然后将蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上,电泳转移到PVDF膜上。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h后,与一抗LATS2(美国Abcam
11、公司,1 500)、TAZ(美国Abcam公司,1 500)或-actin(美国Cell Signaling公司,1 2000)在4 下孵育过夜。然后,将膜与结合HRP的二抗(1 5000)在室温下孵育1 h。使用Be-yoECL Plus(上海碧云天生物技术有限公司)可视化蛋白质条带。靶蛋白水平标准化为内源性-actin。1.5细胞培养与刺激人胃上皮细胞系(GES-1)购自购自美国ATCC公司。将细胞常规接种在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中,并在37、5%CO2的湿润环境下培养。当GES-1达到至少80%的融合率时,用幽门螺杆菌感染复数(MOI)为 10 1、20 1、5
12、0 1或100 1或WSG(10、20、40、80、160 M)处理细胞24 h后,收集细胞进行存活率检测分析。细胞实验分为两部分,第一部分考察WSG对幽门螺杆菌处理的细胞保护作用,将GES-1细胞分为:对照组、幽门螺杆菌组和幽门螺杆菌+WSG组。幽门螺杆菌组和幽门螺杆菌+WSG组中GES-1细胞与幽门螺杆菌(感染倍数为 50 1)黏附 24 h,随后向幽门螺杆菌+WSG组中加入WSG(40 M)处理24 h。对照组和幽门螺杆菌组则加入等量空白介质处理24 h。第二部分考察WSG是否通过WWC2依赖的机制调节LATS2,将GES-1细胞分为:si-NC组、si-NC+WSG组、si-WWC2组
13、和si-WWC2+WSG组。各组GES-1细胞与幽门螺杆菌(感染倍数为50 1)黏附24 h前,先用 si-NC 或 si-WWC2 转染细胞 24 h。si-NC+WSG组和si-WWC2+WSG组细胞用幽门螺杆菌处理后,加入WSG(40 M)处理24 h。1.6CCK-8试验采用细胞计数试剂盒8(CCK-8;日本DOJINDO公司)测定用幽门螺杆菌或WSG处理后GES-1的存活率。向每个孔中加入 10 L CCK-8 溶液,并在37 下孵育 2 h,然后使用 ELX800 光吸收酶标仪(美国Bio-Tek公司)在450 nm处测量吸光度。1.7免疫荧光分析将“1.5”项下第二部分处理后的细
14、胞用抗LATS2、TAZ和WWC-2(1 200稀释度)在4 下孵育过夜,然后用FITC标记的羊抗兔IgG(1 32稀释;武汉Boster公司)在室温下孵育1 h。细胞核用DAPI(美国Sigma公司)染色。用荧光显微镜(日本Nikon公司)采集图像。1.8实时荧光定量PCR采用TRIzol试剂(北京北欧生物科学公司)提取所有大鼠胃组织和GES-1细胞的总mRNA,并用 293Journal of Inner Mongolia Medical UniversityJune.2023Vol.45No.3反转录试剂盒转化为 cDNA(美国 Promega 公司)。采用SYBR-Green-PCR-
15、Master Mix(北京北欧生物科学公司)进行qPCR检测。扩增程序包括加热至95 10 min,然后是95 15 s和60 60 s的40个循环。以-actin为内源性参照物,并基于2-Ct计算确定mRNA的相对量。引物购自上海捷瑞生物工程有限公司。用于qPCR的引物序列如下:LATS1正向:5-CAGGATGCGACCAGGAGATG-3,反向:5-CCGCACAATCTGCTCATTC-3;TAZ 正 向:5-CACAGCATGTTCGAGCTCAT-3,反 向:5-GAT-GCTGAGCTGTGGGTGTA-3;WWC2 正向:5-TC-GTCATCCAGTTTGGTGTC-3,反向
16、:5-ACAACTC-GTCATCGTCGAAA-3;-actin 正向:5-ACAAC-TACTCCTCTACCTCCA-3,反向:5-GTTGATCTC-GTAGTTGAGGCA-3。1.9细胞转染在24孔板中培养的GES-1细胞达到80%汇合时,用对照 RNA(si-NC,序列:5-UAGCUUAUAU-CAGAGGUUGA-3)或 WWC2 siRNA(si-WWC2,序列:5-UGUGGAUGAGAUGGAUAGA-3)转 染 细胞。转染24 h后,将细胞与幽门螺杆菌(感染倍数为50 1)黏附24 h,加入40 M WSG处理24 h,检测细胞生物学功能和基因水平。si-NC 和si
17、-WWC2由上海GenePharma公司设计和合成。1.10数据处理所有结果均以平均值标准差(xs)表示,并用SPSS 19.0统计学软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni法,检验水准为0.05,P 0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1WSG对幽门螺杆菌诱导的CAG的减轻作用研究采用幽门螺杆菌感染大鼠探讨 WSG 在CAG中的作用。从感染后第1周开始,CAG组大鼠食欲下降,体质量缓慢增加(见图1A)。感染8周后,胃黏膜的大体解剖结构分析显示,与对照组大鼠相比,模型组大鼠胃黏膜出现糜烂、溃疡、出血等现象(见图1B);HE染色显示固有层变薄,腺体数目减少,细胞排列不规
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