基于APP_PS1双转基因小鼠与野生型小鼠比较综述学习记忆相关行为学实验优缺点和注意事项.pdf

年 月第 卷 第 期中国实验动物学报 尚培骏，姬乃春，杨锦雯，等 基于 双转基因小鼠与野生型小鼠比较综述学习记忆相关行为学实验优缺点和注意事项 中国实验动物学报，（）：，（）：基金项目国家自然科学基金青年项目（），陕西省高校科协青年人才托举计划（），国家级大学生创新创业训练计划项目（），年陕西省自然科学基础研究计划资助项目（）。（），（），（），（）作者简介尚培骏（），男，在读本科生，研究方向：阿尔茨海默病。：；姬乃春（），男，硕士，研究方向：运动与衰老。：。共同第一作者通信作者张晓华（），女，博士，研究方向：阿尔茨海默病。：基于 双转基因小鼠与野生型小鼠比较综述学习记忆相关行为学实验优缺点和注意事项尚培骏，姬乃春，杨锦雯，赵沅杰，拓振杰，张晓华（西安医学院公共卫生学院，西安；陕西省脑疾病防治重点实验室 西安医学院运动健康研究中心，西安；厦门大学神经科学研究所 福建省神经退行性疾病及衰老研究重点实验室，福建 厦门）【摘要】目的 根据 转基因 模型小鼠和野生型小鼠在多种行为学实验中的表现，比较各行为学实验优缺点，并归纳其方法、注意事项、评价指标和应用特点，为研究动物认知相关行为学提供依据。方法采用 迷宫、型 迷宫、型 迷宫、新物体识别、旷场、转棒疲劳仪等实验，检测 月龄和 月龄 转基因小鼠与野生型小鼠运动能力、探索行为、学习与记忆能力、新物体识别能力、活跃性、对旷场的畏惧程度以及中枢协调能力差别。结果 转基因小鼠的工作记忆能力显著低于同月龄 小鼠，表现为在 迷宫内，月龄的自主返回率显著增加，且 月龄 小鼠的自主交替率和自主返回率较 月龄 小鼠显著下降，小鼠没有看到这种变化。月龄 小鼠在 型 迷宫（奖赏型）中得分和记忆时间较 小鼠显著下降，在型 迷宫（惩罚型）中学习时间显著增加，说明 小鼠的学习能力弱于 小鼠，且记忆提取较慢，正确率较低。在旷场实验中，月龄 小鼠运动距离和速度较同月龄野生型小鼠显著下降。小鼠进入中心区的次数和中心区 周围区时间比显著下降，直立次数也显著下降，说明了 小鼠的探索行为较同月龄野生型小鼠显著下降，对旷场的畏惧程度更高。并未发现 和 小鼠在转棒疲劳仪掉落时间方面的差异，说明中枢协调能力无显著性差异。结论 迷宫操作简单、受干扰小、实验周期短，但单只动物实验时间较长，适用于检测工作记忆；迷宫符合小鼠的探索天性，可以最为准确测定小鼠学习与记忆能力，反映记忆的提取能力，但实验周期长；新物体识别实验利用小鼠对新物体的好奇心态，精准反映小鼠识物记忆的能力，但实验器材操作较为繁琐，且易受动物应激行为影响；旷场实验利用动物畏惧空旷场地的特性以及对新环境的好奇心，主要用来测定小鼠运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度，但实验结果易受小鼠紧张度影响；转棒疲劳实验直观地反映了小鼠的身体协调性和抗疲劳能力，间接反映小鼠的昼夜规律，适合作为检测学习记忆能力的辅助指标。【关键词】转基因小鼠；阿尔茨海默病；动物行为学；学习记忆【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（），中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，（，）：【】（），（），（），；，；，【】；：动物行为学实验为研究大脑认知功能、情绪功能和相关病理生理学提供重要依据，现已成为神经病理学理论重要支撑之一。不同于人类的认知功能可通过读写等直观方式反映，动物的认知功能需要通过测量其学习记忆等方面体现进行评价。在众多实验动物中，小鼠等啮齿类动物因其喜欢探索陌生事物和环境的天性，成为典型动物行为学模型之一。在行为学实验过程中，实验者可借助实验器材创造多种合适的刺激点与刺激条件，以便更好地观测小鼠运动能力、探索行为、学习记忆行为等，进而帮助研究基因工程小鼠的学习记忆能力、观察小鼠的用药反应情况、评价药物的安全性和可靠性，为研究疾病发病机制等提供重要依据。目前，学习记忆相关行为已被认为是探索人类神经系统疾病最简单、直接且安全的研究方法。随着记忆学研究的快速发展，学习记忆理论不断涌现，实验动物模型发展道路也在不断向前，各类型记忆被不断地发现、定义，为神经生理学和心理学提供研究基础。目前主要的学习记忆相关行为学方法包括各种迷宫、旷场实验、新物体识别实验、情景恐中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，惧实验、转棒疲劳实验等。但究竟在何种情况下采用何种实验方法没有精确地划分。柳叶刀 年发布的一项报告显示，全球约有 万人患有痴呆症，预计这一数字到 年将增加到 亿。目前 岁以上老年人患有阿尔茨海默病（，）的比例约占，岁以上的老年人患病比例更是高达。双转基因小鼠是 主要的动物模型之一，该小鼠表达突变的人类早老素（，）（）和 人 鼠 淀 粉 样 前 蛋 白 融 合 体（），这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动。基因是 病理症状之一老年斑成分人淀粉样蛋白（，）的前体蛋白。人类早老素基因 突变是该基因的第 个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。因此，为了探索学习记忆相关行为学的特点，本研究通过分析对比 小鼠和野生型小鼠在不同行为学实验中的运动能力、新物体识别能力以及学习与记忆能力的表现，综合各实验的优缺点和评价指标，阐述各种行为学实验的特点和应用特点，为研究者采取合理的行为学实验方法提供更好的理论依据。材料与方法 材料 实验动物 级 背景的 双转基因健康小鼠和野生型 雄性健康小鼠，月龄各 只、月龄各 只；月龄体重 ；月龄体重 ，购于北京华阜康生物科技有限公司【（京）】，饲养于西安医学院实验动物中心【（陕）】，环境温度维持（），光照循环。除 迷宫实验期间进行饥饿处理外，小鼠其余时间均自由采食、饮水。动物行为学实验全程在西安医学院 级动物行为室进行，遵循实验动物福利伦理审查指南【】，经西安医学院动物伦理委员会审批（）。主要试剂与仪器、引 物（金 斯 瑞，、），（生工，），琼脂糖（吉至，），核酸燃料（碧云天，），缓冲液（碧云天，），（赛 默 飞，），新洁尔灭（利尔康，），乙醇（利尔康，），蒸馏水。迷宫（，）、迷宫（，）、新物体识别探索箱（，）、旷 场 箱（，）、疲劳转棒仪（众实科技，），动物运动轨迹跟踪系统（）、小动物行为学视频记录与分析系统（），摄像头（，）。方法 迷宫 迷宫是基于啮齿动物对新环境的自发探索能力而设计的实验装置，由三个完全相同的臂组成、三个臂之间为 夹角，呈 字形分布（如图）。小鼠在前一次的记忆基础上做出下一次进臂选择，令其不断进出各个臂，是测量动物学习记忆能力的典型方法。根据分析小鼠探索进入各臂的次数、顺序 进 而 反 映 实 验 动 物 的 瞬 时 记 忆 能 力（）。相比于其他实验方法，迷宫更加偏向于工作记忆，在加工存储短时间内记忆的能力有更为直观地表现，较为简便且无需动物学习任何规则来进行趋利避害，有一定的实用性。实验选用 月龄、月龄的 小鼠与 小鼠各 只进行实验，实验开始随机选取一臂为起始臂并将小鼠放置于起始臂末，让小鼠进行自由探索，记录小鼠运动轨迹与进臂次数，记录小鼠运动轨迹的自主交替进臂数（，如）：计算自主交替率，即 （）、在探索结束一臂后返回上一探索臂的自主返回数（，如）以及在两次连续探索同一臂的自主重复数（）的自主返回率和自主重复率。注意事项：（）迷宫三臂内部各有不同标记，协助小鼠分辨三臂。（）每组小鼠随机从不同的起始臂进入，每只小鼠实验完成后需用乙醇、新洁尔灭、蒸馏水依次擦拭迷宫，消除因上一只小鼠气味遗留造成的影响。（）实验期间实验人员切勿随意走动，切勿移动实验设备或发出噪音。（）小鼠行为学实验期间，应保持室内环境接近饲养环境温度，过高或过低会导致小鼠产生烦躁或战栗，使其拒绝探索。（）以小鼠尾根进入虚线位置（见图 虚线）为进臂标准。迷宫 迷宫由一起始臂以及两对称的目标臂构成，中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，图 迷宫示意图 起始臂（）和目标臂（）夹角。相较于其他实验，迷宫利用动物觅食行为和对周围环境探索的习性，在测定动物学习与记忆能力中的长时记忆方面拥有更高的准确性。实验以小鼠是否选择正确目标臂为标准，对小鼠的学习和记忆能力进行评判。迷宫通常用来研究动物的空间工作记忆（），即测定动物在一定规则下对有用的信息的记忆存储及提取。经改进后的 迷宫实验方法也可用来评价参考记忆（），即小鼠自己与记忆产生联系后，探究小鼠行为与记忆之间的相互影响。常见的 迷宫有诱导探索型实验（型 迷宫）与惩罚型实验（型 迷宫）两种。图 迷宫示意图 型 迷宫，通过借助食饵，诱导小鼠探索迷宫。诱导探索阶段，在迷宫各臂放置 个食饵，诱导小鼠探索迷宫，适应。待小鼠完全适应迷宫之后，在两目标臂末端放置食饵后随机关闭一臂（如图 单虚线）。实验选用 月龄 小鼠和 小鼠各 只进行实验，实验开始将小鼠放于起始臂末端开始计时，让小鼠自由觅食，直至小鼠接触食饵，停止计时，此段时间记为训练时间；待小鼠离开食饵区域，将小鼠带离迷宫，一段时间后（适应阶段间隔 ，实验阶段第 次间隔 、第 次间隔 重复实验）将小鼠重新放回起始臂，打开封闭臂闸门，让小鼠自由探索，在新的、有食饵的臂（即原封闭臂）和旧的、无食饵的臂进行选择，以第 次进入目标臂为评判标准，若进入原封闭臂记得分为，反之为；在接触食饵后停止计时，记为记忆时间。后再测试一轮。型 迷宫实验存在特殊的惩罚机制。实验适应阶段，让小鼠在 迷宫内自由探索 ，每天。在小鼠熟悉迷宫之后，第 天让每只小鼠自主探索 迷宫 次，记录进入次数多的一侧，并记为偏好臂。选用 月龄 小鼠和 小鼠各 只进行实验，实验开始，将各小鼠对应偏好臂闸门关闭，迷宫另一臂末端放置食饵。第一步将小鼠放于起始臂末端让小鼠自由探索且开始计时，直至小鼠接触食饵，停止计时并记此段时间为学习时间；间隔 后，将小鼠重新放回起始臂末端，打开偏好臂闸门并开始计时，若小鼠进入非偏好臂（放置食饵的臂）则计得分为，若小鼠进入偏好臂，计得分为，并且关闭偏好臂闸门惩罚小鼠，后打开闸门并继续记录进入非偏好臂次数，直至再次触碰非偏好臂食饵停止计时，记此时间段为记忆时间。注意事项：（）诱导时应选择气味较小的食饵，避免小鼠以嗅觉取代记忆引起实验误差。（）食饵体积不宜过小，搁置在每臂中央，便于小鼠发现食饵。（）型 迷宫中小鼠 内未探索或型 迷宫小鼠 内未探索则排除此次实验。（）每组实验完成后，待小鼠停止进食后再将小鼠取出，避免小鼠受到惊吓造成后续实验误差，每只小鼠做完一轮实验要采用新洁尔灭、乙醇和水分别擦拭迷宫。（）以小鼠尾根部为标准评判是否进臂。新物体识别新物体识别实验是基于人类患有失忆症时识别环境的差异而发展起来的，用于评价啮齿动物的新物体识别记忆能力与识物记忆。本实验基于小鼠在新环境下自由探索的习性和对新物体的好奇心。该实验无需像迷宫实验，以食物为介控制小鼠，也不需要像转棒疲劳实验一样强制小鼠运动，完全依靠小鼠在密闭空间下的自由探索能力，发现周围环境变化。在小鼠自由记忆的情况下，更能模拟人类学习、记忆的行为，借此用来评估改善记忆药物的效果。实验选用 月龄、月龄 和 小鼠各 只进行实验，实验分为适应阶段和测试阶段。在适中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，应阶段之前，需进行 的熟悉过程。实验人员每天将小鼠放到手上抚触 ，借此消除小鼠紧张恐惧感，并熟悉实验者气味。实验开始前，剔除活动异常小鼠（活动过少、活动过多、转圈等），符合标准的小鼠在无物体箱体中每天自由探索 ，待 后小鼠熟悉实验箱体内环境，正式开始实验，实验步骤如下。实验开始：阶段，分别在箱体底板对角放置两完全相同的物体、，将小鼠放入密闭环境的箱体中，让小鼠在、两物体周围探索时间累计 （以鼻尖凑近物体约 为标准），或 内探索时间还不到 则停止探索，将小鼠放回饲养笼，停止 阶段。、后分别开始短期、长期 阶段测试，将其中一个物体换成新的物体，物体放置位置不变，再次将小鼠放入箱体进行探索，当小鼠在、两物体周围探索时间累计，或 内探索时间还不到 则停止探索，将小鼠放回饲养笼，停止 阶段，见图。图 新物体识别实验示意图 注意事项：（）探索物体的时间需要根据小鼠的学习能力摸索，与年龄和基因型密切相关。（）物体可以选择不同材质、形状和颜色；具有一定重量，防止小鼠推翻；应保证新旧物体存在差异；避免选择太过鲜艳的颜色，如橙色。（）每只动物实验完成后需擦拭粪便尿液，因实验在密闭空间内进行，在清洁箱体时切勿用乙醇等刺激性试剂擦拭。（）每组实验完毕后，先取出物体，后取出小鼠，减少对动物的刺激。旷场实验旷场实验常用于检测啮齿动物运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度。自 世纪 年代被学者发明以来，旷场实验已经被广泛应用到神经生物学研究与生物节律当中。旷场实验一方面利用了动物畏惧空旷场地的天性，激发动物趋利避害的内在特点，用来评价小鼠的运动和情绪行为。另一方面，利用小鼠在好奇心的驱使下探索新环境，旷场也为新物体识别实验的建立提供一定的前提基础。选用 月龄 小鼠和 小鼠各 只进行实验，实验开始前，实验人员应消除小鼠的恐惧。实验开始将小鼠放入箱体 ，摄像头记录行动轨迹。通过软件分析其在中央区与周边区逗留时间、速度和运动距离，以及直立次数和理毛行为等，见图。图 旷场实验示意图 转棒疲劳实验转棒疲劳实验为检测啮齿动物运动功能、抗疲劳能力和昼夜节律提供了方法，主要用于运动协调性、平衡感测试、抗疲劳药物筛选和鉴定，也可间接反映动物的昼夜节律。实验期间，当动物被放置在滚筒中央的转棒上时，为避免滑落，需调整平衡，随转棒转动而跑动。通过测量动物在滚筒上行走的时间来评定实验对象的中枢神经系统疾病。转棒疲劳仪以动物运动时间作为实验指标，若动物掉落，仪器将自动记录动物在转棒上的坚持时间以及滑落瞬间转棒的速度。因小鼠的协调性由小鼠的中枢神经系统决定，协调性越差的小鼠会在越短时间内从转棒下掉落。转棒疲劳仪运动能力在帕金森病、酒精依赖、亨廷顿病、智力发育、运动失调和阿尔茨海默病的药物评价等研究上，被认为是非常重要的检测指标。实验选用 月龄、月龄 和 小鼠各 只进行实验，实验适应阶段分为三个阶段，三个阶段间无时间间隙：阶段，转棒以加速度 从静止开始匀加速至速度为 ；阶段，更改加速度为 ，加速至 后匀速转动 ；阶段，继续以加速度 加速至 后继续匀速 。若小鼠在测试过程中掉落，记录掉落时间，待 后重新对掉落小鼠开始实验，记录小鼠在转棒上持续的时间。小鼠在进行适应实验期间训练小鼠体力，加强小鼠协调能力。正式实验阶段，、各阶段加速度不中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，变，结束时匀速速度分别达到 、，记录小鼠在转棒持续时间。注意事项：（）测试期间，舍弃连续 次以上实验失败的小鼠。（）待小鼠稳定站立在转棒上时开始实验。（）选择拥有高摩擦系数的转棒材质。小鼠的培育实验 所 用 双 转 基 因 小 鼠 品 系 为（），该小鼠携带小鼠朊病毒蛋白启动子启动下的突变的人早老素基因（）和人鼠淀粉样前蛋白（）融合体，其中 的 突变是该基因的第 个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。设计了 和 的引物，序列如表，进行基因鉴定。该小鼠在大约 个月皮层开始出现淀粉样斑块，在大约 个月时海马中出现淀粉样斑块，并且随着年龄的增长而增加大小和数量。表 小鼠引物序列 基因名称 引物序列 退火温度（）（）片段大小（）（）循环次数：基因鉴定实验用、，两种引物对小鼠的基因型进行鉴定，当小鼠共同表达 基因时，鉴定为 双转基因。小鼠使用双面耳标进行序列编号，以鼠尾为标本提取。（）组织的消化将 与 按 配制，充分混合后向含有样本的 管内加入 新鲜消化液，金属浴 水浴反应 （确保鼠尾完全浸入消化液中），后将样本在 金属浴 水浴中孵育 以灭活反应蛋白酶。以 离心 后取含有 的上清液为 模板。（）的扩增反应体系在配置过程中，最好处于低温情况下，以确保 扩增的效率以及特异性。配置比例（见表）。将上述配置好的样本进行 扩增，程序为（见图）：预变性 （次循环）；变性 ，退火 ，延伸 （次循环）；充分延伸 （次循环）；扩增结束 保持。（）琼脂糖凝胶电泳在 溶液中加入 琼脂糖，微波加热充分溶解后，待冷却至 时加入核酸染料，充分混匀后倒入模具。凝固后浸入含有 溶液的电解槽中待用；扩增产物与 缓冲液混合后以 每孔上样，上样完毕后以 恒压电泳。表 反应体系的配置 试剂 反应体系（）（）反应体系（）（）正向引物（）（）反向引物（）（）模板（）（）图 扩增程序 以上各种实验方法的设备、评价指标、应用特点的比较见表，各种行为学实验方法的优缺点比较见表。中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，表 不同行为学实验方法及指标列表 名称实验设备规格 评价指标 应用特点 迷宫 迷宫各臂夹角，每一臂尺寸 （长 宽 高）。（）不同 进 臂 方 式 次 数：统 计 小 鼠 自 主 交 替 进 臂 数（）；自主返回进臂数（）；自主重复进臂数（）。计算 种实验结果反应率：反应率（）（各结果出现次数 总进臂次数）。（）：（）评价环境工作记忆。型 迷宫 型 迷宫 迷宫由两个长 、宽、高 的目标臂（）和一个与之垂直的长 、同样宽度与高 度 的 起 始 臂（）组成。（，）（）得分标准：小鼠进入是否原目标臂。学习时间：在关闭一侧闸门时小鼠第 次触碰食饵的时间。记忆时间：打开闸门后小鼠第 次触碰食饵的时间。：得分：小鼠是否进入非偏好臂。错误次数：小鼠进入偏好臂的次数。学习时间：小鼠第 次触碰食物所用时间。惩罚：若小鼠进入偏好臂，则关闭闸门惩罚 。记忆时间：测试阶段进入起始臂直至触碰食饵的时间。：，：评价学习与记忆能力，以及记忆的存储与提取。，新物体识别实验 旷场实验 新物体识别 旷场实验封闭仓底面为边长 的正方形，侧箱高为 ，顶部有摄像头用于记录。短期测试：在 阶段结束 （甚至更短时间）后开始 阶段。长期测试：在 阶段结束 后开始 阶段。统计小鼠在 阶段在探索新物体耗费的时间比例（探索新物体时间 探索新旧物体总时间）。：（）：（）评价新物体识别能力与识物记忆。对比在中央区与周边区的移动距离与速度。进入旷场中心区的次数。中心旷场时间与周围区域时间比。直立次数。评价运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度。，转棒疲劳实验 转棒直径：转棒长度：转速范围：带微机数据接口调整度：。：。得分：小鼠在阶段时间内未掉下转棒视为成功。掉落时间：小鼠在转棒上持续运动的时间。：，：评价中枢神经协调能力。中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，表 不同行为学实验的优缺点比较 名称优点缺点 迷宫（）利用啮齿动物对新异环境的天然探索的自然习性，不需要动物学习任何的规则来趋利避害，能够有效的反映小鼠对环境的记忆能力。（）人为干预少，简单方便。（）实验周期最短。（），（），（）（）虽实验周期短，但单次实验耗费时间长。（）小鼠个体差别较大，进入臂次数差异较大。（）在 个臂交汇处需要仔细观察小鼠尾根，否则容易产生误差。（），（），（）型 迷宫 型 迷宫 在测定、训练动物长时记忆方面拥有更高的准确性，包括记忆 的 存 储 和提取。，（）适应期间撒食饵，诱导小鼠探索，加快了小鼠对迷宫的熟悉速度。（）重复 次实验，可以更好的检测小鼠的短期学习记忆能力的同 时，也 更 有 利 于 加 深 小 鼠记忆。（），（），小鼠因警惕心理，拒绝在发现食物的第一时间进食，影响实验者对时间指标的评判。，（）惩罚条件可以让小鼠更快了解到自己的错误，并进行行为更正，加深记忆。（）偏好臂的设置规避了小鼠主观性跑向某臂的结果。（）（）（）小鼠可能存在不愿主动探索迷宫的情况。（）惩罚机制会使某些小鼠受到惊吓，增加实验误差。（）（）迷宫只有一个选择点到达目标臂，则选择正确臂的概率默认为，无法排除小鼠误打误撞得分的情况，增加了成功的可能性。，新物体识别实验（）可以让动物在完全自然的状态下进行学习记忆测试，能够更好地模拟人类和灵长类动物的学习记忆行为。（）实验步骤少，实验时间相对较短。（），（）旷场实验（）利用了动物畏惧空旷场地的天性，激发动物趋利避害的内在特点。（）单次实验便可得出鼠的自发活动与探索行为数据。（）无需任何训练。（）（）（）（）实验箱体对小鼠影响较大，如方形行为箱的角落易造成小鼠的角落效应，使小鼠主观上拒绝进行新物体识别。（）实验器材在各种实验中最为复杂，前期准备工作较多，需要精准的跟踪和记录系统。（）相较于其他实验器材较难清理。（），（），（）转棒疲劳实验 （）适用范围广，可做疲劳测试、中枢神经功能以及运动行为。（）实验过程简单，无复杂的程序以及繁杂的准备工作。（），（）（）实验耗时长。（）小鼠个体差异较大。（）因小鼠活动习性，须在晚上暗条件下进行。（）（）（），中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，统计学分析所有数据均用平均数 标准误差（）表示，数据分析采用 软件，数据通过 检验（或 非参数检验），当 为具有显著性差异，作图采用 软件。图 鉴定结果 图 基因型鉴定结果 结果 小鼠基因鉴定裂解鼠尾提取，经 和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型，核酸凝胶成像结果显示，内参条带在 ，基因条带在 ，基因条带在 ，结果见图，可以看到编号为、和 小鼠为 双转基因小鼠，其余为野生型小鼠。和 小鼠的工作记忆存在差异且均随月龄增大呈下降趋势 迷宫可以测试小鼠的工作记忆能力。月龄 小鼠相比于 小鼠在自主返回率更高，有显著性差异性（，图），说明同月龄 小鼠工作记忆能力较 小鼠差；此外，月龄 小鼠的自主交替率较 月龄小鼠显著降低（，图），自主返回率频率显著增加（，图），小鼠的自主交替率频率也随月龄增加而减少，自主重复率频率随月龄增加而增加，但无显著性差异，见图。以上结果表明，六月龄 和 小鼠工作记忆能力有差异，且 小鼠随月龄增加工作记忆下降更为明显。和 小鼠的记忆存储和提取能力具有显著性差异 迷宫可以同时测试小鼠的学习和记忆能力，中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，图 基因型鉴定结果 注：月龄 小鼠和 小鼠对比；：月龄 小鼠和 小鼠对比；：两种小鼠不同月龄前后比较。与 组相比，。（下图同）图 月龄和 月龄 小鼠和 小鼠 迷宫差异比较 ，（）能够反映记忆的存储和提取。基于型 迷宫实验，发现 月龄 小鼠在学习阶段的第 天记忆时间显著长于 小鼠（，图）；在测试阶段，第 天记忆时间显著长于 小鼠（，图），说明小鼠在第 次学习和记忆环境下更敏感。的测试阶段，小鼠在得分率方面均显著低于 小鼠（，图，）。说明 和 小鼠在学习与记忆时间和准确率之间存在差异，小鼠记忆提取能力显著低于 小鼠。基于型 迷宫，和 两种小鼠在记忆时间方面未出现显著性差异，但学习方面，小鼠学习时间长于 小鼠（，图，）；和 小鼠在得分率无明显差别，见图。综上，和 小鼠在记忆的存储和提取方面存在差异，小鼠较 小鼠记忆存储时间显著增加，记忆提取时间增加，记忆准确率降低。和 小鼠的新物体识别能力与识物记忆无明显差异新物体识别实验可以测试小鼠的识物记忆，结果发现，无论是 月龄还是 月龄小鼠，和 小鼠对新物体识别记忆均无显著性差异（），见图。这与文献报告不同，可能是因为学习阶段时长过短或者学习阶段和测试阶段的时间间隔不同引起的。和 小鼠的运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度均存在差异旷场实验着重于研究小鼠在密闭空间内的运中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，注：月龄 小鼠与 小鼠在型 迷宫中第 天训练阶段（学习与测试间隔）两次学习时间、记忆时间；、：型 迷宫中 小鼠与 小鼠测试阶段第 天（间隔）和第 天实验（间隔）两次学习时间、记忆时间；、：月龄 小鼠与 小鼠在型 迷宫测试阶段第 天和第 天得分；：月龄 小鼠与 小鼠在型 迷宫平均得分；：月龄 小鼠与 小鼠在型 迷宫中测试阶段学习时间、记忆时间；与 组相比，。（下图同）图 迷宫内学习时间、记忆时间与得分 、（，），（）中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，注：，：月龄和 月龄 小鼠和 小鼠探索两个相同物体的识别参数；，：月龄和 月龄 小鼠和 小鼠探索新物体识别参数。图 月龄和 月龄 和 新物体识别实验识别参数，动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度。实验表明：小鼠的运动能力比同月龄 小鼠弱，表现在规定时间内的运动距离显著低于 小鼠（，图）；因两种小鼠移动速度也存在显著性差异（，图），所以说明 小鼠活跃性也比同月龄 小鼠的低；与图 月龄 和 小鼠在旷场实验的表现 小鼠比较，小鼠进入中心旷场的次数同显著降低（，图），且 小鼠待在旷场中央区时间与周围区域时间比显著低于 小鼠（，图），可得出结论，小鼠对旷场的畏惧程度高于 小鼠。另外，小鼠的直立次数显著低 于 小 鼠（，图），说明 小鼠较 小鼠的探索能力更弱，更容易对旷场产生畏惧和焦虑，见图。综上所述，小鼠的的运动能力、探索能力、活跃性较 小鼠更差。中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，和 小鼠中枢协调能力无明显差异转棒疲劳实验主要检测小鼠的中枢协调能力，经实验，并未发现 和 小鼠在转棒掉落时间方面的差异，说明中枢协调能力无显著性差异（），见图。这可能是因为转棒疲劳仪更适用于检测小鼠的与运动协调性相关的神经系统疾病如亨廷顿舞蹈症和帕金森病，在学习与记忆方面仅可能作为辅助或参考指标。注：月龄 小鼠和 小鼠适应阶段掉落时间对比；：月龄 小鼠和 小鼠测试阶段掉落时间对比；：月龄 小鼠和 小鼠适应阶段掉落时间对比；：月龄 小鼠和 小鼠测试阶段掉落时间对比。图 转棒疲劳实验掉落时间 讨论动物行为学实验在药理学中已被视为基础实验方法，同时也越来越多的被应用在精神生理学及精神病理学的基础研究中，如在帕金森病症、酒精依赖综合征、亨廷顿病、智力发育、运动失调和阿尔茨海默病的发病机制研究领域发挥重要作用。因此，了解和总结各种行为学实验的特点和适用范围非常关键，能够帮助研究者选择更科学和精准的方法观察小鼠的行为学。本文作者采用 双转基因小鼠与野生型小鼠两种动物，比较验证学习记忆相关行为学实验特点、优缺点、注意事项和应用。采用 迷宫、迷宫、新物体识别、旷场实验以及转棒疲劳实验对两种小鼠进行全面的对比分析。种行为学实验各有测试偏重，迷宫测试工作记忆，迷宫可以测试学习与记忆能力，特别能够反映记忆的存储和提取，新物体识别测试小鼠的新物体识别能力与识物记忆，旷场测试运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度，转棒疲劳测试中枢协调能力。经研究发现，雌性小鼠因受雌激素影响，在行为学实验中，经常表现出异常的行为，如潜伏期过长、易焦虑等情况，通常情况下，行为学实验选择雄性小鼠会使实验结果更加稳定。基于 双转基因小鼠与 小鼠实验比较发现，在 迷宫中，同月龄的 小鼠与 小鼠的工作记忆能力有明显差异，小鼠较 小鼠自主交替率显著降低，以及自主返回率显著增加。对比不同月龄的同类型小鼠发现，两种小鼠的工作记忆能力均随月龄增加而下降，且 小鼠相比于 小鼠下降更明显。说明 小鼠工作记忆能力显著低于 小鼠。在 迷宫中，小鼠相比于 小鼠的学习记忆能力差，表现为记忆的存储和提取较慢，提取的准确率较差，这与以往的报道是一致的。在新物体识别实验中，对比两种小鼠的新物体识别能力，通过对比两种小鼠的短时识物记忆和长时识物记忆两个方面，并未发现显著性差异，这与文献报道不一致，这可能与学习和测试阶段的间隔时长存在密切关系，测试和训练阶段间隔 ，可能两种小鼠的都遗忘了对旧物体的识别记忆。在旷场实验中，小鼠的运动能力、探索能力和活跃性均中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，显著高于 小鼠，对旷场的畏惧程度和焦虑程度低于 小鼠，也存在显著差异性。在转棒疲劳实验中，小鼠与 小鼠的中枢协调能力无显著差异性。现如今，越来越多的动物行为学模型被广泛应用到神经系统疾病和药理学实验中，这些模型都尽可能去贴合小鼠生性习惯，对多种动物的研究和药品应用提供路径。研究对比了 种学习记忆相关行为学的特点、优缺点、注意事项和应用，发现 迷宫反映小鼠自发的探索行为，是工作记忆的最佳和最便捷的检测方法；迷宫对学习记忆的检测更为敏感和细致，能反映记忆的存储和提取；新物体识别实验可能需要更好的摸索学习和测试阶段的时间间隔，并且需要精确的跟踪和识别系统；旷场实验可以作为学习记忆、运动能力、畏惧焦虑行为的综合指标，可以放在一系列行为学实验设计的最开始阶段，便于观察者对动物行为有大致的了解；转棒疲劳实验更适合与运动协调能力相关的神经系统疾病，如帕金森病、亨廷顿病等。综上，为有关神经系统疾病行为学实验的选择提供了理论基础、方法借鉴和参考标准。参 考 文 献（）王萌萌，米佳，王国强，等 芪枝渴痹通方对糖尿病小鼠行为学与坐骨神经病理学的影响 中华中医药杂志，（）：，（）：贾秀英 动物行为学的形成与发展 杭州教育学院学报，（）：，（）：劳荃蘅，刘雷，刘民 试析实验动物学教学与科研的发展方向 赤峰学院学报（自然科学版），（）：，（），（）：陈霄，严隽陶，尹露，等 丰富环境对抑郁大鼠行为学及海马 区脑源性神经营养因子、酪氨酸激酶受体 蛋白表达的影响 中国康复医学杂志，（）：，（）：姜宁，张亦文，姚彩虹，等 大小鼠抑郁行为实验方法概述 中国实验动物学报，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：石辉，原丽，张军，等 双转基因阿尔茨海默病模型小鼠的行为学及病理学特征研究 神经解剖学杂志，（）：，（）：，（）：韩引秀，陈征，崔珍，等 不同月龄对雌性 大鼠学习记忆相关行为及海马 表达的影响 安徽医科大学学报，（）：，（）：，（）：王跃春，王子栋，孙黎明，等 动物学习记忆能力的 型迷宫测试法 暨南大学学报（自然科学与医学版），（）：，（），（）：，：，中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，（）：杨玉洁，李玉姣，李杉杉，等 用于评价大小鼠学习记忆能力的迷宫实验方法比较 中国比较医学杂志，（）：，（）：董贤慧，谢红林，白江涛，等 阿尔茨海默病转基因动物模型的学习记忆能力改变及病理学观察 中风与神经疾病杂志，（）：，（）：，（）：，（）：程晓红，易寄东，刘玲爱，等 丙戊茶碱和左旋乙酰肉毒碱对改善老年大鼠水迷宫学习记忆行为的作用 中国行为医学科学，（）：，（）：，（）：郑君芳，陈慧敏，宋然，等 蛋白质组学方法分析多 迷宫训练后的小鼠空间记忆蛋白 中国生物化学与分子生物学报，（）：，（）：，：杜艳芳，杨洋，王玥，等 新物体识别实验应用研究 科学技术创新，（）：，（）：，：杜艳芳，杨洋，毕田田，等 行为箱形状对小鼠新物体识别实验结果的影响 实验动物科学，（）：，（）：柳云龙，杜淑文，吕丽，等 海马 蛋白的激活调节新物体识别记忆的遗忘过程 科学新闻，：，：曹岚，董原，战义强，等 气味对小鼠学习记忆及脑内乙酰胆碱酯酶活性的影响 中国老年学杂志，（）：，（）：，（）：王维刚，刘震泽，吴文婷，等 小鼠动物实验方法系列专题（七）旷场实验在小鼠行为分析中的应用 中国细胞生物学学报，（）：，（）：刘雨萌，金元宝，孟凡欣，等 枸杞子多糖通过改善氧化应激延缓疲劳作用的研究 食品工业科技，（）：，（）：韦健，谢纯珠，袁青 针刺结合疲劳转棒训练改善 大鼠运动和认知功能 中国针灸，（）：，（）：陈世坚，李舸，张钰，等 诱导帕金森病小鼠亚急性与慢性模型的比较及评价 中国组织工程研究，（）：，（）：薛卫星，刘卫平 咖啡酸苯乙酯通过下调 抑制 信号通路减轻大鼠创伤性颅脑损伤 药物评价研究，（）：，（）：张馨芸，林慧娇，李欣，等 五味子酯甲通过调节肝脏 抗氧化通路改善小鼠疲劳的作用 食品科学，（）：中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ，（）：吴名草，王晶，沈旭丹，等 人参葛根植物饮料对小鼠体力疲劳的缓解作用研究 粮油食品科技，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：徐晓虹，张洁净，姜科声 葛根素对雌激素剥夺小鼠学习记忆行为的影响 中国药学杂志，（）：，（）：，：，（）：李盛建，黄竹燕，叶夷露，等 物体材质与检测间隔时间对小鼠新物体识别实验结果的影响 浙江大学学报（医学版），（）：，（）：，：，：，（），（）：，：，（）：刘畅，吕晓菁，郑秀玉，等 亨廷顿舞蹈症发病机制的研究进展 生物技术通讯，（）：，（）：收稿日期