布病的实验室诊断【可编辑的PPT文档】.ppt

布鲁氏菌病概况布鲁氏菌病（以下简称布病）是一种全球分布的由布氏布鲁氏菌病（以下简称布病）是一种全球分布的由布氏菌引起的人兽共患传染病。菌引起的人兽共患传染病。布氏菌通过皮肤粘膜、消化道、呼吸道等途径浸润人体布氏菌通过皮肤粘膜、消化道、呼吸道等途径浸润人体而出现发热、关节痛、乏力、多汗为主的临床症状，可而出现发热、关节痛、乏力、多汗为主的临床症状，可以造成骨关节、免疫、消化、循环、神经等多系统损害，以造成骨关节、免疫、消化、循环、神经等多系统损害，其临床表现复杂多变，无特异性。其临床表现复杂多变，无特异性。全球布鲁氏菌病疫情2013年上半年世界羊布鲁氏菌病分布图（引自OIE）ICDC,China CDC345Amsterdam,The Netherlands www.kit.nl世界卫生组织建议的人布鲁氏菌病诊断世卫组织建议的检测包括：虎红平板试验(RBT)血清凝集试验(SAT)Coombs试验补体结合试验(CFT)ELISA荧光偏振布氏菌培养PCR世卫组织未未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏性和特异性）没有明确的阳性和阴性预测值（PPV&NPV）结论取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不同，有待优化PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立建议开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵敏性、特异性、PPV和NPV等）WHO人布鲁氏菌病的诊断检测IgM/IgG侧向层析检测荧光偏振检测虎红平板试验血清凝集试验2-ME 试验IgM/IgG ELISA库姆斯(IgG)CFT培养（仅在BSL-3中）PCR简易/快捷复杂/要求高灵敏性+参考+特异性+参考+保健点参比实验室诊断机构布鲁氏菌病病原学布鲁氏菌为革兰阴性短小杆菌，布鲁氏菌为革兰阴性短小杆菌，0.5-0.70.5-0.70.6-1.5nm0.6-1.5nm，初次，初次分离时多呈球杆状和卵圆形，故称分离时多呈球杆状和卵圆形，故称“布鲁氏菌布鲁氏菌”。菌体无鞭。菌体无鞭毛，不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的荚膜。毛，不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的荚膜。19851985年年WHOWHO布鲁氏菌病专家季员会把布氏菌属分为布鲁氏菌病专家季员会把布氏菌属分为6 6个种个种1919个个生物型。羊种（生物型。羊种（1 1 3 3型）、牛种（型）、牛种（1 1 9 9型）、猪种（型）、猪种（1 15 5型）及绵羊型副睾种、沙林鼠种、犬种各型）及绵羊型副睾种、沙林鼠种、犬种各1 1个生物型个生物型。中国已分离到中国已分离到1414个生物型，即羊种（个生物型，即羊种（1 13 3型），牛种（除型），牛种（除5 5型以外的型以外的7 7个型），猪种（个型），猪种（1.31.3型），绵羊副睾种和犬种各型），绵羊副睾种和犬种各1 1个型。个型。临床上以羊、牛、猪三个种意义最大，羊种致病力最强。多临床上以羊、牛、猪三个种意义最大，羊种致病力最强。多种生物型的产生可能与病原菌为适应不同宿主而发生遗传变种生物型的产生可能与病原菌为适应不同宿主而发生遗传变异有关异有关。布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢布氏菌革兰染色布鲁氏菌的分离培养1 1、血培养：、血培养：1 1）双相培养基：血液）双相培养基：血液10mL10mL注入双相培养基中注入双相培养基中3737温箱培养温箱培养每每4848小时观察小时观察无细菌生长继无细菌生长继续培养续培养培养至培养至3030日才发出报告。日才发出报告。2 2）自动化培养：血培养瓶置全自动血培养仪中）自动化培养：血培养瓶置全自动血培养仪中有菌生长仪器报警有菌生长仪器报警做鉴定做鉴定2 2、骨髓培养：、骨髓培养：按临床骨髓穿刺法抽取骨髓，按照血液培养方法按临床骨髓穿刺法抽取骨髓，按照血液培养方法培养。培养。自动培养仪和培养瓶自动培养仪和培养瓶疑似布鲁氏菌时：抽取菌液少许，接种到血琼脂疑似布鲁氏菌时：抽取菌液少许，接种到血琼脂培养基中，进行纯培养。培养基中，进行纯培养。要求一定生物安全柜内要求一定生物安全柜内操作！操作！生化反应进一步鉴定：生化反应进一步鉴定：自动化设备自动化设备布鲁氏菌培养与鉴定布鲁氏菌培养与鉴定培养特性专性需氧，生长缓慢专性需氧，生长缓慢生长温度生长温度20-4020-40，最佳生长温度，最佳生长温度35-3735-37，pH6.6-7.4pH6.6-7.4，马耳他布鲁氏菌和某些牛种菌需要较，马耳他布鲁氏菌和某些牛种菌需要较严格的严格的5%-10%CO25%-10%CO2。布鲁菌属对营养要求较高，生长中需要各种氨基布鲁菌属对营养要求较高，生长中需要各种氨基酸、离子、烟酸和生物素，有点菌种需要血清或酸、离子、烟酸和生物素，有点菌种需要血清或全血才能生长全血才能生长布氏琼脂布鲁氏菌菌落血平皿血平皿 布氏菌菌落布氏菌菌落布鲁氏菌培养与鉴定布鲁氏菌培养与鉴定研究方法VITEK2 全自动微生物生化分析仪布氏菌生化鉴定借助VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统建立了一套布鲁氏菌的生化鉴定参考标准分型方法。完善布鲁氏菌生化鉴定数据库。鉴定布鲁氏菌速度快，可靠性高，确定布鲁氏菌属的鉴定指标为L-脯氨酸芳胺酶（ProA）、酪氨酸芳胺酶（TyrA）、尿素酶（URE）、氨基乙酸芳胺酶（GlyA）；区分羊种布氏菌的指标为ELLMAN（ELLM）；区分牛种布氏菌的指标为乳酸盐产碱（1LATK）；区分猪种布氏菌指标为丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶（APPA）.当鉴定为人苍白杆菌时，需与布鲁氏菌进行鉴别。全自动微生物生化鉴定结果羊种菌为人主要致病菌种生物型H2S染料抑菌血清凝集噬菌体裂解硫堇复红AMRTbWbBK2羊1-+-+-+2-+-+3-+-+病原特征羊1型为主羊3型为主19631969-19712005病原特征羊种菌菌型变迁冻干机设备菌种保存管BCSP31-PCR引物和扩增片段，产物223bpPrimer1：B4 5-TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA-3Primer2：B5 5-CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG-3检测BCSP31基因的PCR方法，可以在属的水平上检测和鉴定布鲁氏菌菌株OIE推荐鉴定布鲁氏菌种的方法之一M DL2000 DNA Ladder1。B.melitensis 2.B.abortus 3.B.suis 4.B.ovis 5.B.neotomae 6.B.canis M 1 2 3 4 5 6布鲁氏菌属BCSP31-PCR电泳结果-223bpAMOS-PCR 鉴定布氏菌种布鲁氏菌布鲁氏菌DNADNA多态性一个原因就是插入序列分布，多态性一个原因就是插入序列分布，IS711IS711就是一段插入序列，在数量和位置上都很保守，就是一段插入序列，在数量和位置上都很保守，一个引物锚定在一个引物锚定在IS711IS711上，其他不同的引物分别选在上，其他不同的引物分别选在与插入基因与插入基因IS711IS711邻近的单染色体邻近的单染色体DNADNA上，代表种的上，代表种的特异性，通过扩增带的大小来鉴别种。设计特异性，通过扩增带的大小来鉴别种。设计5 5条引物条引物的混合反应体系，适用于布鲁氏菌种间的鉴定方法，的混合反应体系，适用于布鲁氏菌种间的鉴定方法，可鉴别布氏菌牛种可鉴别布氏菌牛种1 1，2 2，4 4型、羊种布鲁氏菌、猪种型、羊种布鲁氏菌、猪种1 1型型和和绵羊附睾种。除了共有的绵羊附睾种。除了共有的178178bpbp以外以外牛种布鲁牛种布鲁氏菌氏菌1 1，2 2，4 4型扩增条带为型扩增条带为498bp498bp，羊种布鲁氏菌扩，羊种布鲁氏菌扩增片段为增片段为731bp731bp，猪种，猪种1 1型扩增条带为型扩增条带为285bp285bp，绵羊附，绵羊附睾种睾种961bp961bp。19株标准菌株AMOS-PCR扩增结果 1000bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2000bp750bp500bp250bp200bp 1 1、2222.DL2000 DNA Ladder.DL2000 DNA Ladder 2-4.B.Melitensis 1-3 5-11.B.Abortus 1-7 2-4.B.Melitensis 1-3 5-11.B.Abortus 1-7 12.B.Abortus 9 13-17.B.Suis.1-5 18.B.ovis 19.B.neotomae 20.12.B.Abortus 9 13-17.B.Suis.1-5 18.B.ovis 19.B.neotomae 20.B.canis 21.B.canis 21.阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照 750bp 500bp 250bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 250bp223bp 布鲁氏菌属 种鉴定1-5AMOS扩增 1、c-2、羊1 3、牛1 4、猪1 5、待检菌株6-10 BCSP31-PCR：6、羊1 7、牛1 8、猪1 9、OVIS 10、待检菌株多重PCR(Bruce ladder)Evaluation of a Multiplex PCR Assay(Bruce-ladder)for MolecularTyping of All Brucella Species,Including the Vaccine Strains B.abortusB.melitensisB.suisB.cains布氏菌 MLVA 分型中国分离株的基因型分布中国分离株的基因型分布中国分离株的基因型分布中国分离株的基因型分布省份主ST型菌株数 主ST型菌数 主ST型比例内蒙古8722636.1%四川811654.5%新疆811545.5%宁夏810660.0%广西217228.6%河南87342.9%山东87571.4%辽宁325240.0%青海85480.0%上海85240.0%安徽40.0%甘肃294250.0%广东84250.0%吉林84375.0%布鲁氏菌血清学检测常用方法有：常用方法有：虎红平板凝集试验虎红平板凝集试验试管凝集试验（莱特试验）试管凝集试验（莱特试验）半胱氨酸试管凝集试验半胱氨酸试管凝集试验抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验Amsterdam,The Netherlands www.kit.nl虎红平板试验 Rose-Bengal Plate Agglutination Test检测特征（流行率低）灵敏度 92.9（急性病例）特异性94.3%（无暴露史）特异性91.7%（重复暴露）特异性76.9（既往布病患者）Ruis-Meza et al Clin Microbiol Infect.2005;11(3):221-5不同来源（品牌）和批次的抗原质量差异很大难以解读（弱阳性）由于暴露和非特异性反应，在疾病流行地区的表现不良需要确定取舍值结论诊断功效在很大程度上取决于制剂来源和疾病流行程度，需要确定取舍值虎红平板凝集试验虎红平板凝集试验它是一种半定量的凝集反应试验。所用抗原是用虎红(四氯四碘荧光素)色素染成的一种酸性抗原，具有克服非特异性反应，对检查小分子抗体IgG较为敏感的特点。虎红平板凝集试验(RBPT)方法:在清洁的玻片上加0.03ml的受检血清，然后再加入上述标化抗原悬液0.03ml，使充分混匀，在4分钟内观察结果，以出现可见的凝集反应为阳性。虎红玻片凝集试验（RBT）筛查试验筛查试验:简便、实用、快速、经济，适用于基层简便、实用、快速、经济，适用于基层单位检验单位检验 全血玻片凝集反应全血玻片凝集反应在一张清洁的破片上加1滴赫德逊氏反应抗原，然后在抗原上加1滴受检血液或关节腔内积液，可用加样器吸头使其混匀，在酒精灯上稍微加热，促进反应，在8分钟内观察结果，凡在此时间内出现凝集者为阳性。也可以加入0.08-0.01ml不同的血液量，再加入1滴抗原，粗测血标本效价。玻片凝集的评价玻片凝集的评价虎红平板凝集试验和全血玻片凝集试验为初筛、定性凝集试验或半定性凝集试验，优点是较试管凝集试验操作更简便，检测迅速，尤其是虎红平板凝集试验是在酸化抗原基础上制备的带有色素的抗原制剂，经大量的研究资料证明，本法与常规血清学试验有较高的符合率，是人畜布氏菌防治工作中，广泛采用的一种筛选试验方法。但此两种平板试验，尤其是全血玻片凝集试验，可能出现非特异性凝集反应，在单以平板凝集反应诊断布氏菌病时，应考虑到此点，以免误诊。对阳性和疑似标本必须进行SAT确证，才能作为实验结果。RBT 注意事项抗原质量抗原质量被检血样被检血样反应板反应板结果观察和判定结果观察和判定记录记录报告报告诊断价值与意义诊断价值与意义与其它实验的关系与其它实验的关系 试管凝集(莱特试验)原理 在已知的特异性抗原布氏菌抗原的悬液中加入未知的被检患者血清，若患者血清中含有布氏菌抗体，抗原与抗体发生肉眼可见的凝集反应。可作为布氏菌病早期诊断方法，病人常于发烧的第1天起就开始出现凝集素，而且出现高滴度凝集素或凝集素滴度不断上升，不仅有很高的诊断意义，同时也可作为判定疾病活动性指标。目前，虽然出现了不少新的诊断布氏菌病的技术方法，但仍不能取代本试验方法，而这些新方法则是对本法的补充和完善。但是，作为单一的诊断方法是不完善的。从国内外的研究资料表明，仅用凝集反应对畜群进行多次检查，仍有许多布氏菌病病畜检查不出来；对部分慢性期布氏菌病患者得不出阳性反应结果；还有一些其他疾病患者，在血清学上与布氏菌病存在交叉凝集反应，因而做本试验是难于排除的。因而有必要做多种血清学实验检查，以便综合性判定，获得正确结果。除每份待捡血清需作1个血清对照，以排除血清的自然凝集外，每次试验尚需有1个抗原对照，以排除所用抗原的自然凝集。试管凝集(莱特试验)0.5ml抗原试管凝集反应操作示意图0.2ml血清2.3ml盐水0.5ml盐水0.5ml弃去0.50.50.50.50.50.50.5试管凝集(莱特试验)结果判定：效价以产生结果判定：效价以产生50%50%凝集（凝集（+凝集程凝集程度）血清最高稀释倍数为受检血清效价度）血清最高稀释倍数为受检血清效价试管凝集(莱特试验)试管凝集试验标准比浊管配制试管凝集试验标准比浊管配制试管凝集(莱特试验)诊断标准：诊断标准：1 1、人、牛、马、鹿等大家畜血清为、人、牛、马、鹿等大家畜血清为1 1：100100（+）及以上者为阳性，）及以上者为阳性，1:501:50（+）为）为可疑。可疑。2 2、对可疑反应的人或动物应在、对可疑反应的人或动物应在10-2510-25天内重天内重复检查，以便进一步确诊复检查，以便进一步确诊方法与临床：方法与临床：1 1、该法特异性较好，敏感性较高，适用于、该法特异性较好，敏感性较高，适用于检疫和临床诊断检疫和临床诊断 2 2、由于该方法有时出现前带现象和封闭、由于该方法有时出现前带现象和封闭现象，所以有时出现阴性结果，必要时和现象，所以有时出现阴性结果，必要时和其他方法联合应用其他方法联合应用试管凝集(莱特试验)试管凝集检测 Standard Tube Agglutination Test发病后不同月份的灵敏度(%)0-22-44-66SAT(1:100)79.564.476.950.61:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600发现凝集抗体（IgM和IgG)灵敏性随疾病持续时间下降顽固性和布病复发患者中表现不佳在本地流行地区/暴露个体中的特异性较低流行地区的建议取舍值为1：200，提高特异性导致的低灵敏度难以读取和标准化SAT 注意事项抗原稀释液定量对照温度结果判定记录报告单当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。应进行危害程度评估。危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的或未知传染性的生物材料）种类（已知的、未知的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。防和治疗。危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行。危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行。生物安全的评估注：a大量活菌操作：实验操作涉及大量活菌操作：实验操作涉及“大量大量”病原菌的病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、冻干等）。冻干等）。c样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。取、涂片、显微观察等初步检测活动。d非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。分子生物学、免疫学等实验。布鲁氏菌感染途径感染途径：吸入、皮肤粘膜污染、摄入等感染途径：吸入、皮肤粘膜污染、摄入等吸入感染：很多操作可产生气溶胶，如：感染动吸入感染：很多操作可产生气溶胶，如：感染动物的皮毛、粪便，烧接种环、抽真空、离心、搅物的皮毛、粪便，烧接种环、抽真空、离心、搅拌、研磨等，气溶胶拌、研磨等，气溶胶5um液滴核会悬浮于空中液滴核会悬浮于空中皮肤粘膜污染：含病原体的液体溅在眼睛、口鼻皮肤粘膜污染：含病原体的液体溅在眼睛、口鼻粘膜及其他皮肤感染粘膜及其他皮肤感染摄入感染：误食和不洗手吃食物摄入感染：误食和不洗手吃食物接种感染：接种感染：感染事件感染事件造成此次事故的原因：造成此次事故的原因：一是购买实验山羊时，相关教师未要求青喜养殖场一是购买实验山羊时，相关教师未要求青喜养殖场出具相关检疫合格证明；出具相关检疫合格证明；二是实验前相关教师未对实验山羊进行现场检疫；二是实验前相关教师未对实验山羊进行现场检疫；三是在三是在指导学生实验过程中，相关教师未能严格要指导学生实验过程中，相关教师未能严格要求学生遵守操作规程、进行有效防护。求学生遵守操作规程、进行有效防护。存在的问题职责不履行，不开展检测职责不履行，不开展检测培训不到位，未开展监督与指导培训不到位，未开展监督与指导操作不规范，未严格执行操作规程操作不规范，未严格执行操作规程防护不落实，未严格执行生物安全规定防护不落实，未严格执行生物安全规定 存在潜在感染的风险！存在潜在感染的风险！1、布鲁氏菌强毒菌株、疫苗菌株、弱毒菌株均可能造成人体感染，感染所需菌量会有较大差别。2、实验活动与实验室级别要求 布病血清学实验可以在BSL-1实验室进行 未知标本分离菌、少量菌株实验、弱毒菌株的实验在BSL-2实验室进行 布氏菌的抗原制备、菌种保存在BSL-3实验室生物安全要求布鲁氏菌病血清学实验的生物安全1 生物安全规定 BSL-12 实验的分类 灭活与否3 使用的标本 血清 全血 血浆 脑脊液4 血清中的布氏菌 未分离到 其它病原？5 血清中的核酸 难以测到 人间传染的病原微生物名录ICDC,China CDC布鲁氏菌病病原学实验生物安全布氏菌在病原微生物的危害等级划分；布氏菌在病原微生物的危害等级划分；二类二类属于高致病性属于高致病性实验室适用等级分类：实验室适用等级分类：BSL-3其中弱毒株或疫苗株可在其中弱毒株或疫苗株可在BSL-2实验室操作实验室操作小量标本，初代分离等在小量标本，初代分离等在BSL-2实验室操作实验室操作ICDC,China CDC 生物安全设备 生物安全柜生物安全柜吸吸附附垫垫：在操作台上放上贴有吸附材料的塑料薄膜，每日更换，可以把操作台的污染减少到最低程度。柜柜内内实实验验器器材材和和材材料料的的取取出出：生物安全实验室的废弃的污染性材料、使用过的包装材料、容器、纸张等废弃物，都收装好或者经高压灭菌器灭菌后拿到缓冲区：实验中或完毕后，必须从安全柜中取出非灭活的病原体时，应装好放在消毒液槽中，使容器外侧被消毒后取出，消毒液种类因病原体不同而异。生物安全设备回收容器回收容器：在安全柜内配置回收污染物质的容器：配置存放污染的玻璃器皿和废弃物容器。容器中必须配有消毒液，将污染物质完全浸没。这些回收容器至少每天操作完毕后盖好以防污染。再次使用时需重新配置消毒液。瓶瓶盖盖：安全柜内使用的瓶子不用橡胶塞，而用螺旋盖，开启时可减少气溶胶的发生。消消毒毒火火焰焰：用火焰消毒是经典的微生物学操作方法，但是顾虑使柜内气流紊乱，尽量不使用。良好的内务行为应指定专人监督保持良好的内务行为。工作区应时刻保持整洁有序。禁止在工作场所存放可能导致阻碍和绊倒危险的大量物品。所有用于处理污染性材料的设备和工作表面在每班工作结束、有任何漏出或发生了其他污染时应使用适当的试剂清洁和消毒。对漏出的样本或培养物应在风险评估后清除并对涉及区域去污染。清除时应使用恰当有效的安全预防措施、安全方法和个人防护装备。内务行为改变时应报告实验室负责人，以确保避免发生无意识的风险或危险。实验室行为、工作习惯或材料改变可能对内务和/或维护人员有潜在危险时，应报告实验室负责人，并书面告知内务和维护人员的管理者。应制定在发生事故或漏出导致生物、化学性污染时，设备保养或修理之前对设备去污染、净化和消毒的专用规程。良好的内务行为 离开微生物实验室前，脱掉工作服后，应进行手的清洗。离开生物安全2级和3级实验室时，脱防护服后再次用肥皂及流水冲洗手。消毒可使用0.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂，如新洁尔灭醇、75%医用酒精或60%的异丙醇等35ml擦于手指、手掌、手背，揉搓13分钟。良好的内务行为谢谢大家!