河南省安阳市副猪嗜血杆菌流行菌株调查与耐药性分析.pdf
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1、20流 行 病 学河南省安阳市副猪嗜血杆菌流行菌株调查与耐药性分析杜娟1,刘亚辉1,苏玉贤2(1.开封市畜牧工作站,河南开封475000;2.平顶山市畜牧发展中心,河南平顶山467000)摘要:为了解河南省安阳市副猪嗜血杆菌流行菌株的血清型和耐药性情况,2022 年从该地区 25 家养猪场无菌采集临床疑似感染副猪嗜血杆菌的病死猪肝脏、肺脏、关节渗出液等组织病料175份,采用细菌分离纯化培养、形态学观察、“卫星生长”培养、生化反应和 PCR 鉴定等方法进行副猪嗜血杆菌分离鉴定,应用琼脂免疫扩散法进一步进行血清分型,采用 Kirby-Bauer 纸片法检测分离菌株对 16 种抗生素的耐药性。结果显
2、示:从 175 份组织病料中检测出 34 株副猪嗜血杆菌,检出率为 19.43%;分离菌在含有 NAD 和犊牛血清的 TSA 培养基上产生针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落,镜检可见革兰氏阴性、长杆状、细丝状等多形态菌体,在金黄色葡萄球菌周围菌落出现“卫星生长”现象,且无溶血,分离培养结果符合副猪嗜血杆菌特征。经 PCR 扩增测序,分离菌株与 GenBank 中公布的副猪嗜血杆菌 16S rRNA 序列同源性在 97%以上;共鉴定出 4 型 14 株、5 型 4 株、6 型 3 株、13 型 8 株和未定型 5 株,分别占 41.18%、11.76%、8.82%、23.53%和 14.71%;
3、34 株副猪嗜血杆菌对对阿莫西林、青霉素 G、链霉素、土霉素 4 种抗生素耐药性最高,耐药率为 88.24%94.12%,多重耐药较严重,至少对 5 种以上抗生素产生耐药性,以 9 重耐药最多。结果表明,河南省安阳市猪场存在一定程度的副猪嗜血杆菌流行,流行菌株血清型复杂,耐药严重。本调查为河南省安阳市副猪嗜血杆菌病防控提供了数据支撑。关键词:副猪嗜血杆菌;分离鉴定;血清分型;耐药试验中图分类号:S858.28文献标识码:A文章编号:1005-944X(2023)08-0020-08DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2023.08.005开放科学(资源服务)标识码(OSI
4、D):Investigation on the Prevalent Strains of Haemophilus parasuis in Anyang City,Henan Province and Analysis on Its Drug ResistanceDu Juan1,Liu Yahui1,Su Yuxian2(1.Kaifeng Livestock Workstation,Kaifeng,Henan475000,China;2.Pingdingshan Animal Husbandry Development Center,Pingdingshan,Henan467000,Chin
5、a)Abstract:In order to investigate the serotype and drug resistance of Haemophilus parasuis(HPS)prevalent in Anyang City,Henan Province,in 2022,175 tissue samples including livers,lungs,joint exudates and other tissues of dead pigs clinically suspected of infection with HPS were aseptically collecte
6、d from 25 swine farms for isolation and identification of HPS using bacterial isolation and purification culture,morphological observation,satellite growth culture,biochemical reaction and PCR assay,as well as further serotyping by agar immunodiffusion method,then the resistance of the isolates to 1
7、6 antibiotics was tested by Kirby-Bauer method.The results revealed that 34 strains of HPS were detected with a detection rate of 19.43%;bacterial colonies that were of pinhead size,colorless,transparent,smooth and humid were produced by the isolates on TSA medium containing NAD and calf serum;Gram-
8、negative bacteria with various forms such as long rod-shaped and filamentous,were observed through microscopic 收稿日期:2023-05-25修回日期:2023-07-12基金项目:农业农村部 2022 年兽药质量监督抽检和风险监测计划项目(农办牧20221 号)通信作者:刘亚辉。E-mail:212023年第40卷第8期流 行 病 学examination;the phenomenon of“satellite growth”appeared in the bacterial col
9、onies around Staphylococcus aureus,without hemolysis,and the results of isolation and culture were consistent with the characteristics of HPS.PCR amplification and sequencing results showed that the isolates were 97%identity to 16S rRNA sequence of HPS published in GenBank;14 strains of serotype 4,4
10、 strains of serotype 5,3 strains of serotype 6,8 strains of serotype 13 and 5 unidentified strains were identified,accounting for 41.18%,11.76%,8.82%,23.53%and 14.71%respectively;34 strains of HPS were most resistant to amoxicillin,penicillin G,streptomycin and oxytetracycline,with the drug resistan
11、ce rate ranged from 88.24%to 94.12%,especially resistant to multiple drugs,to 5 antibiotics at least and to 9 at most.In conclusion,HPS was prevalent in swine farms in Anyang City to a certain extent,and the prevalent strains contained complex serotypes and were highly resistant to drugs.Data suppor
12、t was thus provided for the prevention and control of HPS in Anyang City,Henan Province.Key words:Haemophilus parasuis(HPS);isolation and identification;serum typing;drug resistance test副猪嗜血杆菌病也称为格拉瑟病(Glassers disease),是 由 副 猪 嗜 血 杆 菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的猪细菌性传染病,以关节炎、心包炎、多发性浆膜炎、脑膜炎和败血症为病理特征,
13、临床表现为体温升高、呼吸困难、咳嗽、跛行、神经失调等多种症状。HPS 是条件致病菌,通常定殖于上呼吸道,很少单独引起发病,在猪体发生免疫抑制或环境应激反应导致免疫力下降时,可与猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、链球菌等病原体发生混合感染,加重病情。HPS 在我国猪群中普遍存在,主要侵害 48 周龄仔猪,引起的发病率为 10%15%,病死率可达 50%以上1,给养猪业造成严重经济损失。HPS 血 清 型 较 多,按 照 Kieleein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散方法分类至少有15种,有约 20%的菌株未能定型2。HPS 有明显的区域性和时期性特征,不同时期、不同地区甚至
14、同一个养殖场可能存在不同血清型菌株流行,且不同血清型菌株间致病力差异大,缺乏完全交叉免疫保护或者交叉免疫保护率低3-4。尽管疫苗接种是有效防控 HPS 感染的主要手段,但是 HPS 商品疫苗仅有23 种血清型,疫苗株与流行的致病菌株血清型难以匹配,因而免疫保护作用有限5。目前,临床上使用抗生素是防治细菌性疫病不可或缺的重要措施。但是,HPS 易产生耐药性,长期滥用抗生素导致 HPS 耐药性增强和新耐药菌株不断出现,给防治该病带来很大困难。因此,分离鉴定地方菌株,了解本地区 HPS 流行菌株特点和开展耐药性监测可以提高疫苗免疫效果,减少药物盲目使用,对有效防控该病流行具有指导意义。本研究于 20
15、22 年从河南省安阳市 25 家猪场采集临床疑似 HPS 感染病死猪的肺脏、肝脏、心血等病料进行 HPS 分离鉴定,并进行血清型分型、耐药性检测,以了解该地区猪场 HPS 流行菌株血清型和耐药情况,为今后疫苗研制和临床药物筛选提供基础资料。1材料与方法1.1病料来源2022 年 112 月在河南省安阳市不同区域选择 25 家养猪场,无菌采集 68 头临床疑似感染 HPS病死仔猪和保育猪的肺脏、心血、关节液、脑、肝脏等组织病料,共 175 份,其中肺脏 47 份、脑组织 44 份、肝脏 18 份、心血 19 份、关节液 18 份、气管 29 份,每个采集部位计为 1 份病料。病猪死前主要表现为发
16、热、咳嗽、关节肿大、站立不稳、皮肤黏膜发绀,剖检可见关节炎、腹膜炎、肺炎和心包炎等病变。25 家猪场病料采集信息见表 1。1.2主要试剂、菌株及试验小鼠胰蛋白大豆肉汤(TSB)、胰蛋白大豆琼脂(TSA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、5%绵羊鲜血琼脂平板、犊牛血清,购自青岛海博有限公司;细菌基因组 DNA 小量抽提试剂盒(离心柱式),购自上海碧云天生物有限公司;胸膜肺炎放22流 行 病 学线杆菌(ATCC27090)质控菌株、16 种细菌药敏纸片、微量生化鉴定管,购自杭州微生物试剂有限公司;ATCC25923 金黄色葡萄球菌、HPS 115 型单因子标准阳性血清,购自中国兽医药品监察所;DL
17、 2000 DNA Marker、2Taq Master Mix、PCR试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒等,均购自天根生化科技(北京)有限公司;BALB/c 小鼠,购自浙江中医药大学动物实验研究中心。1.3病原菌分离培养用接种环无菌挑取病料分别接种于 TSA 培养基(含有犊牛血清和 0.01%NAD),37 培养2436 h 后,挑取形态为光滑湿润、无色透明、针尖大小的疑似 HPS 菌落,再接种于 TSA 培养基进行连续传代纯化培养;挑取疑似 HPS 菌落制作细菌涂片,革兰氏染色、镜检,观察细菌形态和染色;挑取上述纯化培养菌落分别划线接种于含犊牛血清、未含 NAD 的 TSA 培养基,未含犊牛血
18、清、NAD 的 TSA 培养基,置恒温箱 37 培养 2436 h,观察菌落形态和生长情况。1.4病原菌“卫星生长”试验挑取纯化培养的疑似 HPS 菌落水平划线接种于 5%绵羊鲜血琼脂平板,再垂直于上述水平划线接种金黄色葡萄球菌,于 5%CO2培养箱,37 培养 2436 h,观察是否有“卫星生长”(即待检菌落在靠近金黄色葡萄球菌处较多,越远菌落越少,直至不能生长6)和细菌溶血现象。1.5生化试验鉴定挑取纯化培养的疑似 HPS 菌落,分别接种于添加有 2%NAD 和 5%胎牛血清的葡萄糖、果糖、H2S 等微量生化鉴定试剂管,在 5%CO2培养箱中37 培养 2436 h 后进行接触酶、氧化酶试
19、验,按照说明书进行操作并观察试验结果。1.6PCR 扩增鉴定参 考 Oliveira 等7报 道 的 方 法 设 计 合成 HPS 16S rRNA 基因(GenBank 登录号M75065)特异性扩增引物(上游引物 HPS-F:5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3;下 游 引 物HPS-R:5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3)。引物由深圳华大基因科技有限公司合成,预期扩增片段大小为 821 bp。挑取 TSA 培养基(添加有 2%NAD 和 5%犊牛血清)上的菌落,按照说明书利用基因组 DNA 抽提试剂盒提取菌株 DNA,以提取纯化的 DNA 为模板用于 PCR 扩增。
20、PCR 反应体系(25.0 L):细菌 DNA 模板 2.0 L,2Taq Master Mix 12.5 L,上、下游引物(10 pmol/L)各 1.0 L,加入灭菌超纯水至 25.0 L。PCR 反应参数:95 预变性 3 min,95 变性 30 min,表 125 家猪场病料采集信息统计猪场部位及数量采集猪数/头病料总数/份1 号 肺、脑、肝各 2 份,心血 1 份372 号 肺、脑、气管各 3 份393 号 肺、气管、关节液各 1 份,肝 2 份254 号 肺、气管、心、脑各 2 份,关节液 3 份3115 号 肺、气管、心、关节液各 1 份,脑 2 份466 号 肺、心血各 2
21、份247 号 肺、气管、关节液各 1 份,肝 2 份358 号 肺、脑、肝各 2 份,心血 1 份379 号 肺、心血各 2 份2410 号 肺、心血各 2 份2411 号 肺、气管、脑、关节液各 2 份2812 号 肺、脑、肝各 2 份,心血 1 份3713 号 肺、气管、心血、关节液各 1 份,脑 2 份4614 号 肺、脑、肝各 2 份,心血 1 份4715 号 肺、脑、气管各 3 份3916 号 肺、气管、心血、关节液各 1 份,脑 2 份4617 号 肺、脑、肝各 2 份,心血 1 份3718 号 肺、脑、气管各 3 份3919 号 肺、气管、肝、脑、关节液各 2 份21020 号
22、肺、气管、心血、关节液各 1 份,脑 2 份2621 号 肺、脑、气管各 3 份3922 号 肺、气管、脑、关节液各 2 份2823 号 肺、脑、肝各 2 份,心血 1 份3724 号 肺、气管、脑、关节液各 2 份2825 号 肺、气管、心血、关节液各 1 份,脑 2 份46232023年第40卷第8期流 行 病 学56 退火 55 s,72 延伸 1 min,共运行 30 个循环,最后 72 延伸 10 min。取 PCR 扩增产物利用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测,在自动紫外凝胶成像仪下观察拍照,记录结果,同时设阴、阳性对照。扩增产物克隆、纯化后,送深圳华大基因科技有限公司测序,用 BL
23、AST 软件对测得的基因序列与 GenBank 中公布的 HPS 16S rRNA 序列进行同源性比对分析。1.7分离菌株血清分型采用文献 8 中的免疫琼脂扩散试验方法进行分离菌株血清型鉴定。1.7.1分离菌株分型抗原制备取分离菌株接种于 TSA 培养基,37 培养 2436 h,再挑取菌落接种于 TSA 培养基对分离菌进行复壮培养。用PBS(pH 7.2)缓冲液洗脱菌苔,将其装入离心管中,12 000 r/min 离心 23 min;弃掉上清液,加入 9 倍于沉淀物体积的PBS(pH 7.2)缓冲液,混匀,121 高压处理 12 h,12 000 r/min 离心 23 min;收取上清液,
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