分子生物学实验常用工具酶总结.doc

现代分子生物学实验手册工具酶 基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。 核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。一、 限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。 （这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。 保护自身遗传物质稳定的机制。限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5端为P，3端为-OH。命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称ArthrobacterluteusAlu IEscherichiacoliRY13EcoR IBacillusamyloliquefaciensHHamH IHaemophilusinfluenzaeRdHind III （一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶 同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。 在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。 （实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四种功能） I型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。没有时间应用价值。【DNA甲基化：DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现（外遗传机制）。 多发生于CpG二核苷序列上（在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶）。 甲基化位点可随DNA的复制而遗传（DNA复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。】2. III型限制性内切酶具有内切酶和甲基化修饰酶作用。具有专一的识别顺序，其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定位置上。（可识别短的不对称序列，切割位点与识别序列约距2426bp）3. II型限制性内切酶 也具有限制-修饰系统，但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这一系统的功能。即II型限制性内切酶有在识别位点的切割功能，而不具备甲基化修饰活性，修饰作用由相应的修饰酶完成。 两种酶识别同一DNA特定序列，却发挥不同作用。 能识别双链DNA的特异顺序，并在该顺序内的固定位置上进行切割，产生特异的DNA片段。 II型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的，对相同的基因片段的切割，总是得到同样核苷酸顺序的小DNA片段。这些切割后的不同大小的DNA片段，可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他DNA片段实行连接，而构建重组DNA。基因工程技术的核心 II型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序，最常见的是46个碱基对。 II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序（反转重复顺序），具有180的旋转对称性。识别顺序有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方面读序都是相同的。这类酶切割DNA可有两种形式。交错切割方式： 每种酶切割后个产生两个DNA片段，每一个片段个含有一个单链末端，单链末端是互补的，可以通过形成“氢键”而黏合。不同来源的两条DNA片段经同一种酶切割后，产生互补的黏性末端，通过选择合适的DNA链接，可将两条异源性DNA片段组合在一起。 重组DNA的最基本原理用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的DNA片段，可使重组后的DNA片段不再被原来的酶所切割。如：Sal I酶切割后产生的黏性末端，Xho I酶切割后产生的黏性末端，两者经连接酶连接产生的序列，既不被Sal I酶切割，也不被Xho I酶切割。在同一位置上切割DNA双链，产生平头末端。如： （二）其他类型内切酶1. 同工酶（Boschizomer）：来源不同的两种II型内切酶，它们识别核苷酸顺序及切割位点都相同，差别只在于当识别核苷酸序列中有甲基化的核苷酸时，一种内切酶可以切割，而另一种不能。如：Hpa II和Msp I 识别顺序都是5CCGG3，若其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Msp酶可切割（GGmCC）。2. Subset酶： 识别顺序及切割位点相互有关的酶，互称Subset酶。如：Sam I酶所识别的6个核苷酸顺序中含有Hpa II酶识别的4个核苷酸顺序。所以这两个酶可以相互代替使用，它们所切割的DNA片段可以相互连接。3. 可变酶（特殊的）：识别核苷酸顺序一般都大于6个，但其中一个或几个核苷酸时可以变化的。4. 远距离切割酶：识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致，一般切割位点与指标核苷酸顺序的位置之间有10个左右核苷酸的距离。 与I型内切酶相似，不过I型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。 （三）甲基化酶（不属于内切酶） 使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。M5C（5-甲基胞嘧啶）大多数以M5CpG的形式存在，即CpG岛中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。因此，研究CpG岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时，常常可以使有多个识别位点的内切酶只对其中一个识别位点有切割效果，其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。如：限制性内切酶Ava的识别顺序是 Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶Taq和甲基化酶Hpa，则Ava的识别顺序将只是5CCCGAG3。 如上图，一个基因片段被Ava I酶切割时，片段中有三个Ava I酶识别顺序，该片段被切割成4个片段。 但若先用Taq I甲基化酶和Hpa II甲基化酶作用该片段时，片段中某些核苷酸发生甲基化修饰而不能被切割，再用Ava I酶切割时，只能被切割成两个片段。【一甲基化酶对DNA的某位点进行甲基化修饰，进而抵御内切酶的切割构建重组质粒】（四） 与 内切酶相关的几个概念 1.酶活性单位及标准反应体系 酶活性单位：在一定温度、PH及离子强度下，1h内完全酶解（切割）特定底物DNA，所需限制内切酶的量。 （底物DNA：多用噬菌体DNA。又是可以用某一种酶在噬菌体DNA上的切割位点，来推算用这种酶切割这种DNA时所需的活性单位。）标准反应体系：在50l反应体系及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用1个活性单位的限制内切酶，酶解1g底物DNA反应1个小时。 （若底物比1g多或少，可参照标准体系比例增加或减少酶用量。但增加酶用量时，需注意不可加量过多内切酶中通常含有甘油防冻剂，加入酶量过多，其中的甘油会降低内切酶识别顺序的特异性。 也可通过延长反应时间来保证完全的酶切。）2.星号活力限制性内切酶在非标准反应条件下，切割一些与特异性识别顺序相类似的顺序活性（该酶的第二活性）。 （产生许多不想得到的片段；内切酶的识别切割能力下降，识别特异性下降。）引起星号活力的因素：过高的甘油含量（5%）；低盐离子强度（25mmol/L）；高PH值（8.0）；含有有机溶剂；含有非Mg二价离子；酶量过大（酶解1g底物DNA用的内切酶大于100个活性单位）。3. 限制性内切酶底物位点优势效应限制性内切酶对同一DNA片段切割时，在对其可以识别的位点上表现出不同的切割速率的现象。4. 限制性内切酶质量有良好的酶活性；不存在任何其他核酸内切酶和外切酶的污染；长时间的酶切反应不发生识别顺序特异性的降低；被某一酶切割后的DNA经重新连接后，仍能被同一酶再次识别并再次切割。内切酶质量的鉴定：50l反应体系中以等量内切酶分别以1h和12h（过夜）时间来切割底物DNA，用凝胶电泳检查酶切结果。若不出现条带数目的差别，则内切酶质量好。在T4DNA连接酶作用下，重新连接被内切酶切割后的DNA片段，再用同一酶切割，若所产生的DNA片段的大小和数目和第一次切割的结果完全一样，则说明酶的质量好。 可鉴定是否混有其他内切酶和磷酸脂酶（DNA被内切酶切割后，只有各个片段的3OH和5P基团完好才能再次连接，连接的DNA仍能提供同一酶的相同切割位点，才会出现上面所说的两个完全相同的结果。）二、 DNA重组常用的其他酶类（一） DNA聚合酶（DNA polymerase） 将一个脱氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的3-OH上，再释放出一个焦磷酸分子（ppi）。1.大肠杆菌DNA聚合酶（E coli DNApolymerase） 聚合酶I、II、III聚合酶I、II主要参与DNA修复，III主要参与DNA复制。三种都有沿模板按53方向合成互补DNA链的活性和按35向的外切酶活性。聚合酶I还有53向的外切酶活性。53聚合酶活性：填补DNA链上的缺口，或参与修复DNA合成过程中切除RNA引物后留下的空缺部分。35外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。 53外切酶活性：切除受损的DNA部分 Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（109000Da）经舒替兰酶（枯草杆菌蛋白酶）水解获得的76000Da片段。具有53聚合酶活性和35外切酶活性。可用于填补DNA单链末端成为双链。 可用于合成cDNA第二链。 当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli聚合酶I就可以将核苷酸连接到切口的3-OH末端。同时该酶具有53的核酸外切酶活性，能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，从而使切口沿DNA链向3端移动。【切口平移：切口产生3羟基和5磷酸基团，DNA延伸合成3端，5端被小片段降解，缺口位点沿着双链向3端移动，是在体外向DNA分子引入放射性标记核苷酸的技术。】2. 噬菌体DNA聚合酶T4 DNA聚合酶，也具有53聚合酶活性和外切酶活性。外切酶活性比大肠杆菌DNA聚合酶外切酶活性强200倍。 可用于探针的放射性核素标记。3. 噬热水生菌DNA聚合酶从噬热水生菌Themus aquaticus YT-1菌株中分离得到。 耐热其中Taq DNA聚合酶使用最多。 7075生物活性最高。在7580条件下，每个酶蛋白分子每秒可以延长150个核苷酸被广泛应用于体外扩增特异性DNA片段的技术（聚合酶链式反应，PCR）（二） RNA聚合酶能利用DNA作为模板，催化四种核糖核苷三磷酸（NTP）底物合成RNA。 I:核仁中，转录rRNA顺序RNA聚合酶 II：细胞质中，转录大多数基因（蛋白质基因和部分核内小RNA基 因），转录是需要“TATA”框（酶开始结合的位置，启动子， II型转录单位特有的）。 III：细胞核质中，转录tRNA、5SrRNA基因等少数几个基因。 （核质：由单一密闭环状DNA分子反复回旋卷曲盘绕组成的松散 网状结构。 无核膜、核仁）（三） DNA连接酶 基因工程比用的工具酶 T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） Mg2+依赖性酶 催化双链DNA上具有相邻的3羟基和5磷酸末端单链缺口的修复，以及具有黏性末端或平端的DNA片段的端端连接的酶。DNA连接既可发生在DNA分子之间，也可发生在分子内部。 高浓度的DNA末端有利于分子间连接，低浓度则有利于环状DNA分子的形成。DNA连接酶只能连接双链DNA而不能连接单链DNA。（四） 反转录酶（逆转录酶，reverse transcriptase）以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。以RNA为模板时，在反转录酶作用下，先合成单链DNA（ss DNA）。再在反转录酶和DNA聚合酶I作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA（ds DNA）。最后在核酸酶S1作用下，切割成两条单链DNA。需要Mg2+、Mn2+作为辅助因子。反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的DNA。 可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。（五） 核糖核苷酸A（RNase A，ribnuclease A）核酸内切酶。 特异的攻击RNA上嘧啶残基的3端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，产生3-磷酸嘧啶核苷酸和以3-磷酸嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸（一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称。 寡核苷酸可以很容易地与它们的互补对链接，所以常用作探针确定DNA或RNA的结构）。高浓度时，可对单链RNA的任何位点进行切割；低浓度时，只切割C和U的位点。检测寡核苷酸片段中是否含有C和U。有显著的细胞毒性。RNase A可用于检测基因突变：利用RNA探针与突变基因形成RNA-DNA杂交体时，突变点处不能产生碱基互补（局部单链）这一特点，用RNase A进行切割，切割产物可通过跑变性胶得到分离，可用放射自显影等其他方法检查片段数目及大小，从而推知发生突变的位点。 RNA探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到。在操作RNA的实验时一定要戴口罩和手套（RNase A存在非常广泛，人唾液、汗液中均含有），以避免有RNase的污染，所用的容器及蒸馏水也都必须经去RNase处理。【用DEPC处理：0.1100比例加DEPC，37 12h，高温5min除去DEPC残留。含Tris的溶液不能用0.1%DEPC处理（DEPC会和Tris的氨基反应而降解，失去灭活RNase的能力），通常可改用DEPC处理过的水来配DEPC，已配好的可用1%DEPC处理（不过会有DEPC残留）。】（六） 核糖核酸酶T1 （RNase T1）核酸内切酶。特异地攻击鸟苷酸3侧的磷酸基团，切割与其相邻核苷酸的5-磷酯键，产生3-磷酸鸟苷和以3-磷酸鸟嘌呤核苷酸结尾的寡核苷酸。主要用于RNA测序和指纹图谱分析/也可和RNase合用，以除去样品中RNA；除去DNA-RNA杂交体中杂交体的RNA区。（七） 核糖核酸酶H（RNase H）核酸内切酶。 水解RNA-DNA杂交体中的RNA链，产生5-磷酸寡核苷酸和5-磷酸核糖核苷。 使RNA被切割后成为DNA聚合酶合成第二条cDNA的引物，形成cDNA。（八） 脱氧核糖核酸酶I（DNase I，deoxyribonuclease I）核酸内切酶。 Mg2+条件下，随机切割单、双链DNA，产生5磷酸末端的单脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸。Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，是DNA片段化。其活性依赖于Ca2+（辅因子），活化剂：Mg2+，抑制剂：螯合剂（EDTA等）DNase污染：用具要高温处理，样品中加EDTA，抑制酶活性；或冰水中灭活。、用途：除去RNA样品中污染的基因组DNA；转录反应后DNA模板的降解。（九） 核酸酶S1（nuclease S1）内切酶（高度单链特异）。酶解单链DNA、单链RNA，产生5-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。需要低水平的Zn2+激活，PH4.04.3，抑制剂：螯合剂（EDTA、柠檬酸等）、磷酸缓冲液、和0.6%左右的SDS溶液。S1核酸酶的水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单恋部分切断核酸分子，且这种单链区可以小刀只有一个碱基对的程度。去除DNA片段中突出的单链末端；切开合成ds DNA时形成的“发夹”结构。（十） 核酸酶Bal 31水解超螺旋DNA成开环状，进而成为线状DNA。有外切酶活性，在Mg2+、Ca2+参与下，能从DNA双链两端连续向中间切割水解。可用于DNA链的限制性内切酶切割位点分析（绘制DNA限制图谱）；缩短DNA片段。（十一） 核酸外切酶（exonuclease）是具有从DNA分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶。两种：水解磷酸二酯键的5端生成3-单核苷酸的酶；水解磷酸二酯键的3端生成5-单核苷酸的酶（大肠杆菌核酸外切酶I、II和III）。核酸外切酶III：从双链DNA3OH逐一降解切除5单核苷酸。不降解单链DNA或3突出的双链DNA。具有多种酶活性：对无嘌呤DNA特异的核酸内切酶活性、3磷酸酶活性、3外切酶活性、RNase H活性。核酸外切酶III与核酸酶S1合用可使克隆的DNA分子产生缺失（delection，DNA链上一个或一段核苷酸的消失）。 【核酸外切酶III与底物的每次结合，只切除最末的几个核苷酸，从而使双链DNA产生渐进缺失。最适底物：平末端或3凹陷末端DNA。 3突出末端抵抗该酶的切割，抗拒程度岁3突出末端的长度而改变（4碱基完全不能被切割）。 对于一端是抗性位点（3突出端），一端是敏感位点（5突出端或平末端）的线性DNA分子，可以产生单向缺失。Eg：将双链DNA用产生不同末端的限制性内切酶双酶切后，利用Exo III的35的外切酶活性，从一端降解，得到互补的单链DNA和5-单核苷酸。 与Bal 31Nuclease相比，碱基特异性小，如在富含GC的位置上，由于反应停止的机率较低，可用于DNA的Delection制作。】（十二） 多核苷酸激酶（polynucleotide kinase） 催化磷酸基从ATP转移到DNA、RNA、寡核苷酸等分子的5-羟基末端。用途：对缺乏5-磷酸的DNA或合成接头磷酸化； 对5OH末端进行同位素标记。标记底物为r32P-ATP。 一般天然存在的核酸不存有5-羟基而有5-磷酰基，标记时，应先用碱性磷酸酯酶将5-磷酰基除去（脱磷）。（十三） 碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase）除去DNA、RNA的5-磷酰基，防止片段间彼此连接（自身环化）。标记（5）前除去DNA或RNA的5-磷酰基。（十四） 末端转移酶（TdT，terminal deoxynucleotide transferase）一种不需要引物就能将脱氧核苷三磷酸（dNTP）加到某DNA片段上3-OH上的酶。可进行DNA3末端加尾和标记。 3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。B比率分析法和比较分析法不能测算出各因素的影响程度。C采用约当产量比例法，分配原材料费用与分配加工费用所用的完工率都是一致的。C采用直接分配法分配辅助生产费用时，应考虑各辅助生产车间之间相互提供产品或劳务的情况。错 C产品的实际生产成本包括废品损失和停工损失。C成本报表是对外报告的会计报表。C成本分析的首要程序是发现问题、分析原因。C成本会计的对象是指成本核算。C成本计算的辅助方法一般应与基本方法结合使用而不单独使用。C成本计算方法中的最基本的方法是分步法。XD当车间生产多种产品时，“废品损失”、“停工损失”的借方余额，月末均直接记入该产品的产品成本 中。D定额法是为了简化成本计算而采用的一种成本计算方法。F“废品损失”账户月末没有余额。F废品损失是指在生产过程中发现和入库后发现的不可修复废品的生产成本和可修复废品的修复费用。F分步法的一个重要特点是各步骤之间要进行成本结转。()G各月末在产品数量变化不大的产品，可不计算月末在产品成本。错G工资费用就是成本项目。()G归集在基本生产车间的制造费用最后均应分配计入产品成本中。对J计算计时工资费用，应以考勤记录中的工作时间记录为依据。()J简化的分批法就是不计算在产品成本的分批法。()J简化分批法是不分批计算在产品成本的方法。对 J加班加点工资既可能是直接计人费用，又可能是间接计人费用。J接生产工艺过程的特点，工业企业的生产可分为大量生产、成批生产和单件生产三种，XK可修复废品是指技术上可以修复使用的废品。错K可修复废品是指经过修理可以使用，而不管修复费用在经济上是否合算的废品。P品种法只适用于大量大批的单步骤生产的企业。Q企业的制造费用一定要通过“制造费用”科目核算。Q企业职工的医药费、医务部门、职工浴室等部门职工的工资，均应通过“应付工资”科目核算。 S生产车间耗用的材料，全部计入“直接材料”成本项目。 S适应生产特点和管理要求，采用适当的成本计算方法，是成本核算的基础工作。()W完工产品费用等于月初在产品费用加本月生产费用减月末在产品费用。对Y“预提费用”可能出现借方余额，其性质属于资产，实际上是待摊费用。对 Y引起资产和负债同时减少的支出是费用性支出。XY以应付票据去偿付购买材料的费用，是成本性支出。XY原材料分工序一次投入与原材料在每道工序陆续投入，其完工率的计算方法是完全一致的。Y运用连环替代法进行分析，即使随意改变各构成因素的替换顺序，各因素的影响结果加总后仍等于指标的总差异，因此更换各因索替换顺序，不会影响分析的结果。()Z在产品品种规格繁多的情况下，应该采用分类法计算产品成本。对Z直接生产费用就是直接计人费用。XZ逐步结转分步法也称为计列半成品分步法。A按年度计划分配率分配制造费用，“制造费用”账户月末(可能有月末余额/可能有借方余额/可能有贷方余额/可能无月末余额)。A按年度计划分配率分配制造费用的方法适用于(季节性生产企业)