黄芩苷酯化物缓解H_(2)O_(2)诱导的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)氧化应激反应的研究.pdf
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1、1O-X1NO.17202360试验研究饲料研究FEEDRESEARCH黄芩苷酯化物缓解HO,诱导的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)氧化应激反应的研究孙心怡梁梅郭梦如武慧宁赵林露张进刘晓曦*(广东海洋大学滨海农业学院动物医学系,广东湛江52 40 0 0)摘要:试验旨在探讨黄苓苷酯化物(BE)对H,O,诱导的IPEC-J2细胞氧化应激的缓解作用及其分子机制。采用CCK-8法检测细胞活性筛选出黄苓苷酯化物的适用浓度;采用ELISA法检测细胞中活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量;采用qPCR法检测细胞中HO-1和NQO-1mRNA的表
2、达量;采用WB法检测胞浆Nrf2蛋白、胞核Nrf2蛋白和HO-1的蛋白表达水平;免疫荧光法检测Nrf2蛋白入核情况。结果显示,BE的适用浓度为10、2 0、40 mmol/L;与对照组相比,H,O,组中ROS、M D A 含量显著升高(P0.05);SO D、CA T 活性显著下降(P0.05);胞浆Nrf2蛋白与胞核Nrf2蛋白表达量显著升高(P0.05);H O-1mR NA 的表达量显著升高(P0.05);NQ O-1mR NA(P 0.0 5)表达量显著降低。与H,O,组相比,中、高剂量BE显著降低ROS、M D A 含量(P0.05);低、中、高剂量BE显著提高SOD、CAT活性(P
3、0.05);中剂量BE显著升高胞浆Nrf2蛋白的表达(P0.05);低、中、高剂量BE显著升高胞核Nrf2蛋白的表达(P0.05);中、高剂量BE显著升高HO-1mRNA的表达量(P0.05),低、中、高剂量均可显著升高HO-1蛋白表达;低、中、高剂量BE显著升高NQO-1mRNA表达量(P0.05)。研究表明,BE可以通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。关键词:氧化应激;黄苓苷酯化物;Nrf2信号通路;猪小肠上皮细胞中图分类号:S816.7文献标识码:A文章编号:10 0 2-2 8 13(2 0 2 3)17-0 0 6 0-0 6Doi:10.13557/ki.issn1002-28
4、13.2023.17.012Effect of baicalin ester on H,O2-induced oxidative stress in IPEC-J2 cellsSUNXin-yiLIANGMeiGUO Meng-ruWUHui-ningZHAOLin-luZHANGjinLIU XiaAbstract:The aim of the study was to investigate the effect of n-butyl baicalin on H,O,-induced oxidative stress inIPEC-J2 cells and its molecular me
5、chanism.The suitable concentration of n-butyl baicalin was determined by CCK-8assay.The levels of reactive oxygen species(ROS),the activity of superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT),andthe content of malondialdehyde(MDA)were detected by ELISA,and the mRNA expressions of HO-1 and NQO-1 weredetect
6、ed by qPCR.The expression levels of Nrf2 protein in cytoplasm,Nrf2 protein in nucleus and HO-1 were detected byWB method,and the entry of Nrf2 protein into nucleus was detected by immunofluorescence method.The results showedthat the suitable concentration of BE was 10,20,40 mmol/L.Compared with the
7、control group,the content of ROS andMDA in H,O,group were significantly increased(P0.05),the activity of SOD and CAT were significantly decreased(P0.05),the cytoplasmic Nrf2 protein and nucleus Nrf2 protein were significantly increased(P0.05),and the expressionof HO-1 mRNA was significantly increase
8、d(P0.05).The expression level of NQO-1 mRNA was significantly decreased(P0.05).Compared with H,O2 group,medium and high doses of BE significantly decreased ROS and MDA content(P0.05).Low,medium and high doses of BE significantly increased SOD and CAT activity(P0.05).Medium dose ofBE significantly in
9、creased the expression of Nrf2 protein(P0.05).Low,medium and high doses of BE significantly第一作者:孙心怡,硕士,研究方向为动物营养与饲料学。通信作者:刘晓曦,博士,讲师,硕士生导师。基金项目:国家青年科学基金项目(项目编号:319 0 2 314);广东海洋大学南海学者计划(项目编号:0 0 2 0 2 9 0 0 2 0 0 5);广东海洋大学博士启动费及研究生培养项目(项目编号:10 140 2/R17088);广东海洋大学兽医专业硕士点建设项目(项目编号:040401052201)收稿日期:2
10、0 2 3-0 2-11increased the expression of Nrf2 protein in nucleus(P0.05).Medium and high doses of BE significantlyincreased the expression level of HO-1 mRNA(P0.05),and low,medium and high doses of baicalinsignificantly increased the expression level of HO-lprotein.Low,medium and high doses of BEsigni
11、ficantly increased the expression level of NQO-1mRNA(P0.05).The study indicates that BE played anNO.172023饲料研究FEEDRESEARCH61试验研究antioxidant role by activating Nrf2 signaling pathway.Key words:oxidative stress;baicalin ester;Nrf2 signaling pathway;IPEC-J2仔猪断奶应激综合征是制约规模化养猪业发展的关键问题。仔猪断奶应激由氧化应激、炎症反应、肠道屏
12、障功能损伤引起,可造成养猪业经济损失。炎症是机体对外源病原入侵的抵抗反应,过度的炎症反应会使活性氧(ROS)含量升高。氧化应激是由ROS诱导产生的一种应激状态,可以引起细胞DNA损伤、细胞周期异常,导致细胞凋亡,对机体造成损害2 。肠道的氧化平衡状态对维持肠道黏膜的完整性、促进营养物质的吸收、调节肠黏膜的再生修复具有重要作用。为了缓解仔猪断奶应激综合征,可以采用抗生素进行治疗,但是抗生素的不规范使用会影响动物食品安全3)。中药提取物具有资源丰富、功能多样、经济环保、残留量小、耐药能力弱、副作用低等特性。中兽药在治疗畜禽疾病中起到重要作用4-5,研发高效植物提取物等新型绿色添加剂、新型中兽药等生
13、物制剂是目前面临的首要问题。目前,农业农村部已允许将黄芩提取物列入饲料添加剂名录。黄芩苷源于黄芩干燥的根部,属于黄酮类化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。黄酮类化合物具有溶解性差、生物利用率低等缺点8,导致黄酮类化合物在临床中的应用受到限制9-10 。以天然黄芩苷为底物进行酯化反应,酯化后形成的黄芩苷酯化物易通过细胞膜进入细胞内。目前,针对黄芩苷酯化物的研究较少,对于肠道炎症反应及氧化应激的治疗未见报道,具体的作用机制尚不明确。因此,本试验主要研究黄芩苷酯化物如何调控H,O,诱导的IPEC-J2细胞的氧化应激反应及作用机制。1材料与方法1.1试验材料85%黄芩苷(BAI)、I PEC
14、-J2 细胞购自北纳生物科技有限公司,黄芩苷酯化物(BE)采用8 5%的黄芩苷(购自湖北宏远达生物科技有限公司)与正丁醇通过酯化反应获得,黄芩苷正丁酯得率8 6%,30%H,0,溶液购自国药集团。1.2试验试剂试验中所用到的试剂见表1。1.3细胞分组及处理在Dulbecco改良培养基DMEM/F-12(1:1)碱性,C11330500BT,G i b c o,U SA J中培养猪肠上皮细胞IPEC-J2,培养基中补充10%胎牛血清(FBS),加入50 IU/mL青霉素和50 g/L链霉素(青霉素-链霉素,15140-12 2,Gibco,U SA),置于37 C和5%CO,的细胞培养箱中,培养
15、48 h。当细胞培养至7 0%时,利用BAI预处理2 4h后再利用10 mol/mLH,O,刺激IPEC-J2细胞1 h。为检测BE处理后的细胞活力,将铺满板的细胞变成悬浮液,将等数量的细胞接种在9 6 孔板中(无锡NEST生命科技有限公司),并在DMEM/F12培养基(含有10%FBS)中培养。生长达到8 0%后,使用PBS液洗涤细胞2 次,血清饥饿2 h,采用不同浓度的BE处理2 4h(10160mL/L),将10 L的CCK-8试剂(C0038,Dojindo,JPN)加入需要检测的孔中,将9 6 孔板置于37C、5%CO,的条件下培养1h,试验结束后将9 6 孔板放进酶标仪里测量450
16、 nm吸光度。表1试验试剂名称公司货号ROSELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-3284901SODELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-0389M2MDAELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-191601CATELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-3284902LabcomsTMLife Science苏木精、伊红染液公司Trizol reagentInvitrgen公司15596-026EasyScript One-StepgDNA Removal and北京全式金生物技术AE311cDNA Synthesis有限公司SuperMixEasyScriptGreenqPCR
17、北京全式金生物技术AQ101SuperMix有限公司上海碧云天生物技术RIPA蛋白裂解液PO013B有限公司Cell SignalingNrf2抗体#12721Technology公司Cell Signaling-actin抗体#4970Technology公司LaminB抗体abcam公司ab16048上海碧云天生物技术BCA试剂盒KGP1100有限公司HO-1抗体abcam公司EP1391Y江苏康为世纪生物科技SDS-PAGE试剂盒CW2384S股份有限公司注:“二”表示无货号。为确定BE处理后的细胞活力,将相同数量的IPEC-J2细胞接种在9 6 孔板中,在含有10%FBS的DMEM/F
18、12培养基中培养。IPEC-J2细胞生长到9 5%后,采用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞2 次,血清饥饿2h,采用不同浓度的BE(10 16 0,m m o l/L)处理细胞24h,血清饥饿2 h,采用10 mol/mLH,O,处理3h,接着向每孔加入10 LCCK-8试剂,将IPEC-J2细胞在37C、5%C O,的条件下孵育1h。采用酶标仪测量450nm吸光度。试验分组和药物处理见表2。NO.172023饲料研究FEEDRESEARCH62试验研究表2试验分组和药物处理组别药物处理对照组(CON)无处理模型组(H,O,)IPEC-J2(H,O,10 mol/mL)低剂量BE组IPEC-J
19、2(H,O,10 mol/mL)+10 mmol/L(L-BE)黄芩苷酯化物中剂量BE组IPEC-J2(H,O,10 mol/mL)+20 mmol/L(M-BE)黄芩苷酯化物高剂量BE组IPEC-J2(H,O,10 mol/mL)+40 mmol/L(H-BE)黄芩苷酯化物BAI组IPEC-J2(H,O,10 m o l/m L)+2 0 m m o l/L黄芩苷1.4酶联免疫吸附试验将IPEC-J2细胞在6 孔板中培养至8 0%,采用PBS洗涤细胞及不同浓度的BAI(10 40 m m o l/L)处理细胞24h,再用PBS洗涤细胞及10 mol/mLH,O,处理细胞1h后收集上清液。上清
20、液使用ELISA试剂盒测定ROS、MDA、SO D、C A T。1.5RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR使用Trizol试剂从IPEC-J2细胞中提取RNA,利用OD1000仪器测定RNA浓度。采用EasyScriptOne-StepgDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂将提取的RNA反转录成cDNA,使用EasyScriptGreenqPCRSuperMix试剂和特异性引物扩增cDNA。利用特异性引物在实时荧光定量PCR仪器中对mRNA进行扩增。最后对得出的数据进行分析整理。PCR引物序列见表3。表3荧光定量PCR引物序列基因引物序列(5 3
21、)Genebank登录号长度/bpF:TATGCTCTCCCTCACGCCATCC-actinAY550069220R:GTCACGCACGATTTCCCTCTCAGF:TGCTGAATGCCTGAATGCCTGTCHO-1NC_000074.780R:TCCTGCCTCCCTCAACTGTGTGF:TGTAGACCGGGTTCTCCTTGNQO-1NC_000074.7138R:TGAATTACATCTCTGTGGTTTA1.6蛋白测定利用RIPA裂解液以及核和细胞质蛋白提取试剂盒(KeyGEN,Bi o T ECH,K G P110 0,CH N)对 IPEC-J2细胞中蛋白进行提取。利用
22、BCA工作液(含A液与B液)测定蛋白的浓度,SDS-PAGE试剂盒分离蛋白,使用转膜仪将所需的蛋白转移至0.2 2 mPVDF膜上进行快速封闭。封闭结束后用1:10 0 0 比例稀释的一抗孵育膜进行孵育,再利用同样比例稀释的HRP标记的二抗孵育膜进行孵育,期间使用TBST对膜进行洗涤。最后对膜进行曝光,使用ECL检测系统对膜进行曝光显现印迹,并使用ChemiDocXRS+图像分析仪进行蛋白质的定量。1.7免疫荧光将生长到约50%的IPEC-J2细胞在冰上利用4%多聚甲醛处理IPEC-J2细胞15min,利用PBS洗涤细胞3次,0.2%tritionx-100透化5min,再利用PBS洗涤3次,
23、1%胎牛血清(BSA)封闭30 min。在冰上利用1:10 0 稀释的一抗、HO-1孵育过夜,利用PBS洗涤3次,滴加1:10 0 稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)(7 15-0 6 5-151,英国杰克逊免疫研究)在37 孵育1h。对细胞利用PBS洗涤细胞3次,并滴加1:10 0 稀释的a594-sav(0 16-580-084,英国杰克逊免疫研究)在37 孵育1h,对细胞利用PBS洗涤3次。在室温下滴加1:50 0 稀释的DAPI3min,在共聚焦显微镜上进行IPEC-J2细胞的图像1.8数据统计与分析数据使用SPSS12.0进行单因素方差分析,Tukey法进行多重比较。结果以“平均值标准误
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