过表达P2X4受体介导三叉神经痛的实验研究.pdf

基金项目 国家自然科学基金(编号:8 1 8 6 0 1 9 9)作者简介 黄若瑜(1 9 9 5),女,江西赣州人,硕士,住院医师,研究方向:口腔医学。*通信作者 熊伟,E-m a i l:x i o n g w e i 9 61 6 3.c o m过表达P 2 X 4受体介导三叉神经痛的实验研究黄若瑜1 宋玉丰1 周敏1 徐昊旻1 刘俊1 张明明2 高云2 熊伟1*1.江西省口腔生物医学重点实验室 江西省口腔疾病临床医学研究中心南昌大学附属口腔医院 江西 南昌 3 3 0 0 0 6;2.南昌大学基础医学院生理教研室 江西 南昌 3 3 0 0 0 6 摘要 目的:本课题组前期发现,P 2 X 4受体可能通过调控脑源性神经生长因子(b r a i n-d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c-t o r,B D N F)表达,进而介导三叉神经痛(t r i g e m i n a l n e u r a l,T N)分子机制。为此,在TN大鼠模型中转染过表达P 2 X 4受体,进行验证。方法:以结扎框下神经慢性损伤法建立TN大鼠模型,P 2 X 4受体过表达质粒舌下静脉转染至TN大鼠中,以面部痛敏阈检测仪、荧光定量P C R、间接免疫荧光、W e s t e r n b l o t和E L I S A法检测大鼠三叉神经脊束核(s p i n a l t r i g e m i n a l n u c l e u s,S T N)和三叉神经节(t r i g e m i n a l g a n g l i a,T G)部位疼痛阈值,P 2 X 4、B D N F和T r k B转录水平,P 2 X 4和B D N F定位情况,P 2 X 4、B D N F、T r k B蛋白表达和E R K磷酸化水平,炎性因子白细胞介素-1(i n t e r l e u k i n-1,I L-1)和肿瘤坏死因子-(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-,T N F-)表达。结果:过表达P 2 X 4受体组大鼠疼痛阈值降低,S T N和T G部位P 2 X 4、B D N F受体和T r k B转录水平升高(P0.0 1),S T N中B D N F受体与小胶质标志物OX 4 2共定位、T G中P 2 X 4与胶质纤维酸性蛋白(g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n,G F A P)共定位,S TN和T G部位E R K磷酸化水平升高(P0.0 1),大鼠血清中I L-1和T N F-表达水平升高(P0.0 5)。结论:过表达P 2 X 4受体降低大鼠疼痛阈值,表明P 2 X 4离子参与了T N疼痛通路,其机制为P 2 X 4调控了B D N F/E R K通路,增强了E R K磷酸化和炎性因子I L-1和TN F-表达。关键词 P 2 X 4受体;三叉神经痛;脑源性神经营养因子;E R K磷酸化;炎性因子 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 17 6 5 1(2 0 2 3)0 90 7 9 20 6d o i 1 0.1 3 7 0 1/j.c n k i.k q y x y j.2 0 2 3.0 9.0 0 6E x p e r i m e n t a l S t u d y o n O v e r e x p r e s s i o n o f P 2 X 4 R e c e p t o r s M e d i a t i n g T r i g e m i n a l N e u r a l g i a.HU ANG R u o y u1,S ONG Y u f e n g1,ZHO U M i n1,XU H a o m i n1,L I U J u n1,ZHANG M i n g m i n g2,G A O Y u n2,X I ONG W e i1*.1.J i a n-g x i P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f S t o m a t o l o g y a n d B i o m e d i c i n e,J i a n g x i C l i n i c a l R e s e a r c h C e n t e r f o r S t o m a t o l-o g y,A f f i l i a t e d S t o m a t o l o g y H o s p i t a l o f N a n c h a n g U n i v e r s i t y,N a n c h a n g 3 3 0 0 0 6,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y,S c h o o l o f B a s i c M e d i c a l S c i e n c e s,N a n c h a n g U n i v e r s i t y,N a n c h a n g 3 3 0 0 0 6,C h i n a.A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o v a l i d a t e w h e t h e r P 2 X 4 r e c e p t o r s m e d i a t e t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f t r i g e m i n a l n e u r a l-g i a(T N)b y r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f b r a i n-d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r(B D N F)t h r o u g h t r a n s f e c t i n g o v e r e x-p r e s s e d P 2 X 4 r e c e p t o r s i n a TN r a t m o d e l.M e t h o d s:T h e P 2 X 4 r e c e p t o r o v e r e x p r e s s i o n p l a s m i d w a s t r a n s f e c t e d i n-t o t h e s u b l i n g u a l v e i n o f TN r a t s.T h e f a c i a l p a i n t h r e s h o l d a s s a y,q u a n t i t a t i v e f l u o r e s c e n c e P C R,i n d i r e c t i mm u n o-f l u o r e s c e n c e,p r o t e i n b l o t t i n g,a n d E L I S A w e r e u s e d t o d e t e c t t h e p a i n t h r e s h o l d s i n r a t s p i n a l t r i g e m i n a l n u c l e u s(S T N)a n d t r i g e m i n a l g a n g l i a(T G),t h e t r a n s c r i p t l e v e l s o f P 2 X 4,B D N F,a n d T r k B,t h e l o c a l i z a t i o n o f P 2 X 4 a n d B D N F,t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n o f P 2 X 4,B D N F,a n d T r k B,t h e p h o s p h o r y l a t i o n l e v e l s o f E R K,a n d t h e e x p r e s s i o n s o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s i n t e r l e u k i n-1(I L-1)a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-(TN F-).R e s u l t s:I n t h e P 2 X 4 r e c e p t o r o v e r e x p r e s s i o n g r o u p,p a i n t h r e s h o l d s w e r e r e d u c e d,t r a n s c r i p t l e v e l s o f P 2 X 4,B D N F r e c e p t o r,a n d T r k B w e r e i n c r e a s e d i n S T N a n d T G s i t e s(P 0.0 1),B D N F r e c e p t o r w a s c o-l o c a l i z e d w i t h m i c r o g l i a l m a r k e r O X 4 2 i n S T N,P 2 X 4 w a s c o-l o-c a l i z e d w i t h g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n(G F A P)i n T G,E R K p h o s p h o r y l a t i o n w a s i n c r e a s e d i n S T N a n d T G s i t e s(P0.0 1),a n d I L-1 a n d T N F-e x p r e s s i o n l e v e l s w e r e i n c r e a s e d i n s e r u m(P 0.0 1).C o n c l u s i o n:O v e r e x p r e s s i o n o f P 2 X 4 r e c e p t o r s d e c r e a s e d p a i n t h r e s h o l d s i n r a t s,s u g g e s t i n g t h a t P 2 X 4 i o n s a r e i n v o l v e d i n t h e TN p a i n p a t h w a y b y t h e m e c h a n i s m t h a t P 2 X 4 r e g u l a t e s t h e B D N F/E R K p a t h w a y,a n d e n h a n c e s E R K p h o s p h o r y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f i n-f l a mm a t o r y f a c t o r s I L-1 a n d TN F-.297J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,S e p.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.9 K e y w o r d s P 2 X 4 r e c e p t o r s;t r i g e m i n a l g a n g l i a;b r a i n-d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r;E R K p h o s p h o r y l a t i o n;i n f l a mm a t o r y f a c t o r s 三叉神经痛(t r i g e m i n a l n e u r a l,T N)被国际疼痛研究协会定义为“在第五颅神经的一个或多个分支中突然出现的、单侧的、短暂的、复发性疼痛”,通常由口面部的轻度机械刺激诱发,如说话、吃饭、喝水、化妆、刷牙和微笑等行为1-3。流行病学调查显示,该病在任何年龄段均可发生,但多集中于中年和老年人,尤以女性为主4。P 2 X 4受体是嘌呤受体家族中的重要成员之一,由细胞外配体结合5 -三 磷酸腺苷(a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e,AT P)激活的离子通道,主要在中枢神经和免疫系统组织中表达,在神经炎症的调节中发挥着重要作用5。学者在研究神经胶质细胞如何调控脊髓疼痛机制时,同样揭示了AT P作为关键介质,可诱发小胶质细胞表达的P 2 X 4受体进而调控脑源性神经生长因子(b r a i n-d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r,B D N F)释放,以激活神经元T r k B受体,改变神经元的兴奋性6。B D N F已被证明能够驱动背角神经元的去抑制,最终导致疼痛超敏,同样雄性小鼠的疼痛超敏反应会因脊髓小胶质细胞B D N F的下调而降低7。此外,P 2 X 4受体在中枢和外周神经元中广泛表达,P 2 X 4敲除小鼠显示出突触增强的改变8。因此,神经元P 2 X 4受体可能直接或间接通过激活小胶质细胞B D N F表达,进而参与神经炎症和慢性疼痛。结合本课题组前期研究发现,在T N大鼠模型中B D N F和三叉神经节出现了共定位表达现象,推测P 2 X 4受体可能参与了三叉神经节调控B D N F/T r k B通路进而介导疼痛。在已有基础上,本研究拟对T N大鼠模型舌下静脉注射P 2 X 4受体过表达质粒,检测大鼠疼痛阈值、P 2 X 4、B D N F和炎性因子等表达情况,进一步探讨P 2 X 4受体质粒过表达是否影响B D N F表达,介导三叉神经痛的分子致病机制。以期为后续治疗三叉神经痛提供潜在药物靶点。1 材料与方法1.1 质粒和实验动物 空质粒和P 2 X 4受体过表达质粒均由南昌大学附属口腔医院医学实验室构建并保存;48周龄雄性 S p r a g u e-D a w l e y(S D)大鼠购自南昌大学实验动物科学中心。另所有动物实验均通过南昌大学附属口腔医院医学研究伦理委员会伦理审查(审批号:C S U-2 0 2 2-0 0 6 8)。1.2 主要试剂和仪器 D A P I染色试剂盒(巴傲得生物,南京);q P C R试剂盒(生工生物,上海);R NA提取和逆转录试剂盒(全式金生物,北京);山羊抗鼠F I T C和山羊抗兔T R I T C(E a r t h O x,U S A);小鼠抗N E NU抗体(A b c a m,B r i t a i n);T r i t o n x-1 0 0(阿拉丁,上海);E C L显色液(雅酶生物,上海);E L I S A试剂盒(碧云天生物,上海);I L-1和T N F-引物(擎科生物,北京);国际通用电子机械疼痛测量仪(中国医学科学院生物医学研究所,北京);核酸定量仪(立康科 技,南 昌);荧 光 定 量P C R仪(伯 乐 生 物,U S A);倒置荧光显微镜(徕卡,G e r m a n y);酶联免疫检测仪(T h e r m o f i s h e r,U S A)。1.3 方法1.3.1 建立T N大鼠模型并分组 结扎框下神经慢性损伤方法建立T N大鼠感染模型9,待大鼠手术1 0 d稳定后,以舌下静脉方式分别将空质粒和P 2 X 4受体过表达质粒转染至T N大鼠模型。另采用荧光定量P C R技术进行预实验,筛选干扰效果最佳的时 间 点。将T N大 鼠 随 机 分 为 空 白 处 理 组(C o n t r o l)、空质粒处理组(C o n t r o l+v e c t o r)和过表达P 2 X 4受体处理组(C o n t r o l+P 2 X 4 o v e r e x p r e s-s i o n),每组2 0只。空白处理组:正常饲喂水和食物;空质粒处理组:大鼠手术适应1 0 d后舌下注射空质粒,转染5 d后取材进行实验;过表达P 2 X 4受体处理组:大鼠手术适应1 0 d后舌下注射P 2 X 4受体过表达质粒,转染5 d后取材实验。1.3.2 术侧面部机械痛敏阈值(MWT)参考瞿先侯等1 0建立的S D大鼠三叉神经痛评价方法,使用国际通用电子机械疼痛测量仪对3个分组的T N大鼠模型手术第0、1、3、5、7、9、1 1、1 3和1 5天时间点痛敏阈值记录,国际通用电子机械疼痛测量仪使用方法参考说明书进行操作。1.3.3 荧光定量P C R技术 分别收集手术后第1 5天空白处理组、空质粒处理组和过表达P 2 X 4受体处理组的T N大鼠三叉神经脊束核(s p i n a l t r i-g e m i n a l n u c l e u s,S T N)和三 叉 神 经 节(t r i g e m i n a l g a n g l i a,T G)组织荡洗,提取术侧神经组织总R NA,测定R NA浓度并立即反转录为c D NA,具体实验步骤参考北京全式金R NA提取和反转录试剂盒说明书。以 黄 若 瑜1 1建 立 的 检 测P 2 X 4、B D N F和T r k B受体荧光定量P C R方法,合成P 2 X 4、B D N F、T r k B和内参-a c t i n引物并配置q P C R反应体系,397 口腔医学研究2 0 2 3年9月第3 9卷第9期利用荧光定量P C R仪进行mR NA表达水平测定。1.3.4 免疫荧光检测 分别取出手术后第1 5天空白处理组、空质粒处理组和过表达P 2 X 4受体处理组的T N大鼠中S T N和T G组织进行荡洗操作,并心尖灌注。将 获 得 神 经 节 组 织 置 于4%P F A,在3 0%蔗糖溶液中脱水(8 h更换1次),并对三叉神经组织 进行包埋,利用-2 0 冰 冻切片机切 成8 m厚的切片。用P B S冲洗切片,然后滴入0.3%的T r i t o n x-1 0 0,在室温下放置1 5 m i n后,用山羊血清在3 7 的水浴中封闭切片1 h后,避光滴加一抗、二抗水浴处理,置于倒置荧光显微镜下观察记录。1.3.5 W e s t e r n b l o t 手术后1 5 d,收集3组T N大鼠的S T N和T G组织蛋白,暂存于1.5 m L印管。按照一定比例加入5S D S上样缓冲液进行煮样操作,利用B C A蛋白定量试剂盒对所得各组蛋白进行定量处理。以预制蛋白分离胶进行分组跑胶并转膜,8%脱脂牛乳封闭1 h,分别以一抗P 2 X 4、B D N F、T r k B、E R K和内参-a c t i n孵育,洗脱后加入二抗,进行E C L发光显色。1.3.6 E L I S A 以结扎框下神经慢性损伤法建立T N大鼠模型,待大鼠手术1 0 d后,以舌下静脉方式分别将空质粒和P 2 X 4受体过表达质粒转染至T N大鼠模型。分别取3组大鼠血样并在高速冰冻离心机离心获得血清,根据各个组别的对应位置将血清加入酶标板规定的孔中,混合均匀,封闭包被板进行水浴3 0 m i n。重复洗涤5次按照顺序将试剂添加到相应的孔中,用密封板薄膜覆盖涂层板并在水浴中加热3 0 m i n。最后使用终止液终止反应,以多功能酶标仪测定炎性细胞因子的浓度。1.4 统计学分析 利用S P S S 2 6.0统计软件,每组样本重复3次,数据均采用xs表示,经正态性检验后,数据均符合正态分布。多组间比较采用单因素方差分析,以P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 大鼠行为学测定结果 结果显示,空白处理组、空质粒处理组和过表达P 2 X 4受体处理组的T N大鼠在01 0 d痛敏阈值无差异,表明以结扎框下神经慢性损伤法建立T N大鼠模型不改变大鼠痛敏阈值。而在T N大鼠适应1 0 d后,分别将空质粒和P 2 X 4受体过表达质粒转染至T N大鼠模型发现,与空白处理组相比,空质粒处理组痛敏阈值无差异,而过表达P 2 X 4受 体 处 理 组 痛 敏 阈 值 出 现 了 下 调(P0.0 1),见表1。说明P 2 X 4的过表达可下调S D大鼠的痛敏阈值,参与了疼痛反应。表1 P 2 X 4过表达质粒转染T N大鼠痛敏阈值变化T a b.1 C h a n g e s o f p a i n s e n s i t i v i t y t h r e s h o l d s i n T N r a t s t r a n s f e c t-e d w i t h P 2 X 4 o v e r e x p r e s s i o n p l a s m i dxs作用时间/d空白处理组空质粒处理组过表达P 2 X 4受体处理组02 7.3 21.0 02 6.1 01.5 02 5.3 21.0 012 4.3 00.8 02 4.2 30.8 02 5.9 80.2 532 3.1 91.0 02 5.3 51.0 02 3.7 61.0 052 4.3 21.5 02 4.3 60.5 02 4.5 81.0 072 5.1 60.9 02 5.9 81.0 02 5.1 00.5 092 4.3 11.0 02 5.2 61.0 02 3.2 80.3 01 12 4.3 01.5 02 2.8 50.8 01 8.1 61.5 0*1 32 4.1 91.0 02 3.7 10.9 01 6.9 60.5 0*1 52 5.1 01.0 02 3.1 02.0 01 6.1 01.0 0*注:与空白处理组、空质粒处理组比较,*P0.0 12.2 q P C R 检测结果 q P C R检测结果表明,在T N大鼠模型S T N和T G部位,与空白处理组相比,空质粒处理组P 2 X 4、B D N F和T r k B mR NA表达量无差异,而过 表达P 2 X 4受 体处理组P 2 X 4、B D N F和T r k B mR NA的表达水平显著升高(P0.0 1),见表2和表3。说明P 2 X 4受体成功转染入T N大鼠模型,且P 2 X 4受体可促进B D N F/T r k B通路基因的表达。表2 q P C R检测S TN中P 2 X 4、B D N F和T r k B表达情况T a b.2 D e t e c t i o n o f P 2 X 4,B D N F,a n d T r k B e x p r e s s i o n i n S T N b y q P C Rxs组别P 2 X 4B D N FT r k B空白处理组1.0 00.0 11.0 00.0 31.0 00.0 7空质粒处理组0.9 50.0 21.0 60.0 21.1 00.0 5过表达P 2 X 4受体处理组2.8 70.4 3*1.5 70.2 3*3.6 50.6 9*注:与空白处理组、空质粒处理组比较,*P0.0 1表3 q P C R检测T G中P 2 X 4、B D N F和T r k B表达情况T a b.3 D e t e c t i o n o f P 2 X 4,B D N F,a n d T r k B e x p r e s s i o n i n T G b y q P C Rxs组别P 2 X 4B D N FT r k B空白处理组1.0 00.0 70.9 90.0 40.9 80.0 9空质粒处理组0.9 70.0 41.0 00.0 31.0 20.0 2过表达P 2 X 4受体处理组3.6 70.2 6*3.4 50.2 9*5.4 50.7 8*注:与空白处理组、空质粒处理组比较,*P0.0 12.3 免疫荧光检测结果 将P 2 X 4过表达质粒转染T N大鼠5 d后进行免疫共定位检测实验,结果表明,在S T N组织中,过表达P 2 X 4受体处理组小胶质细胞标志物O X 4 2和B D N F出现了共定位表达,且O X 4 2和B D N F荧光显著增强,见图1。说明,可直观观测到P 2 X 4受体活化小胶质细胞,且B D N F表 达 增 加。在T G组 织 中,过 表 达P 2X 4受497J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,S e p.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.9 图1 P 2 X 4过表达组大鼠术侧S T N中B D N F与O X 4 2共标情况F i g.1 C o-l a b e l i n g o f B D N F w i t h O X 4 2 i n t h e s u r g i c a l S T N o f P 2 X 4 o v e r e x p r e s s i o n r a t s.图2 P 2 X 4过表达组大鼠术侧T G中P 2 X 4与G F A P共标情况F i g.2 C o-l a b e l i n g o f P 2 X 4 w i t h G F A P i n t h e T G o f P 2 X 4 o v e r e x p r e s s i o n r a t s.体处理组星形胶质细胞特异标志物G F P A和P 2 X 4出现了共定位表达,B D N F也与神经元胞核N E NU共定 位 表 达,图2和 图3。说 明P 2 X 4活 化 了G F P A,且B D N F可 能 是 由 神 经 元N E NU释 放,G F P A、B D N F和N E NU均增强。2.4 W e s t e r n b l o t结果 检测结果显示,在T N大鼠模型S T N和T G部位,与空白处理组相比,空质粒处理组P 2 X 4、B D N F、T r k B 和p E R K蛋白表达量无差异,而过表达P 2 X 4受体处理组P 2 X 4、B D N F、T r k B和p E R K 蛋白的表达水平显著升高,见图4和图5。说明P 2 X 4受体的过表达可促进B D N F/T r k B通路基因的表达,提高E R K磷酸化水平,且W e s t e r n b l o t结果与q P C R检测数据相一致。2.5 E L I S A 检测结果 结果显示,与空白处理组相比,空质粒处理组炎性细胞因子I L-1和T N F-表达量无差异,而过表达P 2 X 4受体处理组炎性细胞因子I L-1和T N F-的浓度较高(P0.0 5),见表4。说明P 2 X 4受体的过表达可促进炎性细胞因子I L-1和T N F-的分泌。3 讨论 三叉神经痛特征是在三叉神经中一个或多个分支中出现触觉诱发的单侧短暂性休克样阵发性疼597 口腔医学研究2 0 2 3年9月第3 9卷第9期图3 P 2 X 4过表达组大鼠术侧T G中B D N F与N E NU共标情况F i g.3 C o-l a b e l i n g o f B D N F a n d N E NU i n t h e T G o f P 2 X 4 o v e r e x p r e s s i o n r a t s.4 a:P 2 X 4、B D N F和T r k B蛋白表达水平;4 b:E R K磷酸化水平图4 P 2 X 4 过 表 达 组 大 鼠 术 侧S T N中P 2 X 4、B D N F、T r k B和p E R K蛋白表达量F i g.4 E x p r e s s i o n s o f P 2 X 4,B D N F,T r k B,a n d p E R K p r o t e i n i n t h e o p e r a t i v e S TN o f P 2 X 4 o v e r e x p r e s s i o n r a t s.表4 E L I S A检测血清中I L-1和T N F-表达情况T a b.4 E x p r e s s i o n o f I L-1 a n d T N F-i n s e r u m b y E L I S An g/L,xs组别I L-1T N F-空白处理组4 2.5 32.2 55 3.5 92.0 5空质粒处理组4 1.4 31.2 55 2.4 33.0 5过表达P 2 X 4受体处理组5 8.3 42.7 8*6 4.2 72.9 5*注:与空白处理组、空质粒处理组比较,*P0.0 5痛,除了阵发性疼痛外,一些患者还有持续性疼痛。T N可分为经典T N(C T N)和次级T N(S T N)7,1 2。5 a:P 2 X 4、B D N F和T r k B蛋白表达水平;5 b:E R K磷酸化水平图5 P 2 X 4过表达组大鼠术侧T G中P 2 X 4、B D N F、T r k B和p E R K蛋白表达量F i g.5 E x p r e s s i o n o f P 2 X 4,B D N F,T r k B,a n d p E R K p r o t e i n i n t h e o p e r a t i v e T G o f P 2 X 4 o v e r e x p r e s s i o n r a t s.当今科学家普遍认为,经典T N最常见的原因是桥小脑池中的血管压迫三叉神经或动脉形态学改变,称为神经血管冲突与压缩。解剖学表明,在大量标本中神经髓鞘化向突胶质细胞髓鞘化的转变沿着神经近端2 5%逐渐变细,这个“过渡区”易受到血管压力影响,可能是三叉神经痛结构基础1 3。在此基础上,有许多神经生理学、神经成像和组织学研究者指出三叉神经脱髓鞘的三叉神经传入附近的三叉神经根进入脑桥的潜在病理生理机制。然而,三叉神经痛具体发病分子机制仍不清楚。临床治疗上,多使697J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,S e p.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.9 用钠通道阻滞剂预防性药物和神经外科手术。常用的钠通道阻滞处方药卡马西平或奥卡西平,具有相同的作用机制,以频率依赖的方式阻断电压钠通道1 4。调查表明,钠通道阻滞剂对大多数T N患者均有效,但不良反应包括精神衰弱、嗜睡、头晕、皮疹和震颤。根据国际三叉神经痛治疗指南建议如果钠通道阻滞剂药物无效,可合理转入手术外科治疗。当药物虽然有效,但由于不良反应事件而不能达到治疗剂量时,也应考虑外科手术。但外科手术常伴随着易损伤相邻神经、过程复杂和术后感染等风险。为此,探讨三叉神经痛具体发病分子机制,开发新的药物靶点就显得尤为重要。P 2 X 4受体由P 2 X 4基因编码,是一种AT P门控阳离子通道,广泛表达于中枢和外周神经元,可被AT P释放和自分泌信号、线粒体代谢、细胞极化和细胞迁移活化激活。大量研究表明,P 2 X 4受体已成为靶向神经炎症信号机制的重要靶点1 5,特别是在巨噬细胞、小胶质细胞和内皮细胞中。在过去的十年中,科学家开发了众多靶向P 2 X 4受体的新型药物点,如T a s p i n e是一种具有抗炎活性天然化合物,作用于P 2 X 4受体抑制炎症反应;P 2 X 4拮抗剂5-B D B D可治疗神经疼痛过敏等。此外,许文帅1 6发现,P 2 X 4受体可通过调控B D N F通路和T r k B磷酸化,进而作用帕金森疾病。但P 2 X 4受体在三叉神经痛领域研究较少,目前已证明B D N F可以导致神经兴奋性变化通过信号传导,从而促进慢性疼痛发生。为此,本实验以结扎框下神经慢性损伤法建立T N大鼠模型,P 2 X 4受体过表达质粒舌下静脉转染至T N大鼠中,探究三叉神经痛具体致病机制。结果显示,过表达P 2 X 4受体组大鼠疼痛阈值降低,说明P 2 X 4参与了三叉神经痛发生。以荧光定量P C R和W e s t e r n b l o t实验,表明S T N和T G部位B D N F受体和T r k B mR NA和蛋白水平均升高,且E R K磷酸化增强。间接免疫荧光结果表明,P 2 X 4活化了胶 质细胞,且B D N F和 神 经 元 标 志N E NU共表达。E L I S A实验结果显示大鼠血清中I L-1和T N F-表达水平升高。综上所述,P 2 X 4受体调控了B D N F/E R K通路,增强了E R K磷酸化和炎性因子I L-1和T N F-表达,进而介导三叉神经痛。后续可在不同靶标模式动物上进行重复验证,以确定P 2 X 4受体作为治疗三叉神经痛的药物靶点。参考文献1 Z a k r z e w s k a J M,W u J,M o n-W i l l i a m s M,e t a l.E v a l u a t i n g t h e i m p a c t o f t r i g e m i n a l n e u r a l g i a J.P a i n,2 0 1 7,1 5 8(6):1 1 6 6-1 1 7 4.2 S j a a s t a d O,B a k k e t e i g L S.T h e r a r e,u n i l a t e r a l h e a d a c h e s.V g s t u d y o f h e a d a c h e e p i d e m i o l o g y J.J H e a d a c h e P a i n,2 0 0 7,8(1):1 9-2 7.3 M u e l l e r D,O b e r m a n n M,Y o o n M S,e t a l.P r e v a l e n c e o f t r i-g e m i n a l n e u r a l g i a a n d p e r s i s t e n t i d i o p a t h i c f a c i a l p a i n:a p o p-u l a t i o n-b a s e d s t u d y J.C e p h a l a l g i a,2 0 1 1,3 1(1 5):1 5 4 2-1 5 4 8.4 龙晏,邱申彩,李淑慧,等.过表达N o t c h 1的胞内段基因对人牙周膜干细胞增殖能力影响J.口腔医学研究,2 0 1 9,3 5(1):2 8-3 2.5 熊伟,吴饶平,欧晓艳,等.A-3 1 7 4 9 1对P 2 X_3受体介导的三叉神经痛的作用研究J.口腔医学研究,2 0 1 2,2 8(1 0):9 7 5-9 7 9.6 Y a m a m o t o K,K o r e n a g a R,K a m i y a A,e t a l.P 2 X(4)r e c e p-t o r s m e d i a t e A T P-i n d u c e d c a l c i u m i n f l u x i n h u m a n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s J.Am J P h y s i o l H e a r t C i r c P h y s i o l,2 0 0 0,2 7 9(1):H 2 8 5-H 2 9 2.7 Z h o u L J,P e n g J,X u YN,e t a l.M i c r o g l i a a r e i n d i s p e n s a b l e f o r