第六章兽药残留检测技术激素类.ppt

第六章 兽药残留检测(jin c)技术第八节第八节 激素类药物激素类药物(yow)(yow)残留的危残留的危害分析与检测方法害分析与检测方法 第一页，共六十七页。一、概述一、概述(i sh)l兽用激素兽用激素(j s)包括包括皮质激素皮质激素、同化激素同化激素。l天然皮质激素主要有可的松及氢化可的松。这类皮质激素有较强天然皮质激素主要有可的松及氢化可的松。这类皮质激素有较强的糖代谢及抗炎等作用的糖代谢及抗炎等作用,而对水、盐代谢的作用较弱而对水、盐代谢的作用较弱,所以称其所以称其为为糖皮质激素糖皮质激素。临床上应用广泛。通常所说的皮质激素即指这。临床上应用广泛。通常所说的皮质激素即指这类激素。类激素。l近年来近年来,为了提高疗效为了提高疗效,降低副作用降低副作用,而而合成合成了一系列的了一系列的糖皮质激糖皮质激素衍生物素衍生物。如。如泼尼松泼尼松(强的松强的松)与氢化泼尼松与氢化泼尼松(强的松龙强的松龙),糖原异生糖原异生作用更强作用更强,对水盐平衡的影响更弱。较小剂量常用于补充肾上腺皮质对水盐平衡的影响更弱。较小剂量常用于补充肾上腺皮质功能缺乏功能缺乏,较大剂量则能抑制免疫过程中的多个环节，缓解炎较大剂量则能抑制免疫过程中的多个环节，缓解炎症。症。第二页，共六十七页。1、糖皮质激素、糖皮质激素l糖皮质激素的主要作用是能降低机体对内外环境各种刺激的反应糖皮质激素的主要作用是能降低机体对内外环境各种刺激的反应(fnyng)性性,具体表现在具体表现在抗炎抗炎、免疫抑制免疫抑制、抗毒素抗毒素和和抗休克抗休克等方面。还等方面。还可使血糖升高可使血糖升高,蛋白质分解加强蛋白质分解加强,使血淋巴细胞、嗜酸性细胞减少使血淋巴细胞、嗜酸性细胞减少,红红细胞、嗜中性粒细胞、血小板增高等。细胞、嗜中性粒细胞、血小板增高等。l糖皮质激素主要用于以下疾病糖皮质激素主要用于以下疾病:各种炎症、严重感染及传染病、过各种炎症、严重感染及传染病、过敏性疾病、风湿病、休克、代谢疾病以及引产。敏性疾病、风湿病、休克、代谢疾病以及引产。l皮质激素会引起水皮质激素会引起水分在体内滞留分在体内滞留,增加肉的重量增加肉的重量,因而因而在畜牧业中有在畜牧业中有可能当作可能当作增重剂增重剂而被滥用而被滥用。l滥用这类药物后滥用这类药物后,肉品感官上多汁、肉瘦肉品感官上多汁、肉瘦。因此饲养场中用皮质激。因此饲养场中用皮质激素作素作催长剂催长剂，属于，属于违禁使用违禁使用。第三页，共六十七页。泼尼松泼尼松l别名强的松别名强的松,不溶于水不溶于水,微溶于乙醇微溶于乙醇。应避光、密封保存。应避光、密封保存。l具有具有抗炎抗炎及及抗过敏抗过敏作用作用,还能还能促进蛋白质分解转变促进蛋白质分解转变(zhunbin)为糖为糖,减少葡萄糖的利用减少葡萄糖的利用,因而使血糖及肝糖原增加因而使血糖及肝糖原增加,尿中可出尿中可出现糖尿现糖尿,同时同时增加胃液分泌增加胃液分泌,促进食欲促进食欲。l其水、钠潴留及促进钾排泄作用比可的松小其水、钠潴留及促进钾排泄作用比可的松小,抗炎及抗过敏作抗炎及抗过敏作用较强用较强,副作用较小副作用较小,故故比较常用比较常用。l主要用于各种急性严重细菌感染、严重的过敏性疾病、风湿、主要用于各种急性严重细菌感染、严重的过敏性疾病、风湿、类风湿、肾病综合征、支气管哮喘、各种肾上腺皮质功能不足类风湿、肾病综合征、支气管哮喘、各种肾上腺皮质功能不足症、湿疹等。症、湿疹等。第四页，共六十七页。地塞米松地塞米松(d si m sn)l别名氟美松别名氟美松,不溶于水不溶于水,溶于无水乙醇溶于无水乙醇。应遮光保存。应遮光保存。l抗炎抗炎及及控制控制(kngzh)皮肤过敏皮肤过敏的作用比泼尼松龙更显著的作用比泼尼松龙更显著,而对水、钠而对水、钠潴留和促进钾排泄作用较弱。潴留和促进钾排泄作用较弱。l目前地塞米松的应用愈来愈广泛目前地塞米松的应用愈来愈广泛,有取代泼尼松等其他合成皮质激素有取代泼尼松等其他合成皮质激素的趋势。的趋势。l肌注后吸收快肌注后吸收快,狗和鼠分别于狗和鼠分别于0.5h和和6h达血药峰浓度。达血药峰浓度。大部分在肝大部分在肝内被代谢成羟基地塞米松及其葡萄糖苷结合物而灭活。内被代谢成羟基地塞米松及其葡萄糖苷结合物而灭活。第五页，共六十七页。氟轻松氟轻松(qn sn)l氟轻松为白色结晶性粉末氟轻松为白色结晶性粉末,无臭无臭,不溶于水不溶于水,溶于乙醇溶于乙醇。应遮光、密。应遮光、密封保存。封保存。l氟轻松为外用皮质激素中疗效最显著而副作用较小的一种氟轻松为外用皮质激素中疗效最显著而副作用较小的一种,涂敷涂敷于局部对皮肤、黏膜的炎症于局部对皮肤、黏膜的炎症(搔痒及皮肤过敏反应等有效。搔痒及皮肤过敏反应等有效。不但不但(bdn)疗效高疗效高,而且显效快而且显效快,使用很低浓度即有明显作用使用很低浓度即有明显作用,止痒止痒作用尤其突出。作用尤其突出。l本品主要用于各种本品主要用于各种皮肤病皮肤病,如湿疹、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等。如湿疹、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等。对局部化脓创面对局部化脓创面,需同时配合新霉素等抗生素。需同时配合新霉素等抗生素。第六页，共六十七页。倍他米松倍他米松l倍他米松为白色结晶性粉末倍他米松为白色结晶性粉末,无臭无臭,味苦味苦,几乎不溶于水几乎不溶于水,溶于乙醇溶于乙醇。l本品含有多种盐类本品含有多种盐类,如磷酸钠盐、二丙酸盐、醋酸盐等。均应遮光如磷酸钠盐、二丙酸盐、醋酸盐等。均应遮光保存。保存。l内服吸收良好内服吸收良好,生物利用度约为生物利用度约为72%,血浆蛋白血浆蛋白(dnbi)结合率结合率64%,半半衰期衰期5.6h,4.8%的药量自尿液排出。的药量自尿液排出。l牛肌注牛肌注80g/kg,停药二日停药二日,肝脏中母药残留量为肝脏中母药残留量为5.47.8g/kg;停药八停药八日日,肝脏中母药残留量为肝脏中母药残留量为10.9g/kg,肾脏、肌肉和脂肪中母药残留量分肾脏、肌肉和脂肪中母药残留量分别为别为2.3g/kg、3.9g/kg和和4.4g/kg。第七页，共六十七页。2、同化、同化(tnghu)激素激素l例如：例如：雄激素雄激素能明显地促进蛋白质合成能明显地促进蛋白质合成(同化作用同化作用),能使肌肉发能使肌肉发达达,体重增加体重增加;同时氨基酸分解减少同时氨基酸分解减少(异化作用异化作用),使尿素生成减少降使尿素生成减少降低氮质血症。但使用雄激素常可出现低氮质血症。但使用雄激素常可出现男性化现象男性化现象,因而限制了它因而限制了它的应用。的应用。l近年来人工合成的一些衍生物近年来人工合成的一些衍生物,其雄激素作用大为减弱其雄激素作用大为减弱,而同化作用而同化作用则保留或增强则保留或增强,这些衍生物称这些衍生物称同化激素同化激素。l同化激素同化激素主要用于蛋白质同化或吸收不足、降低亢进和损失过多等主要用于蛋白质同化或吸收不足、降低亢进和损失过多等情况。情况。l畜牧业中使用同化激素畜牧业中使用同化激素(非治疗用途非治疗用途(yngt)，提高胴体品质、增，提高胴体品质、增重和提高饲料转化率重和提高饲料转化率),可以很快产生显著和直接的经济效益可以很快产生显著和直接的经济效益,因因此对生产者有很大的吸引力。此对生产者有很大的吸引力。第八页，共六十七页。同化同化(tnghu)激素类药物激素类药物l去氢睾酮、去氢甲睾酮、醋酸氯地孕酮去氢睾酮、去氢甲睾酮、醋酸氯地孕酮(yn tn)、氯睾酮、乙烯雌醇、醋酸甲羟孕酮、氯睾酮、乙烯雌醇、醋酸甲羟孕酮(yn tn)、醋酸美仑孕酮、醋酸美仑孕酮(yn tn)、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮(yn tn)、诺甲醋孕酮、诺甲醋孕酮(yn tn)、去甲睾酮、司坦唑、去甲睾酮、司坦唑醇、醋酸群勃龙等醇、醋酸群勃龙等第九页，共六十七页。醋酸醋酸(c sun)甲羟孕酮甲羟孕酮l作用与黄体酮相似作用与黄体酮相似,孕激素活性强孕激素活性强,无雌激素和雄激素活性无雌激素和雄激素活性,有抗雌有抗雌激素作用。激素作用。l内服、注射均有效内服、注射均有效。内服在胃肠道吸收。内服在胃肠道吸收,在肝内降解。肌内注射后在肝内降解。肌内注射后23天血药浓度达到峰值。血药峰值越高天血药浓度达到峰值。血药峰值越高,药物清除越快。药物清除越快。肌肌注注150mg后后69个月血中才检不出药物。个月血中才检不出药物。l小牛肌注复方制剂小牛肌注复方制剂(24mg醋酸甲羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、100mg苯甲酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、200mg癸酸去甲睾酮癸酸去甲睾酮)后停药后停药2天天,血浆中醋酸甲羟孕酮浓度为血浆中醋酸甲羟孕酮浓度为1g/kg,14天时降至天时降至30pg/kg。尿液在数天内都能检出尿液在数天内都能检出,14天时醋酸天时醋酸甲羟孕酮浓度为甲羟孕酮浓度为37pg/kg。肾肾组织组织(zzh)残留相对较高残留相对较高,故作为残故作为残留检测的靶组织。留检测的靶组织。第十页，共六十七页。醋酸醋酸(c sun)美仑孕酮美仑孕酮l别名醋酸甲烯雌醇别名醋酸甲烯雌醇,为合成为合成(hchng)的避孕药。的避孕药。l内服时孕激素作用约为黄体酮的内服时孕激素作用约为黄体酮的75倍倍,无雌激素和雄激素活性无雌激素和雄激素活性,具具有显著排卵抑制作用。有显著排卵抑制作用。l小母牛小母牛用药后用药后,母药和代谢物主要由粪便排出母药和代谢物主要由粪便排出。停药。停药6h,肝、脂肪、肝、脂肪、肾和肌肉组织中的残留量分别为肾和肌肉组织中的残留量分别为915g/kg、78g/kg、1.21.8g/kg和和0.51g/kg。脂肪脂肪、肝、肾和肌肉中母药残留量分、肝、肾和肌肉中母药残留量分别占总残留的别占总残留的80%、37%、30%和和45%。l美国美国FDA规定规定休药期休药期48h,但欧盟禁止使用。但欧盟禁止使用。第十一页，共六十七页。去甲去甲(q ji)睾酮睾酮l牛牛注射注射去甲睾酮后去甲睾酮后,脂肪中残留脂肪中残留(cnli)能被检出能被检出,并持续并持续73天天;尿中残留低于尿中残留低于1g/kg。l内服内服后脂肪中残留未被检出后脂肪中残留未被检出,但尿中残留可检出。但尿中残留可检出。第十二页，共六十七页。醋酸醋酸(c sun)甲地孕酮甲地孕酮l本品为孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作本品为孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用用,但比左炔诺孕酮和炔诺酮为弱。不具有雌激素和雄激但比左炔诺孕酮和炔诺酮为弱。不具有雌激素和雄激素样活性素样活性,但有明显抗雌激素作用。与雌激素合用但有明显抗雌激素作用。与雌激素合用,抑制抑制排卵。排卵。l动物致畸试验动物致畸试验(shyn)表明对家兔具有表明对家兔具有死胎率增加死胎率增加和和致畸致畸作用。作用。l口服口服后生物半衰期明显比左炔诺孕酮为短后生物半衰期明显比左炔诺孕酮为短,大部分代谢产大部分代谢产物以物以葡萄糖醛酸酯葡萄糖醛酸酯形式排出。形式排出。第十三页，共六十七页。3、危害、危害(wihi)l对人体危害较为严重的主要有甾类同化激素对人体危害较为严重的主要有甾类同化激素(包括雌酮、雌二包括雌酮、雌二醇、睾酮、皮质酮等物质醇、睾酮、皮质酮等物质)及及2-受体激动剂受体激动剂(苯乙胺类苯乙胺类)。这些存在。这些存在于环境介质中的激素量虽然很小于环境介质中的激素量虽然很小,但大多但大多具有具有生物富集生物富集作用作用,容容易通过食物链在人体中富集易通过食物链在人体中富集,对人类及其他生物产生极其严重对人类及其他生物产生极其严重的危害。的危害。l主要产生各种主要产生各种慢性慢性、蓄积性毒性蓄积性毒性,如致癌、致畸、致突变等三致性如致癌、致畸、致突变等三致性毒性以及免疫毒性、发育毒性和生态毒性等。毒性以及免疫毒性、发育毒性和生态毒性等。2-受体激动剂类药受体激动剂类药物可产生急性毒性作用。物可产生急性毒性作用。l危害多具有危害多具有隐蔽性隐蔽性,易造成易造成(zo chn)实质性危害而实质性危害而难以逆转难以逆转。第十四页，共六十七页。糖皮质激素的危害糖皮质激素的危害(wihi)l对人体的危害主要表现为抑制肾上腺皮质功能对人体的危害主要表现为抑制肾上腺皮质功能,使使肾上腺皮肾上腺皮质萎缩质萎缩。l另外另外,过多摄入过多摄入,可使人产生可使人产生多毛症多毛症、满月脸满月脸以及以及免疫力下降免疫力下降等毒等毒副作用。副作用。l对敏感型的个体可造成血管扩张对敏感型的个体可造成血管扩张,血压降低血压降低(jingd)而引起而引起休克休克,甚至甚至死亡死亡。第十五页，共六十七页。同化同化(tnghu)激素的危害激素的危害l目前目前,同化激素对环境的污染已引起了社会各界的普遍关注。同化激素对环境的污染已引起了社会各界的普遍关注。l长期摄入同化激素，即使含量甚微，也会长期摄入同化激素，即使含量甚微，也会导致机体代谢紊乱、发育异导致机体代谢紊乱、发育异常常,且多数激素类物质具有且多数激素类物质具有潜在的致癌作用潜在的致癌作用。l欧盟欧盟(原欧洲经济共同体原欧洲经济共同体)从从1988年起年起,禁止所有同化激素用于动物的促禁止所有同化激素用于动物的促生长目的生长目的,并制定了严格的监测措施。并制定了严格的监测措施。l我国从我国从20世纪世纪90年代起年代起,也陆续开始对用于促生长目的的同化激素禁止也陆续开始对用于促生长目的的同化激素禁止使用使用,并已开展并已开展(kizhn)了相关的监测工作。了相关的监测工作。l但是但是,在利益驱动下在利益驱动下,在世界范围内在世界范围内,同化激素仍在被大量滥用同化激素仍在被大量滥用。就残留的。就残留的危害和引起的争议而言危害和引起的争议而言,同化激素同化激素与与抗生素抗生素并列为最重要的兽药残留。并列为最重要的兽药残留。第十六页，共六十七页。雄性激素及其同化雄性激素及其同化(tnghu)激素的危害激素的危害l进人人体和动物体后进人人体和动物体后,对其生殖功能产生严重的影响对其生殖功能产生严重的影响,甚至可能造成某甚至可能造成某些物种的绝种。些物种的绝种。l通过食物链进行富集通过食物链进行富集,在人体首先引起内分泌失调在人体首先引起内分泌失调,危害生殖系统危害生殖系统,易出现生殖器病变。易出现生殖器病变。l对男性的危害：对男性的危害：表现为睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝肾功表现为睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝肾功能障碍或肝脏能障碍或肝脏(gnzng)肿瘤。肿瘤。l对女性的危害：对女性的危害：可引起女性的不孕、早产、流产、月经不调或女性可引起女性的不孕、早产、流产、月经不调或女性男性化男性化(肌肉增生、毛发增多肌肉增生、毛发增多)等现象。等现象。l目前目前,在局部地区已开始出现在局部地区已开始出现人类生存危机人类生存危机现象现象,如发达国家约有如发达国家约有20%的家庭没有子女的家庭没有子女,而睾丸癌的患者明显增加。而睾丸癌的患者明显增加。第十七页，共六十七页。对其他动物对其他动物(dngw)的危害的危害l激素污染对人类以外的其他动物影响更为显著激素污染对人类以外的其他动物影响更为显著,如鱼、鸟和哺乳如鱼、鸟和哺乳动物的大量死亡动物的大量死亡,雌雄异变雌雄异变,生育和发育紊乱生育和发育紊乱,免疫力下降等免疫力下降等现象现象,可能均与此有关。可能均与此有关。l1980年左右年左右,美国一造纸厂废水排出口下游的雌性鱼雄性化美国一造纸厂废水排出口下游的雌性鱼雄性化,且雄性化后的鱼与原先正常雌性鱼进行交尾且雄性化后的鱼与原先正常雌性鱼进行交尾,原来正常雄性鱼出原来正常雄性鱼出现超雄化现超雄化,并表现为攻击性交尾行动。并表现为攻击性交尾行动。l在日本在日本,发现发现(fxin)有雌海螺长有雄海螺的生殖器。有雌海螺长有雄海螺的生殖器。第十八页，共六十七页。雌性激素的危害雌性激素的危害(wihi)l雌性激素造成的环境污染雌性激素造成的环境污染,同样可能造成某些物种的绝种。同样可能造成某些物种的绝种。l通过食物链产生的富集作用通过食物链产生的富集作用(zuyng),可引起人体的可引起人体的内分泌失内分泌失调调,l对男性的危害：对男性的危害：使男性精子数量下降或出现女性化、性早使男性精子数量下降或出现女性化、性早熟、抑制骨骼发育等。熟、抑制骨骼发育等。l对女性的危害：可引起女性对女性的危害：可引起女性 性早熟、生殖器官畸形和癌变性早熟、生殖器官畸形和癌变,这一效应在其女性后代中表现更显著。这一效应在其女性后代中表现更显著。l对人类后代的危害：对人类后代的危害：这些激素透过胎盘这些激素透过胎盘,可引起用药者子宫可引起用药者子宫内膜及女性后代的阴道宫颈癌变和男性后代的精子发育不内膜及女性后代的阴道宫颈癌变和男性后代的精子发育不良、生殖器畸形。良、生殖器畸形。第十九页，共六十七页。对其他对其他(qt)动物的危害动物的危害l雌性激素的污染对人类之外的其他动物雌性激素的污染对人类之外的其他动物,同样有着严重的影响。同样有着严重的影响。l美国出现的雄性美洲狮雌性化、加拿大的海豚在生殖周期出现美国出现的雄性美洲狮雌性化、加拿大的海豚在生殖周期出现卵巢卵巢异常异常、南极企鹅产下、南极企鹅产下无精卵无精卵以及其他一些连体、以及其他一些连体、畸形动物畸形动物的较高的较高比例出现比例出现,可能均与环境可能均与环境(hunjng)激素污染有关。激素污染有关。第二十页，共六十七页。二、样品二、样品(yngpn)处理处理（一）（一）皮质激素皮质激素的样品处理的样品处理(chl)（二）（二）同化激素同化激素的样品处理的样品处理第二十一页，共六十七页。（一）皮质激素（一）皮质激素1、皮质激素样品预处理、皮质激素样品预处理l液体样品液体样品(奶、血液、尿液奶、血液、尿液)提取前需要提取前需要脱脂肪脱脂肪,通常在通常在4、7000g离心离心(lxn),除去浮在上层的脂肪。除去浮在上层的脂肪。l组织样品组织样品(肌肉、肝、肾肌肉、肝、肾)先要用切碎机或匀浆器进行先要用切碎机或匀浆器进行组织破碎组织破碎。水或醋酸盐缓冲液常用于水或醋酸盐缓冲液常用于样品的稀释样品的稀释。l肝脏或尿样肝脏或尿样中的皮质激素结合物较多中的皮质激素结合物较多,因此先用因此先用葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/硫酸硫酸酯酶水解酯酶水解。l由于酶解反应较慢由于酶解反应较慢,为保证水解完全为保证水解完全,可在较高的温度下来加速水可在较高的温度下来加速水解或延长孵育时间。解或延长孵育时间。l用超临界萃取法提取时用超临界萃取法提取时,先要将组织样品匀浆先要将组织样品匀浆,再进行冷冻干燥。再进行冷冻干燥。第二十二页，共六十七页。2、提取、提取(tq)皮质激素皮质激素l在一定的在一定的pH值条件下值条件下,一般用一般用有机溶剂有机溶剂对样品对样品提取提取(tq)和除蛋白和除蛋白。l例如例如,氯仿氯仿提取牛奶中的氢化可的松提取牛奶中的氢化可的松;l二氯甲烷二氯甲烷-正己烷正己烷(4+1)提取牛奶中游离的氢化可的松和提取牛奶中游离的氢化可的松和21-醋醋酸酯酸酯;l乙酸乙酯乙酸乙酯提取动物组织中的氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强提取动物组织中的氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙、倍他米松的松龙、倍他米松,牛奶中的甲基强的松龙，牛奶中的氢化波尼松牛奶中的甲基强的松龙，牛奶中的氢化波尼松和地塞米松和地塞米松;l含含0.1mol/L氢氧化钠的乙酸乙酯氢氧化钠的乙酸乙酯提取牛组织中的地塞米松提取牛组织中的地塞米松;第二十三页，共六十七页。有机溶剂法提取有机溶剂法提取(tq)l甲醇甲醇提取牛肉组织中的提取牛肉组织中的5种皮质激素种皮质激素;l乙腈乙腈提取牛肝脏中的提取牛肝脏中的5种人工合成的皮质激素和牛组织中的地塞种人工合成的皮质激素和牛组织中的地塞米松米松;l乙醚乙醚提取牛粪中提取牛粪中9种合成的皮质激素种合成的皮质激素;l二氯甲烷二氯甲烷提取动物脂肪中的氟强的松龙提取动物脂肪中的氟强的松龙;l丙酮丙酮提取动物肝脏提取动物肝脏(肾脏肾脏(shnzng)和肌肉中的氟强的松龙。和肌肉中的氟强的松龙。l此外此外,牛奶牛奶和和尿样尿样可以直接用水或醋酸盐缓冲液稀释并提取。可以直接用水或醋酸盐缓冲液稀释并提取。第二十四页，共六十七页。3、净化、净化(jnghu)l粗提取液中含大量的粗提取液中含大量的内源性干扰物质内源性干扰物质,为了消除或降低干扰并浓缩为了消除或降低干扰并浓缩分析物分析物,样液需要净化处理。样液需要净化处理。l净化方法净化方法(fngf)包括液包括液-液萃取、固相萃取、免疫亲和色谱及柱液萃取、固相萃取、免疫亲和色谱及柱切换技术等。切换技术等。l液液-液萃取液萃取可以简单的一次溶剂萃取可以简单的一次溶剂萃取,也可以多次溶剂萃取。萃取也可以多次溶剂萃取。萃取次数的多少次数的多少,很大程度上取决于色谱的分离效率和选择性。很大程度上取决于色谱的分离效率和选择性。l色谱的分离度和选择性愈高色谱的分离度和选择性愈高,样品的提取和净化步骤可以简略一些样品的提取和净化步骤可以简略一些,还可以提高分析效率。还可以提高分析效率。第二十五页，共六十七页。液液-液萃取液萃取(cuq)法法l液液-液萃取可以除去生物样品中大部分杂质和蛋白质。液萃取可以除去生物样品中大部分杂质和蛋白质。l例如例如,氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松的氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松的乙酸乙酸乙酯提取液乙酯提取液,依次用依次用稀酸溶液稀酸溶液和和稀碱溶液洗涤稀碱溶液洗涤(xd),可以可以除去除去碱性和碱性和酸性的酸性的水溶性杂质水溶性杂质。l地塞米松的地塞米松的乙酸乙酯提取液乙酸乙酯提取液,可以可以用氢氧化钠溶液洗涤用氢氧化钠溶液洗涤,以除去酚以除去酚类雌激素。类雌激素。l甲基强的松龙的初提液蒸发至干后甲基强的松龙的初提液蒸发至干后,用用乙腈溶解乙腈溶解,加入加入正已烷正已烷提取提取,正已烷提取液再用正已烷提取液再用饱和的硫酸钠水溶液饱和的硫酸钠水溶液提取提取,最后用最后用二氯甲烷二氯甲烷提提取。取。第二十六页，共六十七页。l氟强的松龙提取液蒸发至干后氟强的松龙提取液蒸发至干后,依次用依次用乙腈乙腈和和正己烷正己烷,正己烷正己烷和和水水进进行液行液-液萃取液萃取,最后用最后用二氯甲烷二氯甲烷提取。提取。l通过通过(tnggu)液液-液萃取对分析物的提纯液萃取对分析物的提纯,可以降低仪器检测的背可以降低仪器检测的背景干扰景干扰,大大提高分析方法的检测灵敏度。大大提高分析方法的检测灵敏度。l皮质激素的初提液还可通过皮质激素的初提液还可通过三相液三相液-液分配净化：液分配净化：l当组织样用当组织样用乙腈乙腈水溶液初提后水溶液初提后,上清液加入上清液加入正己烷正己烷和和二氯甲烷二氯甲烷,进进行行乙腈乙腈、正己烷正己烷和和二氯甲烷二氯甲烷的三相液的三相液-液萃取液萃取,非极性组分被分配非极性组分被分配到正己烷相中到正己烷相中,极性和离子化组分被分配到底层水相中极性和离子化组分被分配到底层水相中,皮质激素皮质激素和其他中等极性组分则分配到中间乙腈相中。和其他中等极性组分则分配到中间乙腈相中。第二十七页，共六十七页。固相萃取固相萃取(cuq)法法l采用有机溶剂萃取法容易出现采用有机溶剂萃取法容易出现(chxin)乳化乳化现象现象,因而常常导致提因而常常导致提取回收率偏低或不稳定。取回收率偏低或不稳定。l固相萃取法固相萃取法克服了这一缺点克服了这一缺点,且具有操作简便、快速的优点。且具有操作简便、快速的优点。l常用的固相萃取柱吸附剂有常用的固相萃取柱吸附剂有C18、C8和弗洛里硅藻土和弗洛里硅藻土(Florisil)等。等。l例如例如,C18固相萃取柱用于猪血浆中天然的和合成的皮质激素净化固相萃取柱用于猪血浆中天然的和合成的皮质激素净化,血血浆或血清样品中氢化可的松净化。浆或血清样品中氢化可的松净化。lFlorisil柱用于牛奶中氢化可的松净化和牛组织中氟强的松龙柱用于牛奶中氢化可的松净化和牛组织中氟强的松龙净化。净化。第二十八页，共六十七页。免疫免疫(miny)亲和柱色谱法亲和柱色谱法l免疫亲和柱具有高的专一性免疫亲和柱具有高的专一性,近年来发展迅速近年来发展迅速,已应用于皮质激已应用于皮质激素的生物素的生物(shngw)样品制备。样品制备。l例如例如,用两种抗体结合的免疫亲和柱用两种抗体结合的免疫亲和柱,可以分离纯化肝、牛奶、尿样和可以分离纯化肝、牛奶、尿样和粪样中粪样中9种皮质激素。种皮质激素。l免疫亲和色谱与免疫亲和色谱与GC-负离子化学电离质谱负离子化学电离质谱联用联用,已用于马组织中双已用于马组织中双氟美松的确证分析。氟美松的确证分析。第二十九页，共六十七页。柱切换柱切换(qi hun)技术技术l柱切换技术自动化程度高柱切换技术自动化程度高,在线浓缩在线浓缩(nn su)和和纯化纯化,大大大简化了样品的前处理步骤。大简化了样品的前处理步骤。l例如例如,牛组织中地塞米松测定时牛组织中地塞米松测定时,样液经苯基柱初级分离样液经苯基柱初级分离后流至硅胶预富集柱中后流至硅胶预富集柱中,通过柱切换通过柱切换,改变流动相将富集改变流动相将富集柱中的待测物洗脱至氰丙基分析柱中分离。柱中的待测物洗脱至氰丙基分析柱中分离。第三十页，共六十七页。超临界超临界CO2流体流体(lit)萃取法萃取法l超临界超临界CO2流体萃取法具有低温、快速、无溶剂萃取的流体萃取法具有低温、快速、无溶剂萃取的优点优点(yudin)。l例如例如,超临界流体萃取法与超临界流体萃取法与HPLC联用联用,用于牛组织中地塞用于牛组织中地塞米松残留的测定。米松残留的测定。第三十一页，共六十七页。（二）同化（二）同化(tnghu)激素的样品处理激素的样品处理1、样品、样品(yngpn)预处理：预处理：l液体样品液体样品(尿、血浆、胆汁、牛奶尿、血浆、胆汁、牛奶)在提取前在提取前,可用水或可用水或磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液稀释稀释。l半固体样品半固体样品(肌肉、肝、肾肌肉、肝、肾)在提取前需要在提取前需要均质均质。l脂肪样脂肪样可在可在4060 下下加热加热,使脂肪融化成液体。使脂肪融化成液体。第三十二页，共六十七页。2、提取、提取(tq)l生物样品中生物样品中游离游离的类固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、的类固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、碱性乙腈、四氢呋喃、叔丁基甲醚和氯仿碱性乙腈、四氢呋喃、叔丁基甲醚和氯仿(l fn)-甲醇等甲醇等有有机溶剂提取机溶剂提取。l激素结合物激素结合物的的水溶性较大水溶性较大,不易被有机溶剂提取不易被有机溶剂提取,可先将样品可先将样品水解水解后再提取游离激素。后再提取游离激素。l常用的水解方法有常用的水解方法有酶水解酶水解和和碱水解碱水解两种。两种。l酶水解通常使用酶水解通常使用葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡前者可专一地水解葡糖苷酸结合物糖苷酸结合物,后者可水解硫酸酯结合物。后者可水解硫酸酯结合物。第三十三页，共六十七页。l由于尿样和组织中通常同时存在上述两种结合物由于尿样和组织中通常同时存在上述两种结合物,常使用葡萄糖苷酸常使用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶芳基硫酸酯混合酶,控制控制pH4.57.0,于于37 温育过夜。温育过夜。l碱水解碱水解通常使用氢氧化钠通常使用氢氧化钠(qn yn hu n)溶液溶液,由于合成类固醇由于合成类固醇常以酯制剂注入动物常以酯制剂注入动物,水解后使酯类释放出游离的类固醇。水解后使酯类释放出游离的类固醇。第三十四页，共六十七页。3、净化、净化(jnghu)l粗提取液的粗提取液的净化方法净化方法包括液包括液-液萃取、固相萃取法、液液萃取、固相萃取法、液相色谱、免疫亲和色谱和超临界流体色谱等。相色谱、免疫亲和色谱和超临界流体色谱等。l为了为了(wi le)达到更好的纯化效果达到更好的纯化效果,可将几种方法结合应用。可将几种方法结合应用。第三十五页，共六十七页。液液-液萃取液萃取(cuq)法法l液液-液萃取大多是液萃取大多是去除去除水溶性提取液中的水溶性提取液中的脂肪脂肪,l例如例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或异辛烷乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或异辛烷,可脱去脂类物可脱去脂类物质。质。l脂肪样中的激素脂肪样中的激素(30种雄激素种雄激素)可用可用正己烷提取正己烷提取,再用甲醇再用甲醇-醋酸盐醋酸盐缓冲液缓冲液(pH5.2)提取正己烷中的激素提取正己烷中的激素,同时去除脂类物质同时去除脂类物质,水性提水性提取液再用二氯甲烷抽提。取液再用二氯甲烷抽提。l当当乙腈乙腈粗提取液调节粗提取液调节pH至至13时时,加入加入正己烷正己烷和和二氯甲烷二氯甲烷进行进行三相液三相液-液萃取液萃取,极性和离子型酸性物质进入水相极性和离子型酸性物质进入水相,脂类等低极性物质则进脂类等低极性物质则进入上层入上层(shngcng)正己烷相中正己烷相中,而中等极性物质而中等极性物质(如待测物：群勃如待测物：群勃龙和表群勃龙、去甲睾酮和美仑孕酮龙和表群勃龙、去甲睾酮和美仑孕酮)进入中间乙腈相中。进入中间乙腈相中。第三十六页，共六十七页。固相萃取固相萃取(cuq)法法l柱层析采用柱层析采用氧化铝氧化铝、硅胶硅胶和和Celite吸附剂吸附剂,可有效分离分析物和内可有效分离分析物和内源性杂质源性杂质,已应用于肉样中七种类固醇的纯化。已应用于肉样中七种类固醇的纯化。l固相萃取法具有简便、快速固相萃取法具有简便、快速(kui s)、经济等优点、经济等优点,已广泛应用于已广泛应用于激素类药物的净化。激素类药物的净化。l正相柱正相柱常用硅胶、氧化铝、氰基型和氨基型吸附剂常用硅胶、氧化铝、氰基型和氨基型吸附剂,反相柱反相柱常常用用C18和和C8吸附剂。吸附剂。lC18固相萃取柱和固相萃取柱和Amberlite XAD-2离子交换柱适合纯化离子交换柱适合纯化亲脂性亲脂性或或中性中性的同化激素。的同化激素。第三十七页，共六十七页。l司坦唑醇在司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的结构为吡是由于它的结构为吡唑环和雄唑环和雄(甾甾)烷环缩合而成烷环缩合而成,两个活泼氢可解离两个活泼氢可解离,具有离子化的具有离子化的性质性质,可与固定相或玻璃的活性点发生吸附可与固定相或玻璃的活性点发生吸附,但其在但其在C8和苯磺酸型的和苯磺酸型的混合混合(hnh)固定相小柱中固定相小柱中,净化效果和回收率均佳。净化效果和回收率均佳。lC18和硅胶的和硅胶的混合柱混合柱同样被用来对粗提取液的纯化。同样被用来对粗提取液的纯化。lC8、硅胶和氨基型的、硅胶和氨基型的混合固定相小柱混合固定相小柱被成功地应用于肉中同化激素被成功地应用于肉中同化激素和异化激素的分离和异化激素的分离,激素按照极性、非极性和酚类性质分段流出激素按照极性、非极性和酚类性质分段流出,然后再分别纯化。然后再分别纯化。第三十八页，共六十七页。l固相萃取柱的净化效果有时并不能满足质谱检测的要求固相萃取柱的净化效果有时并不能满足质谱检测的要求,因此因此有人将固相萃取法与色谱法相结合有人将固相萃取法与色谱法相结合,对样品提取液作更高的纯对样品提取液作更高的纯化。化。l另外另外,还有采用还有采用(ciyng)C18柱对样液色谱分离柱对样液色谱分离,用自动馏分收集器用自动馏分收集器收集分析物的馏分收集分析物的馏分,馏分收集后吹干馏分收集后吹干,然后衍生化然后衍生化GC分析。分析。第三十九页，共六十七页。柱切换柱切换(qi hun)技术技术l柱切换技术也被应用于激素的生物样品制备。柱切换技术也被应用于激素的生物样品制备。l例如例如,将牛肝提取液注入凝胶柱中将牛肝提取液注入凝胶柱中,含同化激素的两段含同化激素的两段馏分被切入到硅胶柱馏分被切入到硅胶柱(富集柱富集柱)中中,群勃龙和去甲睾酮激群勃龙和去甲睾酮激素在富集柱中被浓缩纯化素在富集柱中被浓缩纯化(chn hu),洗脱后流入氰基柱中洗脱后流入氰基柱中,再通过柱切换再通过柱切换,流入硅胶分析柱中分离测定。流入硅胶分析柱中分离测定。第四十页，共六十七页。l醋酸醋酸(c sun)美仑孕酮为中性、脂溶性的类固醇美仑孕酮为中性、脂溶性的类固醇,固相萃取固相萃取法对牛组织提取液中醋酸美仑孕酮的提取纯化效果欠法对牛组织提取液中醋酸美仑孕酮的提取纯化效果欠佳佳,故采用故采用柱切换柱切换。l其过程为粗提取液注入其过程为粗提取液注入苯基柱苯基柱中作初级分离中作初级分离,含分析含分析物的馏分被切换到物的馏分被切换到硅胶预富集柱硅胶预富集柱中中,浓缩提纯后再通浓缩提纯后再通过柱切换洗脱至过柱切换洗脱至硅胶分析柱硅胶分析柱中分离测定中分离测定;若收集馏分若收集馏分,可可用于用于GC-MS分析。分析。第四十一页，共六十七页。免疫免疫(miny)亲和柱色谱法亲和柱色谱法l免疫亲和柱具有专一性高的优点免疫亲和柱具有专一性高的优点,但适合但适合同化激素同化激素(j s)纯化纯化的免疫亲的免疫亲和柱目前还不多。和柱目前还不多。l对于多残留分析对于多残留分析,可将几种免疫亲和固定相配伍使用。可将几种免疫亲和固定相配伍使用。l免疫亲和柱已应用于生物样品中己烯雄酚、双烯雌酚和己烷雌酚免疫亲和柱已应用于生物样品中己烯雄酚、双烯雌酚和己烷雌酚的纯化的纯化,以及肉和尿中去甲睾酮、睾酮和群勃龙的纯化。以及肉和尿中去甲睾酮、睾酮和群勃龙的纯化。l此外此外,亦有报道采用亦有报道采用在线免疫亲和色谱法在线免疫亲和色谱法,对生物样品中的去甲对生物样品中的去甲睾酮及其表代谢物进行纯化。睾酮及其表代谢物进行纯化。第四十二页，共六十七页。超临界流体超临界流体(lit)色谱法色谱法l超临界流体萃取可以在低温条件下获得无溶剂的提取超临界流体萃取可以在低温条件下获得无溶剂的提取物物,且快速且快速,但从生物样品中分离激素的研究目前还很少。但从生物样品中分离激素的研究目前还很少。l有报道采用超临界流体萃取和超临界流体色谱相结合有报道采用超临界流体萃取和超临界流体色谱相结合,用用来检测猪肾中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚残留。来检测猪肾中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚残留。l超临界超临界CO2提取时提取时,同化激素被柱子同化激素被柱子(zh zi)保留保留,而非极性而非极性的内源性物质不被保留的内源性物质不被保留,然后换流动相来洗脱激素然后换流动相来洗脱激素,串联串联质谱检测。质谱检测。第四十三页，共六十七页。l用超临界用超临界CO2提取牛组织中提取牛组织中7种促生长激素种促生长激素,发现极性药物发现极性药物(地塞地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇米松、曲安奈德、玉米赤霉醇)的回收率偏低的回收率偏低,约约44%58%,非极性非极性药物药物(醋酸美仑孕酮、甲羟孕酮、己烯雌酚醋酸美仑孕酮、甲羟孕酮、己烯雌酚)的回收率相当高的回收率相当高,约约83%91%。l由于共萃取物的干扰由于共萃取物的干扰,群勃龙不能被检测到群勃龙不能被检测到,尤其是脂肪和肝脏样品尤其是脂肪和肝脏样品中的共萃取物中的共萃取物,对群勃龙的色谱峰有严重干扰。因此对群勃龙的色谱峰有严重干扰。因此,超临界流体超临界流体萃取法并不能取代所有的样品处理萃取法并不能取代所有的样品处理(chl)方法。方法。l在超临界流体萃取前后在超临界流体萃取前后,还需要其他净化方法加以处理。还需要其他净化方法加以处理。第四十四页，共六十七页。三、分析方法三、分析方法（一）（一）皮质激素分析方法皮质激素分析方法l有关有关(yugun)动物性食品中皮质激素类的残留分析动物性食品中皮质激素类的残留分析,文献报道很少。文献报道很少。l皮质激素类的残留分析主要采用皮质激素类的残留分析主要采用色谱法色谱法,包括薄层色谱法、液包括薄层色谱法、液相色谱法和气相色谱法。相色谱法和气相色谱法。第四十五页，共六十七页。1、薄层、薄层(bo cn)色谱法色谱法l薄层色谱法具有设备简单、经济等优点薄层色谱法具有设备简单、经济等优点,适合生物样品的筛选分析。适合生物样品的筛选分析。l早期早期(zoq)采用苯肼硫酸溶液作显色剂采用苯肼硫酸溶液作显色剂,后来采用其他一些后来采用其他一些显色剂显色剂,如如磷酸甲醇溶液、四唑蓝、对甲苯磺酸和磷酸甲醇溶液、四唑蓝、对甲苯磺酸和2,3,5-三苯基三苯基-2H-四唑四唑氯。氯。lVanoosthyze等建立了一种等建立了一种高效薄层色谱法高效薄层色谱法,能够检测注射部位中能够检测注