现代分子诊断技术.ppt
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1、 利用核酸双链的利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性和复性的原理,原理,可以可以用已知碱基序列的单链核酸片段用已知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针,与待,与待测样本中的单链核酸互补配对,以判断有无互补的同测样本中的单链核酸互补配对,以判断有无互补的同源核酸序列的存在源核酸序列的存在 核酸探针核酸探针 是指带有标记的某一特定是指带有标记的某一特定DNA或或RNA片断,能与片断,能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合,进而检测同待测样本中单链核酸分子互补配对结合,进而检测同源序列源序列 探针标记物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素(生物素、地高辛、
2、(生物素、地高辛、荧光素等)两大类荧光素等)两大类.分离杂交探针的方法:分离杂交探针的方法:1.1.提取某一病原微生物株系的染色体提取某一病原微生物株系的染色体DNADNA2.2.限制性内切酶进行酶解限制性内切酶进行酶解 3.3.得到的酶解片段克隆进一质粒载体,构建质粒文库得到的酶解片段克隆进一质粒载体,构建质粒文库 4.4.文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核微生物和非病原性微生物的核DNADNA进行杂交、筛选进行杂交、筛选.核酸杂交的灵敏度和可靠性极高核酸杂交的灵敏度和可靠性极高用探针直接同粪便样品、尿样、血样、
3、喉洗液和组用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标织样品中的目标DNA进行杂交,且无需预先纯化进行杂交,且无需预先纯化DNA若样品中的目标分子非常少,则需通过若样品中的目标分子非常少,则需通过PCR将目的将目的序列扩增,再进行杂交检测序列扩增,再进行杂交检测 从理论上讲,用从理论上讲,用DNADNA杂交来诊断疾病可用杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测于对所有的致病微生物的检测.4、非同位素标记探针、非同位素标记探针3232P P的缺点:的缺点:半衰期短,仅半衰期短,仅1313天天操作起来比较危险操作起来比较危险必须要有特殊的实验室设备进行操作必须要有特殊的实验室设备
4、进行操作放射性垃圾的处理繁琐放射性垃圾的处理繁琐.非放射性杂交检测系统:非放射性杂交检测系统:通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的发光物质而达到放大信号的目的采用将生物素(采用将生物素(biotin)标记的核苷酸掺入)标记的核苷酸掺入DNA的方的方法制备探针法制备探针生物素标记的生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年在室温下至少可保存一年检测发光和颜色变化可在几小时内完成检测发光和颜色变化可在几小时内完成.BBBBAPBBAP生物素生物素加入链霉素抗生物蛋白加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记的碱性磷酸酶加入生物素标记
5、的碱性磷酸酶探针探针目的目的DNA加入不同的生色或化学发光底物加入不同的生色或化学发光底物.荧光标记的引物直接进行荧光标记的引物直接进行PCR检测检测DNA引物引物1引物引物2荧光染料荧光染料PCR层析层析荧光检测荧光检测游离引物游离引物.分子夹心探针检测分子夹心探针检测发出荧光发出荧光分子夹心探针分子夹心探针(没有荧光没有荧光)荧光团荧光团猝灭剂猝灭剂目的目的DNA与目的与目的DNA杂交杂交.TaqMan探针技术探针技术原理:原理:利用利用Taq酶的酶的3 5外切核酸酶活性,切断探针,外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号,由于探针与模板特异性结合,荧产生荧光信号,由于探针与模板特异性结合,
6、荧光的强弱就代表了模板的数量光的强弱就代表了模板的数量.3553QR上游上游引物引物下游下游引物引物5 335 QRTaqMan探针的荧光信号产生机制探针的荧光信号产生机制.疟疾的分子诊断:疟疾的分子诊断:检测是否存在疟原虫检测是否存在疟原虫1.抽取血样进行镜检抽取血样进行镜检 2.免疫诊断免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染无法区分是以前感染还是现在感染3.DNA杂交诊断杂交诊断例一:例一:.DNADNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNADNA序列序列具体的分离过程:具体的分离过程:1.1.构建一
7、个疟原虫的核基因文库构建一个疟原虫的核基因文库2.2.用标记的疟原虫核用标记的疟原虫核DNADNA作探针去筛选核基因文库作探针去筛选核基因文库3.3.选出那些杂交信号最强的克隆选出那些杂交信号最强的克隆4.4.用这些选出来的片段作探针,与疟原虫及其同属中用这些选出来的片段作探针,与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交,以检查该片段作不导致疟疾的种的核基因作杂交,以检查该片段作为为DNADNA探针的可靠性探针的可靠性.锥虫的检测锥虫的检测锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统,在其中大量繁殖并杀死寄主细胞系统,在其中大量繁殖并杀死寄主细胞
8、显微镜检新鲜血液显微镜检新鲜血液取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40,30-40天后天后杀死昆虫杀死昆虫,镜检昆虫的肠道镜检昆虫的肠道免疫检测免疫检测:假阳性高假阳性高例二:例二:.PCR检测检测针对针对锥虫特有的一段锥虫特有的一段188bp的的DNA序列设计引序列设计引物,特异地从锥虫基因组中扩增得到物,特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的的条带条带.二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术抗生素的不合理使用抗生素的不合理使用DNA杂交杂交PCR检测检测噬菌体介导噬菌体介导.DNA杂交杂交设计设计16Sr
9、RNA16SrRNA为探针为探针16SrRNA16SrRNA在细菌中拷贝数极高,高度的保守性在细菌中拷贝数极高,高度的保守性特异性不是很好特异性不是很好必须结合必须结合PCRPCR技术技术.PCR检测检测nested PCRnested PCR针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物物 每对引物都能特异的扩增出一段目每对引物都能特异的扩增出一段目的片段,病原菌存在的可能性大大增加的片段,病原菌存在的可能性大大增加.模板模板使用外引物,进行第一使用外引物,进行第一次次PCR扩增扩增使用内引物,进行第二使用内引物,进行第二次次PCR扩增扩增第一次第一次PCRP
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