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PCR仪器的使用及注意事项.ppt
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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪使用使用1精选课件PCR原理原理:PCR(聚合酶链式反应)(聚合酶链式反应):是一种用于放大扩增特定的是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊它可看作是生物体外的特殊DNA复制,复制,PCR的最大特点,的最大特点,是能将微量的是能将微量的DNA大幅增加。基于聚合酶制造的大幅增加。基于聚合酶制造的PCR仪实仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。度之间很好地进行控制。实时定量实时定量PCR技术:技术:利用荧光信号的变化实
2、时检测利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板值和标准曲线的关系对起始模板进进行定量分析行定量分析2精选课件PCR工作过程:3精选课件PCR仪器仪器BIO-RAD CFX96 ABI7500 QuantStudio3 line96204精选课件定量标准曲线(定量标准曲线(Quantitation-Standard Curve)相对定量标准曲线(相对定量标准曲线(Quantitation-Relative Standard Curve)定量定量CT比较法(比较法(Quantitation-
3、Comparative Ct Ct)溶解曲线(溶解曲线(Melt Curve)基因分型(基因分型(Genotyping)定性实验(定性实验(Presence/Absence)实验类型:5精选课件绝对定量绝对定量&相对定量:相对定量:绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数.绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线.6精选课件 AB7500绝对定量绝对定量1、双击桌面图标、双击桌面图标 ,或从,或从 Star
4、t All Programs Applied Biosystems 7500 Software 7500 V2.0 开启开启软件。进入主界面后选择软件。进入主界面后选择 Advanced Setup 。2.默认进入默认进入 Setup 下的下的 Experiment Properties 界面界面 2.1 输入实验名称输入实验名称(Experiment Name)7精选课件 2.2 确认仪器型号确认仪器型号 2.3 在实验类型中,选择在实验类型中,选择 Quantitation-Standard Curve2.4 选择试剂种类选择试剂种类2.5 确认运行模式确认运行模式8精选课件TaqMan探
5、针法探针法(寡核苷酸探针):5端端荧光报告基团荧光报告基团与靶基因特异性结合的序列与靶基因特异性结合的序列3端端淬灭基团淬灭基团完整的探针:检测不到报告荧光完整的探针:检测不到报告荧光切断的探针:检测到报告荧光切断的探针:检测到报告荧光5-3外切酶活性将探针酶切降解外切酶活性将探针酶切降解 水解探针,使报告基团和淬灭基团分离水解探针,使报告基团和淬灭基团分离淬灭基团淬灭基团报报告告基基团团9精选课件3.进入进入 Setup 下的下的 Plate Setup 界面,编辑基因(界面,编辑基因(Target)及样本()及样本(Sample)10精选课件3.1在在 界面中设置基因及样品,界面中设置基因
6、及样品,添添加新的基因,并在加新的基因,并在Target name编辑基因名称,编辑基因名称,Reporter和和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团;中选择所标记的荧光基团及淬灭基团;利用利用 添加新的样本,并编辑样品名称。添加新的样本,并编辑样品名称。11精选课件3.2在在 界面中进行样品板的排布分配界面中进行样品板的排布分配 S:标准曲线数据点,标准曲线数据点,U:未知样本,未知样本,N:阴性对照阴性对照 勾选基因勾选基因 勾选样本名称勾选样本名称3.3 设置标准曲线:利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔(一设置标准曲线:利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔(一般情况下,每个般情况下,每
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