肌肉生长抑制素基因在重要经济动物育种中的研究进展.pdf

2023 05XUMUSHOUYI畜牧兽医摘要：肌肉生长抑制素（myostain，MSTN）又称生长分化因子8，是转化生长因子-超家族的一员，是动物体正常运作所必需的蛋白质，也是肌肉发育的负性调节因子，决定了动物的整体肌肉质量。由于MSTN的突变，许多大型动物，包括牛、羊、狗和人类，都表现出“双肌”表型。本文首先概述MSTN的结构特征、表达规律、生物学功能和作用机制，然后介绍了肌肉抑制素基因的多态性在动物育种领域的重要意义，以及MSTN基因编辑技术在牛、羊、猪等经济动物生产中的应用情况。关键词：肌肉生长抑制素；双肌表型；多态性；基因编辑肌肉性状是影响畜牧生产中的重要经济性状，提高家畜肌肉品质是家畜育种工作者的毕生追求。肌肉生长抑制素（myostain，MSTN），又名生长分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF8），是目前唯一明确的对骨骼肌生长发育和再生起负向调节作用的分泌性糖蛋白，对肌肉发育和稳态维持都起着重要作用，其自然突变或敲除导致的蛋白功能失活或者表达量下降都会导致肌肉异常发达，反之，其表达上升则会引起肌肉萎缩。MSTN 缺失型家畜骨骼肌重量增加，使得肌肉与其他组织相比，比例大大提高。自然界中存在MSTN天然突变体动物：如比利时蓝牛、皮埃蒙特牛、特克赛尔羊，其肌肉异常发达的“双肌”表型引起了遗传育种研究领域的高度关注。1MSTN基因的结构特征MSTN基因编码的MSTN蛋白因其具有转化生长因子（transforming growth factor beta）超家族的典型结构特征而成为了TGF-超家族的成员之一，但相较于其他家族成员，其C端的氨基酸序列要更短一些。MSTN基因在不同物种中结构相似且高度保守，包括三个相似大小的外显子以及两个内含子，但其在不同脊椎动物物种中的染色体定位并不相同。MSTN位于人、黑猩猩、牛、绵羊和山羊的2号染色体上，位于小鼠1号染色体上，位于大鼠9号染色体上，位于猪15号染色体上，位于马18号染色体，位于狗37号染色体，而兔、鸡的该基因定位在7号染色体。哺乳动物MSTN基因外显子编码的氨基酸数目除小鼠（376个AA）外，其他均为375个氨基酸的潜在蛋白。与其他TGF-蛋白一样，MSTN蛋白包含信号序列、N端LAP前结构域和7个半胱氨酸残基的C端成熟序列。MSTN蛋白的活化需要经两次蛋白质水解切割，最终形成C端成熟肽随即发挥其生物学作用1。其3-UTR区域具有丰富的miRNA结合位点，对于其转录和翻译具有重要的调节作用。2MSTN基因在动物体内的表达MSTN的主要功能是通过自分泌或旁分泌信号传导负向调节骨骼肌的生长和发育，但众多研究表明MSTN基因在多种动物中均有所表达，且在哺乳动物各组织器官（包括乳腺）中广泛表达。虽然在不同物种的表达谱范围存在一定差异，但在骨骼肌中表达均最为显著2，在乳腺和心脏中的表达水平较低。而在鱼类的研究中，发现MSTN1基因广泛表达，而MSTN2基因表达则相对有限，主要在大脑中。说明MSTN的作用不仅限于骨骼肌的生长和发育的负调节，还可能通过旁系同源物的差异表达来影响其他组织的生长发育过程。同时，MSTN 基因表达具有十分显著的时序特征，在胚胎期发生的早期阶段，MSTN的表达仅限于发育体节的肌动蛋白片段，肌肉生长抑制素基因在重要经济动物育种中的研究进展*杨鹏1，黄涛2*，徐梦思1，2*（1.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子832000；2.石河子大学动物科技学院）收稿日期：20230316*基金项目：兵团区域创新引导计划“利用免疫法生产双肌羔羊的基础性研究”（2021BB017）；第三师图木舒克市重大科技计划“夏河绵羊种质资源鉴定、评价及核心种群的提纯复壮”（KY2022ZD01）；中央引导地方科技发展资金项目“新型GnRH半抗原的研制”。*通讯作者：黄涛（1978-），男，博士，教授，从事动物分子遗传 育 种 工 作，E-mail：；徐 梦 思（1990-），女，硕士，副研究员，从事动物遗传育种与新成果推广工作，E-mail：。612023 05畜牧兽医XUMUSHOUYI成熟后，MSTN存在于骨骼肌中。3MSTN基因的生物学功能研究表明，MSTN基因的生理作用主要是防止生物体发育的各个阶段肌肉组织的过度生长，还能够通过损伤卫星细胞的激活和增殖以及巨噬细胞和成肌细胞向损伤部位的迁移起到抑制骨骼肌再生的目的。因此，目前针对MSTN基因生物学功能的研究主要集中在其缺失或者突变导致肌肉过度生长。除典型的双肌型牛、羊3外，陆续也有犬4、猪5、兔6、鸡7、鸟8和人类9等动物的相似研究，均表现为抑制生肌。研究表明，MSTN对家畜肌肉发育过程中的调控作用，不局限于对肌肉前体细胞的增殖调控，还包含对成肌细胞增殖和分化的调控10。MSTN的上调表达会引发成肌分化抗原（myogenicdifferentiation antigen，MyoD）的过度表达，进而引起过度活跃分化，抑制成肌细胞前体和成肌细胞的增殖，下调MSTN上述细胞数量则会增加。此外，还有研究表明MSTN基因对于脂肪的沉积也具有调节作用。MSTN在脂肪组织中表达量最低，MSTN缺失型动物与野生型相比具有更少的总脂肪和体内脂肪。在脂肪细胞中过度表达MSTN的转基因小鼠，在喂食高脂肪饮食时不会发展为肥胖，并且比肥胖的非转基因小鼠对葡萄糖更加耐受。McPherron等研究发现，在MSTN突变的小鼠动物模型中，该基因的缺失在导致小鼠肌肉增加的同时会减少脂肪的沉积，相反，MSTN基因的过度表达则会引起小鼠肌肉萎缩，脂肪积累量明显增加11。4MSTN基因的作用机制TGF-是一类结构相关的转化生长因子，广泛参加机体内的各种代谢活动，主要通过Smad 蛋白传递信号，传导过程受到多层次的精密调控，TGF-与含有胞质内结构域的细胞膜受体结合，形成磷酸化 Smad 家族蛋白的复合物。活性 Smad 进入细胞核，附着在 DNA 上并招募控制基因表达的转录激活剂。Smad2 和 Smad3 以及 Smad4 参与 MSTN代谢途径，诱导信号传导。Smad7 和 Smurf 参与信号传导抑制，其中 Smad7 被肌肉生长抑制素激活，并以反馈方式抑制 MSTN 信号传导12。MSTN 的信号传导通路主要参与骨骼肌肥大的调控。除了经典的Smad蛋白信号传导机制外，MSTN也可以通过MAPK信号通路和PI3k-AKT信号通路发挥作用。5MSTN基因在重要经济动物育种中的研究进展肌纤维是构成肌肉组织的基本单位，其数量、类型和密度与动物的产肉率息息相关。研究表明，MSTN基因全程参与家畜的肌肉发育与生长，在胚胎期和出生后都对家畜整体肌肉含量与比例起到决定性作用。5.1MSTN多态性研究MSTN在哺乳动物中高度保守，同时也具有丰富的突变。MSTN基因突变小鼠的肌肉可以增加2倍以上，该基因突变在牛、绵羊和猪中同样表现出了肌肉异常发达和脂肪减少的双肌表型。在20世纪80年代，有学者在比利时蓝牛的单基因测定结果中首次证实了MSTN基因功能丧失导致其双肌表型的出现，结果显示比利时蓝牛MSTN等位基因开放阅读框中11个碱基的缺失导致3个氨基酸的丢失，在氨基酸274之后发生移码并在氨基酸287后创建了一个终止密码子。这种突变导致蛋白质链缩短，从而丧失了MSTN蛋白质的原有功能，使得比利时蓝牛骨骼肌的重量是正常肉牛品种的1.6倍，并且由于瘦肉含量较高且口感适应而受到了广大消费者的青睐。随后陆续又有大约20种不同类型的MSTN基因遗传变异（缺失、插入和单核苷酸多态性）在牛中被鉴定。这些多态性均可作为肉牛提高肉质和产肉数量的分子标记。在这些MSTN突变的比利时蓝牛中，由于脂肪减少，肌肉质量增加，骨骼比例减少，结缔组织减少，从而导致牛肉嫩度提升，肉质特性也更加优越13。但是，在日常生产中，双肌牛也经常观察到与难产相关的问题，因为MSTN对于肌肉发育的调控是在出生前就发挥作用的，因而导致纯合子双肌犊牛的出生体重相比杂合子犊牛要大得多，突变带来了犊牛生产过程中的一系列不利影响，例如：妊娠期延长，奶牛生育能力下降或者出现难产和死产犊牛的现象。所以在实际生产中，在追求双肌表型的同时，也要考虑通过交配获得MSTN杂合子动物进而减少出生牛犊的死亡概率。绵羊的MSTN基因位于2号染色体的长臂末端，在过去的十年里，在不同的绵羊中报道的MSTNSNPs大多数位于该基因的非编码区。比利时的特克赛尔羊肌纤维粗大，可以生产出产量更高、瘦肉率更高且脂肪含量更低的胴体，因此被广泛用作终端杂交品种。对特克赛尔绵羊进行的数量性状基因座分析表明，在第2号染色体上MSTN的3 非翻译区有一个变异（g.6723G A），该变异对肌肉质量有显著影响。这为在骨骼肌中高度表达的miR1和miR206创建了一个靶点，此外还发现了其他遗传变异，包括c.1232A、g.391G T和18个其他SNPs14。Han等采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析622023 05XUMUSHOUYI畜牧兽医和DNA测序技术对新西兰绵羊品种的MSTN基因多态性进行研究共发现了27个核苷酸突变。其中3个位于启动子区域，3个位于5 非编码区，11个位于1号内含子，5个位于2号内含子，5个位于3 非编码区15。Jiang等人报道了猪MSTN基因的三个SNPs：T A、G A和C T，只有一个突变（MSTN：G.383T A）与约克夏猪生长期的平均日增重有关，且具有杂合突变猪的体重更大16。比利时皮特兰猪的肌肉表型异常发达，Stinckens等人将其MSTN序列与其他五个品种的猪进行了比较，共发现15个多态性位点，其中位于启动子区域g.447A G多态性在皮特兰猪中具有很高的等位基因频率，g.879T A多态性仅在中国梅山猪中出现17。然而，迄今为止在猪中发现的MSTN自然遗传变异与肌肉表型没有显著关联。5.2MSTN基因编辑研究牛、羊、猪等畜牧经济物种最主要追求的经济目标是提高其产肉效率，因而对肌肉发育调控起到负向调节作用的MSTN基因成为了科研人员重点关注的基因。随着该基因结构特点和生物学功能的明晰，同时体细胞核移植技术和基因编辑技术的高速发展与成熟，越来越多的科研人员试图通过当前主流的基因编辑技术对动物个体的MSTN基因进行改造。2012年，Tessanne等人开展了MSTN基因沉默转基因牛的生产研究，成功获得了5头转基因牛，其中3头牛实现了MSTN的沉默表达18。Gim等在最近的研究中利用电穿孔技术对胚胎进行额外基因编辑。将MSTN公母牛体外受精产生的胚胎移植到代孕母牛体内，成功产犊1头。F1代犊牛测序显示MSTN杂合突变，无健康问题19。Qian等人使用锌指核酸酶技术结合体细胞核移植培育出MSTN缺失型梅山猪，其后代表现出显著的双肌表型，特别是后驱异常发达，肌肉质量较野生猪相比增加了50%100%，但肌纤维尺寸却比也野生猪还要小20。说明该双肌表型的形成主要依赖于MSTN突变引起的肌纤维数量显著增多。基因编辑技术的应用已成功获得多个MSTN敲除绵羊，大多数均是结合原核注射技术获得的编辑个体，但这种方式容易获得嵌合体。于是开始尝试SCNT的方式获得纯合基因编辑绵羊，研究者首先需要分别通过ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9基因编辑技术获得MSTN-KO精准编辑的细胞系，并产出MSTN基因编辑纯合绵羊21。这些发生基因编辑的细胞系的状态和形态与普通细胞相比没有显著差异，而个体与野生型绵羊相比，体重增加，骨骼肌纤维肥大，且表现双肌性状。Wang等利用CRISPR/Cas9技术实现了山羊和绵羊MSTN基因的基因编辑，成功获得了体重增加、肌纤维尺寸增大且不影响肉质的动物个体22-23。这些证据表明破坏动物MSTN的功能可以有效地增加肌肉质量、提高产肉量，而且MSTN基因突变和表达水平下调不会影响肉质。6展望MSTN基因一直是畜牧产业中调节家畜肉类产量的主效基因，目前的研究主要集中在通过基因敲除MSTN基因的方法实现动物肌肉总量的提升，且大多数成功获得极显著双肌表型的研究多为集中在模式动物小鼠上的，在大型动物（牛、羊和猪）的研究成功率还有待提升。因此，需要我们更多的了解大型哺乳动物肌肉生长的调控机制，同时开展更加有针对产后个体的MSTN基因抑制，进而发挥该基因在重要经济动物肌肉发育领域的调节作用。此外，肌肉生长抑制素的作用不仅限于骨骼肌本身，还在调控脂肪、骨骼形成，参与肌肉、脂肪等生物学过程中同样发挥重要作用。因此，在实际的育种工作中，简单粗暴地完全敲除 MSTN 基因可能会影响到动物体的其他生长发育指标。除了基因编辑，研究者还尝试了许多其他的策略来下调或阻断 MSTN 的活性。包括过量表达肌抑素氨基端的LAP、过量表达卵泡抑制素（Follistatin）、过量表达显性负ActRB受体、使用肌抑素的单克隆抗体和采用RNAi技术直接干扰肌抑素基因的表达都能不同程度地缓解肌抑素的作用，从而刺激肌肉的发育。研究表明动物的双肌表型主要表现在肌纤维的数量以及肌纤维体积的增粗，在动物出生后肌纤维的数量就相对恒定，出生后肌肉产量完全取决于营养以及运动这两种状态来达到肌肉的增产。MSTN 基因在胚胎期，尤其是成肌细胞分化期间表达量高，动物出生后 MSTN 的表达一直维持在较低的丰度。因此，在未来的研究中还可以尝试从动物发育的胚胎期着手，在中胚层肌肉发育的关键时期进行动物母体介导调控调控胎儿的MSTN基因表达，从而在不影响MSTN基因其他重要生物学功能正常行使的情况下达到调节动物肌肉发育的目的。参考文献1Wolfman NM，Mcpherron AC，Pappano WN，et al.Activation632023 05畜牧兽医XUMUSHOUYIof latent myostatin by the BMP-1/tolloid family of metalloproteinasesJ.Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100（26）：15842-15846.2刘瑞凿，刘真，吴明明，等.绵羊胚胎发育中后期骨骼肌BTG2/3的表达动态及其与Myostatin的关系J.畜牧兽医学报，2015，46（11）：1916-1923.3Clop A，Marcq F，Takeda H，et al.A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin geneaffects muscularity in sheepJ.Nature Genetics，2006，38：813-818.4Shelton GD，Engvall E.Gross muscle hypertrophy in whippetdogs is caused by a mutation in the myostatin geneJ.Neuromuscular Disorders，2007，17（9）：721-722.5崔文涛，谢珊珊，李想，等.通过ZFN 技术编辑猪MSTN 基因创制高瘦肉率梅山猪新种质J.农业生物技术学报，2019，27（12）：2272-2280.6陈冬金，桑雷，孙世坤，等.福建白兔Myostain（MSTN）基因的克隆及序列分析J.福建农业学报，2018（8）：771-776.7赵振华，黎寿丰，黄华云，等.MSTN 基因突变对优质鸡肌肉生长的影响J.安徽农业大学学报，2015，42（5）：733-737.8Lee J，Kim DH，Lee K，et al.Muscle hyperplasia in Japanesequail by single amino acid deletion in MSTN propeptideJ.International Journalof Molecular Sciences，2020，21（4）：1504-1516.9Schuelke M，Wagner K R，Stolz L E，et al.Myostatin mutationassociated with gross muscle hypertrophy in a childJ.New England Journal of Medicine，2005，351（10）：1030-1031.10董诗琳，张梦帆，李耀东.MSTN基因在动物生产中的研究进展J.现代畜牧兽医，2020（12）：61-64.11McPherron AC，Lee SJ.Suppression of body fat accumulationin Myostatin-deficient miceJ.Journal of Clinical Invesrigation，2002，109（5）：595-601.12Zhu X，Topouzis S，Liang LF，et al.Myostatin signalingthrough Smad2，Smad3 and Smad4 is regulated by the inhibitorySmad7 by a negative feedback mechanismJ.Cytokine，2004，26：262-272.13Vincenti 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