黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究.pdf
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1、现代农业科技2023 年第 19 期植物保护学黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究胡正雨陈美琪郑家雪李子安王 越梁绪康王信行赵文琪田 园*(山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院,山东泰安 271016)摘要黄精是重要的药食同源植物,黄精叶斑病影响了黄精的品质。为明确泰山黄精叶斑病的病原菌及其生物学特性,本文采集患病黄精叶片,通过组织分离法、致病性测定、形态学鉴定及分子生物学鉴定,确定了黄精叶斑病病原菌种类,分析了碳源、氮源、pH值、温度、培养基以及病原菌的致死温度对菌丝体生长的影响,进而研究了黄精叶斑病病原菌的生物学特性。共从患病黄精叶片中分离获得33株真菌,具有致病能力的菌
2、株两株,分别鉴定为Fusarium fujikuroi HJ-B-20和F.proliferatum HJ-B-32。生物研究学特性研究表明,HJ-B-20最适碳源为葡萄糖,最适氮源为酵母浸膏,最适生长温度为28,最适pH值范围为68,最适培养基为PDA;HJ-B-32最适碳源为葡萄糖,最适氮源为蛋白胨,最适生长温度为28,最适pH值范围为68,最适培养基为PDA。关键词黄精叶斑病;病原菌;分离;鉴定;生物学特性中图分类号S435.672文献标识码A文章编号 1007-5739(2023)19-0088-06DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2023.19.025开放科
3、学(资源服务)标识码(OSID):黄精(Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute)为多年生草本植物,广泛分布于我国除南方热带外的地区1。传统医学认为,黄精具有补肾益精、滋阴润燥之功效,可用于治疗肾虚亏损、体倦乏力等症2。现代医学研究发现,黄精还具有抗衰老、提高免疫力、消除水肿、消炎、抗肿瘤和降血糖等多种功效3-5。泰山黄精是泰山四大名药之一6,属知名道地药材,一直在 中国药典 之列。近年来,由于泰山黄精的需求量越来越大,人们开始采用人工栽培的模式来加大生产,黄精的种植基地也遭受到多种病害侵扰。其中,黄精叶斑病是主要的病害之一7。该病害常从夏秋开始发生,在雨季
4、最为严重。发病初期叶片出现椭圆形或不规则形的病斑并向下扩散,造成叶片枯焦而死亡,地上部位逐渐失去光合能力;地下部位可能被叶斑病菌进一步侵染,造成软化、枯萎,甚至绝产。目前,对造成黄精叶斑病的病原菌尚存有争论。刘思睿等8认为,棕榈拟盘多毛孢(Pestalotiopsis trachi-carpicola)是贵州黄精叶斑病的病原菌;邹 娟等9发现,草茎点霉(Phoma herbarum)是湖南省怀化市黄精叶斑病的病原菌;杨汝10认为,链格孢属(Alternaria)、叶点霉属(Phyllosticta)和刺盘孢属(Colletotrichum)都可引起贵州地区的黄精叶斑类病害,根据不同的病害症状将
5、其划分为黑斑病、叶斑病和炭疽病。由此推测,不同地区的黄精,其叶斑类病害的病原菌可能不同。因此,本项目拟分离泰山黄精叶斑病主要致病菌,验证其致病活性,并对其进行鉴定,在此基础上对病原菌进行生物学特性研究,以期为泰山黄精叶斑病的科学防治提供依据。1材料与方法1.1试验材料和培养基1.1.1试材以学校中草药种植园中的黄精(Polygonatumsibiricum Delar.ex Redoute)作为试验材料,于 2021 年6 月黄精叶斑病多发的季节,采集具有典型叶斑病症状的叶片,供下一步进行病原菌的分离使用。1.1.2培养基参照 微生物学实验教程11以及 植病研究方法12制备培养基:马铃薯葡萄糖
6、琼脂(PDA)培养基、马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基、查氏琼脂(Czapek)培基金项目山东第一医科大学(山东省医学科学院)青年科学基金培育资助计划(202201-034);山东省大学生创新创业计划项目“基于高通量测序的黄精叶斑病微观机制解析及其拮抗菌的生防作用探究”(S202210439012);山东省医药卫生科技发展计划(202101060623)。第一作者 胡正雨(2001),女,本科在读。研究方向:生物制药。E-mail:*通信作者 E-mail:收稿日期 2023-02-0388养基、麦芽浸膏琼脂(MEA)培养基、水琼脂(WA)培养基和燕麦片琼脂(OMA)培养基。1.2菌株分离与测定
7、1.2.1黄精叶斑病菌株的分离用无菌手术刀取病健交接处 0.2 cm0.2 cm 的叶片组织,用组织分离法分离病原真菌13。依次用 75乙醇漂洗 23 min、1次氯酸钠消毒 35 min、无菌水冲洗 46 次,然后用灭菌滤纸吸干水分,用无菌刀片切取组织后置于 PDA 培养基上分离真菌。待培养基上长出可见菌落时,及时挑取菌落,在 PDA 培养基平板上多次划线分离,获得纯培养物。1.2.2致病性测定采用无伤接种法14处理,即接种前将黄精离体叶片用 75%乙醇进行消毒,随后用无菌水冲洗。取直径为 0.6 cm 的真菌饼接种至无损伤叶片,每个叶片接种 2 块,以空白 PDA 菌饼为对照,置于 28
8、培养箱中保湿培养,逐日观察记录,每处理 3 次重复。取接种发病后的部位进行组织分离并镜检观察。1.2.3病原菌的鉴定形态特征观察:将病原菌接种至 PDA 培养基上,于 28 恒温培养 7 d,观察培养皿内菌落的形态特征,并于显微镜下观察孢子形态和子实体的有无、大小等。分子生物学鉴定:在超净工作台上刮取少量菌丝,采用微波法快速提取其基因组 DNA15。以基因组DNA 为模板、ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和 ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)为引物进行 PCR 扩增,产物通过 2%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶、纯化后由青岛睿博兴科公司完成测序工作
9、。将测定的 ITS 序列与 GenBank 中已知核酸序列进行BLSAT 分析,从中获得与菌株相似的序列,利用MEGA 7.0 软件构建系统发育树16。1.3病原菌生物学特性研究1.3.1碳源、氮源对菌丝体生长的影响以查氏培养基为基础培养基,用等量的碳源(葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖)替代基础培养基中的蔗糖,用等量的氮源(蛋白胨、酵母浸膏、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸)替代基础培养基中的硝酸钠,以不含碳源或氮源的培养基为对照,取直径为 0.6 cm 的菌饼接种于各培养皿中央。于 28 恒温培养 7 d 后,用十字交叉法测量菌落直径8,所有处理组均设 3 次重复。1.3.2温度对菌丝体生长的
10、影响在 PDA 培养基上接种病原菌菌饼,分别置于 5、10、15、20、25、28、30、35 共 8 种温度条件下恒温培养 7 d,用十字交叉法测量菌落直径,所有处理组均设3 次重复。1.3.3pH 值对菌丝体生长的影响用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 溶液将 PDA 的pH 值分别调节至 4、5、6、7、8、9、10,共 7 个处理,接种病原菌菌饼后 28 恒温培养 7 d,用十字交叉法测量菌落直径,所有处理组均设 3 次重复。1.3.4培养基对菌丝体生长的影响将病原菌菌饼分别接种至 PDA、PSA、Czapek、OMA、MEA 和 WA 培养基上,于 28 恒温培
11、养 7 d,用十字交叉法测量菌落直径,所有处理组均设 3 次重复。1.3.5病原菌致死温度测定在盛有 5 mL 无菌水的试管中加入病原菌菌饼,分别于 40、45、50、55、60、65 的恒温水浴锅中加热10 min,随后置于 PDA 培养基上,在 28 恒温条件下培养 7 d,用十字交叉法测量菌落直径,所有处理组均设 3 次重复。1.4数据统计与分析数据整理分析采用 Excel 2019,数据统计检验采用 SPSS 20.0,显著水平设置为 P=0.05。2结果与分析2.1病害症状泰山黄精叶斑病主要危害黄精的叶片,如图 1 所示。患病初期叶片出现褪绿色小点,逐渐扩大形成不规则的黄褐色病斑,病
12、斑上常伴有黑色小点;患病后注:A、B、C 分别为发病初期、中期、后期。图 1黄精叶斑病发病症状ABC胡正雨等:黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究89现代农业科技2023 年第 19 期植物保护学期病斑大面积连在一起,叶片变黄、脱落,甚至最终导致整个植株死亡。2.2病原菌分离及致病性测定共分离出真菌 33 株,用离体接种法对分离的菌株进行致病性测定。结果显示,HJ-B-20 和 HJ-B-32两株菌在叶片无伤接种的情况下能够产生黄褐色不规则病斑,见图 2(B)(C),其余菌株接种后没有典型病斑。利用组织分离法对发病叶片进行再分离、纯化,获得菌株与原始菌株一致,完成柯赫氏法则,表明HJ-B
13、-20 和 HJ-B-32 均为致病菌株。2.3叶斑病病原菌鉴定黄精叶斑病病原菌 HJ-B-20 的菌落在 PDA 培养基上正面呈白色、毛绒状,见图 3(A);菌落背面呈白色,见图 3(B);在显微镜下观察,可见大型分生孢子无色、多胞、镰刀形、略弯曲,小型分生孢子卵圆形至柱形,见图 3(C)。病原菌 HJ-B-32 的菌落在 PDA 培养基上正面呈白色至淡黄色、毛绒状,见图 3(D);菌落背面呈黄色,见图 3(E);在显微镜下观察,可见大型镰刀形分生孢子和小型圆柱形分生孢子,见图 3(F)。两株菌均符合镰刀菌属(Fusarium)菌株的特征。两株菌的 ITS 基因测序结果与 NCBI 核酸序列
14、比对(图 4)表明,菌株 HJ-B-20 与藤仓镰刀菌(F.fuji-kuroi LS-S-4)菌株的相似性为 99.81%,在系统发育树上聚为一支;菌株 HJ-B-32 与层出镰刀菌(F.proli-feratum LrBF45)的相似性为 99.43%,在系统发育树上聚为一支。结合菌株形态特征,确定菌株 HJ-B-20为藤仓镰刀菌,命名为 F.fujikuroi HJ-B-20;菌株 HJ-B-32 为层出镰刀菌,命名为 F.proliferatum HJ-B-32。2.4病原菌生物学特性分析2.4.1碳源、氮源对菌丝体生长的影响试验结果表明,不同氮源和碳源均能促进病原菌注:A 为对照;B
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