人类染色体标本制备及核型分析.ppt
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1、人类染色体标本制备人类染色体标本制备及核型分析及核型分析实验三实验三2021/5/2711、掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备、掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备 方法;方法;2、掌握胰酶法、掌握胰酶法G显带的技术;显带的技术;3、掌握、掌握G显带核型分析的基本过程和技术;显带核型分析的基本过程和技术;4、熟悉快速线条图的绘制;、熟悉快速线条图的绘制;5、了解染色体自动分析系统的原理和使用方法。、了解染色体自动分析系统的原理和使用方法。一、目的与要求一、目的与要求 2021/5/272二、基本原理二、基本原理(一)染色体标本制备(一)染色体标本制备 外外周周血血中中的的淋淋巴巴细细胞胞几几
2、乎乎都都是是处处在在G G0 0期期或或G G1 1期期,一一般般情情况况下是不分裂的。下是不分裂的。当当在在培培养养基基中中加加入入植植物物血血凝凝素素(phytohemagglutinin,phytohemagglutinin,PHAPHA)时时,这这种种小小淋淋巴巴细细胞胞受受到到刺刺激激后后转转化化为为淋淋巴巴母母细细胞胞,并开始进行有丝分裂。并开始进行有丝分裂。经经过过短短期期培培养养后后,用用秋秋水水仙仙素素处处理理、低低渗渗、固固定定、滴滴片片和和染染色色,就就可可获获得得大大量量中中期期分分裂裂相相的的细细胞胞,制制片片后后可可以以清楚地对染色体进行观察。清楚地对染色体进行观察
3、。2021/5/273n染色体标本制作技术有下述四大发现:染色体标本制作技术有下述四大发现:一、美籍华人徐道觉一、美籍华人徐道觉(1952)从助手工作中的失误发从助手工作中的失误发现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开;现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开;二、二、Tjio(1956)发现秋水仙素可使分裂的细胞停止发现秋水仙素可使分裂的细胞停止在中期;在中期;三、三、LiJG发现发现PHA(phytohemagglutin)(植物植物血球凝集素血球凝集素)可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞,呈可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞,呈分裂状态;分裂状态;四、标本的空气干燥法使细胞和染色体展平。四、标
4、本的空气干燥法使细胞和染色体展平。2021/5/274n这种培养方法是这种培养方法是MoorheadMoorhead于于19601960年建立的。年建立的。n在在人人类类遗遗传传分分析析中中普普遍遍采采用用外外周周血血培培养养的的方方法法获获取取分分裂裂的的细细胞胞,进进而而开开展展临临床床和和基基础础遗遗传传学学的研究。的研究。n这这对对于于遗遗传传疾疾病病的的检检出出以以及及遗遗传传咨咨询询等等工工作作发发挥了重要作用。挥了重要作用。2021/5/275(二)染色体显带(二)染色体显带人们将用各种不同的方法,以及用不同的染人们将用各种不同的方法,以及用不同的染料处理染色体标本后,使每条染色
5、体上出现明暗料处理染色体标本后,使每条染色体上出现明暗相间,或深浅不同带纹的技术称为相间,或深浅不同带纹的技术称为显带技术显带技术(banding technique)。)。2021/5/276研究发现,人染色体标本经胰蛋白酶、研究发现,人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后,再、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后,再用用Giemsa染色,可使每条染色体上显示出染色,可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹,这就是染色体的深浅交替的横纹,这就是染色体的G带。每带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征,所条染色体都有其较为恒定的带纹特征,所以以G显带后,可以较为准确的识别每条染色显带后,
6、可以较为准确的识别每条染色体,并可发现染色体上较细微的结构畸变。体,并可发现染色体上较细微的结构畸变。2021/5/277关于G显带的机理目前有多种说法,较常见的有1、Lee等(等(1973)认为染色体上与)认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉,染结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉,染色后这些区段成为浅带,而那些组蛋白和色后这些区段成为浅带,而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。结合牢固的区段可被染成深带。2021/5/2782、有人认为,染色体显带现象是染色、有人认为,染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观
7、察未染色的染色体时,就能直接观察镜观察未染色的染色体时,就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后,再用染到带的存在。用特殊方法处理后,再用染料染色,则带更加清楚,随显带方法不同,料染色,则带更加清楚,随显带方法不同,显出来的带特点也不一样,说明带的出现显出来的带特点也不一样,说明带的出现又与染料特异结合有关。又与染料特异结合有关。2021/5/279一般认为,易着色的阳性带为含有一般认为,易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段,相反,含多的染色体节段,相反,含GC多多的染色体段则不易着色。总的来说,的染色体段则不易着色。总的来说,G显带的机理还未搞清。显带的机理还未搞清。2021/5/2710
8、三、内容与操作一、染色体一、染色体G显带标本的制备显带标本的制备 1.采血:采血过程中严格执行无菌操作。采血:采血过程中严格执行无菌操作。2接种:超净工作台内接种:超净工作台内 0.30.5ml 轻轻水平摇动混匀。轻轻水平摇动混匀。培养:培养:5%CO2,375恒温箱培养恒温箱培养64-65小小时;卡介苗注射器时;卡介苗注射器(5号针头号针头)向培养瓶中加入向培养瓶中加入20g/ml秋水仙素(秋水仙素(0.01%)一滴,轻轻摇匀,放)一滴,轻轻摇匀,放回温箱继续培养至回温箱继续培养至68小时。小时。2021/5/2711n4、离心:、离心:10分钟(分钟(1500转分),弃上清液,留转分),弃
9、上清液,留下沉淀物。下沉淀物。n5、低渗:、低渗:68m1预温预温37的的0.075M KCl溶液,溶液,沉淀细胞沉淀细胞重重重重冲散,冲散,37水浴箱水浴箱30-35分钟。分钟。n6、预固定:、预固定:1ml新配制的固定剂,新配制的固定剂,轻轻轻轻冲打,冲打,37水浴箱中静置水浴箱中静置5分钟。分钟。n7、离心:、离心:1500转分离心转分离心10分钟,弃上清液。分钟,弃上清液。n6第一次固定:固定液第一次固定:固定液68m1,沉淀物,沉淀物轻轻轻轻冲打冲打均匀,均匀,37水浴箱中静置固定水浴箱中静置固定10分钟。分钟。n7、第一次离心、第一次离心10分钟分钟(1500转分转分),弃上清液。
10、,弃上清液。n8、重复第重复第6、7步。步。2021/5/2712n9、制片:留固定液制片:留固定液0.2ml0.4ml,轻轻轻轻冲冲打制成细胞悬液。冰冻载波片,滴管口距打制成细胞悬液。冰冻载波片,滴管口距离载玻片离载玻片1015cm,每片,每片23滴。滴。n10、烤片:、烤片:75烤箱烤烤箱烤3小时。自然冷却。小时。自然冷却。2021/5/2713n11、胰酶预温:立式染色缸中磷酸缓冲液、胰酶预温:立式染色缸中磷酸缓冲液100ml(115M NaH2PO4 80.8 ml,KH2PO4 19.2ml),2.5的胰蛋白酶原液的胰蛋白酶原液1ml配成配成0.025的工作液。的工作液。37的恒温水
11、浴箱内预温。的恒温水浴箱内预温。n12、显带:不断轻轻摆动,使胰酶作用均匀,处、显带:不断轻轻摆动,使胰酶作用均匀,处理时间理时间2590秒钟左右(较陈旧标本时间适当延秒钟左右(较陈旧标本时间适当延长,随着处理标本数量增加,胰酶逐渐消耗,胰长,随着处理标本数量增加,胰酶逐渐消耗,胰酶作用时间逐渐延长,精确的时间自行摸索)。酶作用时间逐渐延长,精确的时间自行摸索)。取出标本片,立即用取出标本片,立即用37预温的生理盐水轻轻漂预温的生理盐水轻轻漂洗两次,去除片子上的胰酶溶液。洗两次,去除片子上的胰酶溶液。2021/5/2714n13、染色:、染色:37预温的预温的Giemsa工作液染色工作液染色1
12、2分钟,自来水冲洗,气干。分钟,自来水冲洗,气干。n14、镜检:低倍镜下选择分散良好的长度适、镜检:低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察,若染色体未出现中的分裂相转换油镜观察,若染色体未出现带纹,则为显带不足;若染色体边缘发毛为带纹,则为显带不足;若染色体边缘发毛为显带过头,此时应根据具体情况增减胰蛋白显带过头,此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。酶处理时间重新处理一张标本。2021/5/2715注意事项n玻片完全干后,才可置油镜下进行观察。n每次显带均应做予实验处理,以决定正确的显带时间,不可盲目处理所有玻片。n显带效果的判断,应多观察几个长度适中的分裂相,
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