免疫学质量控制流程.doc
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1、免疫学质量控制流程【目的】保证ELISA检测结果准确可*, 充分发挥其方法学的优点。【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字:专业主管、科主任。【方法】【分析前质控】1. 人员培训实验是人操作的,因此检验人员需经过培训,熟练掌握本专业如下几方面的技术知识:1 检验项目的基本原理 (ELISA原理);2 临床意义;3 熟悉检测技巧,了解易出差错的环节及难点;4 熟悉检测试剂性能(包括试剂盒组成,包被片段及其组成);5 熟悉检测仪器的原理及性能;掌握数据处理的能力和质量控制知识。6 某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训
2、班,考试合格后持证上岗。【试剂盒选择】卫生部规定乙肝试剂,丙肝试剂,必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格,并贴有防伪标签的产品。【试剂盒评价】试剂评价需要有权威的血清考核盘(Panel)进行检测,价格昂贵,操作繁琐,一般实验室不易开展,可以通过以下信息,了解试剂质量。1.根据该试剂生物制品鉴定所的批批检定报告,了解其质量水平,按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂;2.通过询问试剂包被物的组成,如原料来源(基因工程或合成多肽),片段的组合(按比例混合或化学合成),片段的长短等判断试剂的优劣;3.参考室间质评报告中对试剂的评价结果,了解不同试剂的质控成绩。4.根据权威部门发布的试剂评价结果
3、,了解市场上试剂的质量优劣。【仪器质控】为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序(SOP),所要控制的仪器包括移液器(加样枪),水浴箱(温箱),洗板机和酶标仪。1.移液器:ELISA加样量小(5-100l),其准确性直接影响实验结果,利用称重法检查:吸取刻度指示量的水,万分之一天平称重后计算吸量是否准确,一般应在10%以内;2.水浴箱:经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中(或温箱内)实测温度是否一致,允许有1的误差;3.洗板机:每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ,人工扣板时,垫纸不湿,定期检查管孔是否堵塞;4.酶标仪:经常维护其光学部分,防止滤光片霉变,
4、定期检测校正,使其保持良好的工作性能。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为1%,重复性达0.5%。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.0002.000,新型号的酶标仪上限拓宽达2.900,甚至更高。超出可测上限的A值常以*或over或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同,线性范围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为0.0002.900,而其线性范围仅0.0002.000,这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。【酶标仪校正程序】1.滤光片波长精度检查:将不同
5、波长的滤光片从酶标仪上卸下,用UV-2201型紫外-可见分光光度计(波长精度0.3nm)于可见光区对每个滤光片进行扫描,其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。一般酶标仪无585nm滤光片,可选用550nm或630nm滤光片。450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液(校正波长为630nm)。2.通道差与孔间差检测:通道差检测是取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑,透明,无污染以酶标板架作载体,将其(内含200ul甲基橙溶液吸光度调至0.500A左右)置于8个通道的相应位置,蒸溜水调零,于490nm处连续测三次,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性,可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同一厂家,同一批号
6、酶标2板条(8条共96孔)分别加入200ul甲基橙溶液(吸光度调至0.100A左右)先后置于同一通道,蒸溜水调零,于490nm处检测,其误差大小用1.96s衡量。3. 零点飘移(稳定性观察):取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置,均加入200ul蒸馏水并调零,于490nm处每隔30分钟测一次,观察各个通道4小时内吸光度的变化。4.精密度评价:每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同浓度的甲基橙溶解,蒸馏水调零,于490nm作双份平行测定,每日测二次(上下午各一次),连续测定20天。分别计算其批内精密度,日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV值。5.线性测定:用电子天平精确称取
7、甲基橙配制5个系列的溶液,于490nm平行测8次,取其均值。计算其回归方程,相关系数及标准估计误差s,并用1.96s表示样品测量的误差范围.双波长测定评价:取一分甲基橙溶液,分别加入3种不同浓度的溶血液(测定波长为490nm,校正波长为585nm),先后于8个通道检测,每个通道测3次,比较各组之间是否具有统计学差异,以考察双波长消除干扰组分的效果。【标本的采集和保存】1.标本采集时应尽量避免溶血,因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本会增加非特异性显色造成假阳性。2.长菌的标本同样的道理也易产生假阳性,因菌体中可能含有内源性HRP也
8、会产生假阳性反应。3.抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝剂。4.标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深,一般血清置4冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20冰冻保存,冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡。可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。反复冻融会使抗体效价跌落,如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。5. ELISA的灵敏度1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免,尤其不应与生化试验用同一管标本。【分析中质控】ELISA实验的结果受操作影响很大,每个步骤包
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