第章基因重组和基因工程本科.ppt

目录目录 基因重组和基因工程基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第1414章章目录目录第二节第二节 重组重组DNADNA技术技术又称又称DNADNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录目录重组重组DNADNA技术的发展史技术的发展史18651865年年 G.J.MendelG.J.Mendel的豌豆的豌豆杂交试验杂交试验。19441944年年 O.T.AveryO.T.Avery的肺炎球菌的肺炎球菌转化实验转化实验。19731973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组重组DNADNA分子分子。19771977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传第一家遗传工程公司工程公司，专门应用重组，专门应用重组DNADNA技术制造医学上重要的药技术制造医学上重要的药物。物。19801980年年 开始建造第一家应开始建造第一家应用重组用重组DNADNA技术生产胰岛素技术生产胰岛素的工厂。的工厂。19971997年年 英国罗林研究所成功的英国罗林研究所成功的克隆了多莉克隆了多莉。目录目录148148天天目录目录u 克隆是人类在生物科学领域取得的一克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步。细胞培养和控制技术的进步。原是英文原是英文cloneclone的音译，意为生物体通过细胞进行的无的音译，意为生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为成的种群，简称为“无性繁殖无性繁殖”。目录目录一、重组一、重组DNADNA技术相关概念技术相关概念克隆克隆(clone):(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。拷贝的集合。（）获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)(cloning)，即无性繁殖。，即无性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆目录目录技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)(molecular clone)（即（即DNA DNA 克隆）克隆）将某一特定将某一特定DNADNA片段通过重组片段通过重组DNADNA技术插入到一技术插入到一个载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得个载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该到的大量完全相同的该DNADNA片段的片段的“群体群体”。细胞克隆：由单一的共同祖先细胞分裂形成的细胞细胞克隆：由单一的共同祖先细胞分裂形成的细胞 群体。群体。个体克隆（动物或植物）：基因完全相同的两个或个体克隆（动物或植物）：基因完全相同的两个或 更多的个体组成的群体。更多的个体组成的群体。目录目录应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNADNA）与与载载体体DNADNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNADNA分分子子复复制制子子(replicon)(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNADNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或重重组组DNA DNA(recombinant DNA)(recombinant DNA)。DNADNA克隆克隆（）目录目录DNADNA克隆克隆各种来源各种来源DNA载体载体DNA复制子复制子(replicon)(replicon)酶学方法酶学方法宿主细胞宿主细胞转染转染转化转化转化子细胞转化子细胞筛选筛选扩增扩增提取提取获得大量同一获得大量同一DNADNA分子分子目录目录生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)(genetic engineering)实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组程，又称重组DNADNA工艺学。工艺学。（）目录目录（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 KlenowKlenow片段：片段：DNADNA聚合酶聚合酶大片段大片段 逆转录酶逆转录酶 DNADNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目录目录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction restriction endonuclease)endonuclease)限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction(restriction endonuclease,endonuclease,RE)RE)是是识识别别DNADNA的的特特异异序序列列,并并在识别位点或其周围切割双链在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam Bam HH定义：定义：（）目录目录此此酶酶存存在在于于细细菌菌体体内内，与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制-修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNADNA，保护自身，保护自身DNADNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类：作用：作用：目录目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：H Hinin d d 属属 系系 株株 序序H Haemophilus aemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶目录目录 双链双链DNADNA中含有两个结构相同、方向相反的序中含有两个结构相同、方向相反的序列，称为反向重复序列，也叫回文结构。即每条列，称为反向重复序列，也叫回文结构。即每条单链以任一方向阅读时与另一条链以相同方向阅单链以任一方向阅读时与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的。读时的序列是一致的。限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构（）目录目录Bam Bam HHGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHinHinddGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口（切割点是识别序列的对称轴）（切割点是识别序列的对称轴）粘端切口粘端切口切口切口 ：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口5粘性末端粘性末端 3粘性末端粘性末端目录目录3 3突出粘性末端突出粘性末端GATCC G+5 5突出粘性末端突出粘性末端GATCC G+GCCTAG5GCCTAG3目录目录来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam Bam HHGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BstBst同功异源酶：同功异源酶：目录目录有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNADNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)(compatible end)。Bam Bam Bam Bam HHHHBg Bg Bg Bg llll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称名称 识别识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产产生生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶目录目录（三）目的基因（三）目的基因(target gene)(target gene)（）cDNA(complementary DNA)cDNA(complementary DNA)指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA(RNA(通常指通常指mRNAmRNA或病毒或病毒RNA)RNA)互补的单链互补的单链DNADNA。以单链。以单链cDNAcDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNAcDNA。基因组基因组DNA(genomic DNA)DNA(genomic DNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNADNA序列。序列。目录目录（四）基因载体（四）基因载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。常用载体常用载体（）质粒质粒DNADNA、噬菌体、噬菌体DNADNA、病毒、病毒DNADNA这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。基因、单一的限制酶切点等。目录目录n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。目录目录克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目录目录1.1.质粒质粒 (plasmid)(plasmid)特特点点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗传信息遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。概念：概念：是存在于细菌染色是存在于细菌染色体外的小型环状双链体外的小型环状双链DNADNA分分子，大小为子，大小为1-200kb1-200kb。耐四环素基因耐四环素基因耐氨苄青霉素基因耐氨苄青霉素基因目录目录 噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统 gtgt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNAcDNA克隆）克隆）EMBLEMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage)(phage)M13M13噬菌体噬菌体DNADNA改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因）基因）M13mpM13mp系列系列线性双链线性双链DNADNA分子，大小约分子，大小约50kb50kb。目录目录 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)(yeast artificial chromosome,YAC)柯斯质粒载体柯斯质粒载体 (cosmid vector)(cosmid vector)动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）3.3.其他其他目录目录 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNADNA 克克 隆隆 过过 程程目录目录二、重组二、重组DNADNA技术基本原理技术基本原理（）目的基因的获取目的基因的获取DNADNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 目录目录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。2.2.基因组基因组DNADNA文库文库(genomic DNA library)(genomic DNA library)3.3.cDNAcDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)4.4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain(polymerase chain reaction,PCR)(reaction,PCR)(见第见第2222章章)目录目录THANK YOUSUCCESS2024/5/8 周三34可编辑目录目录已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列已知基因产物的氨基酸序列已知基因产物的氨基酸序列 。化学合成法化学合成法推导出编码基因核苷酸序列推导出编码基因核苷酸序列化学合成仪化学合成仪合成目的基因合成目的基因 一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰岛素原、一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰岛素原、干扰素基因等。干扰素基因等。目录目录化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列。序列。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNADNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNADNA的集合的集合从基因组从基因组DNADNA文库文库获取目的基因获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNADNA片段构建基因文库片段构建基因文库 目录目录 以以mRNAmRNA为模版，反转录合成为模版，反转录合成cDNA cDNA，与载体拼接后导入受体菌，即获得与载体拼接后导入受体菌，即获得cDNAcDNA文库。文库。由总由总mRNA mRNA 制作的制作的cDNAcDNA文库包含了细胞表达的文库包含了细胞表达的各种各种mRNAmRNA信息，自然也含有我们感兴趣的基信息，自然也含有我们感兴趣的基因。目前发现的多数蛋白质的编码基因都是因。目前发现的多数蛋白质的编码基因都是如此分离的。如此分离的。从从cDNAcDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNAcDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建外源外源DNADNA片断离开染色体是不能复制的，片断离开染色体是不能复制的，必必须借助载体，随载体的复制而复制，重组须借助载体，随载体的复制而复制，重组DNADNA技技术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术型术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术型的专门工作，目的不同、操作基因的性质不同的专门工作，目的不同、操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。目录目录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接 即即DNADNA的体外重组，靠的体外重组，靠DNADNA连接酶将外连接酶将外源基因与载体共价连接，其连接方式主要有：源基因与载体共价连接，其连接方式主要有：1 1）同一限制酶切位点连接）同一限制酶切位点连接 2 2）配伍末端连接）配伍末端连接2 2、平端连接：、平端连接：非配伍粘性末端经特殊酶处理，使非配伍粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。端连接。目录目录目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目录目录3 3、同聚物加尾连接、同聚物加尾连接 在末端转移酶作用下，在在末端转移酶作用下，在DNADNA片断末端加上同片断末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，而后进行粘性末端接。聚物序列，制造出粘性末端，而后进行粘性末端接。4 4、人工接头连接、人工接头连接 对平端对平端DNADNA片断或载体片断或载体DNADNA可在连接前将磷酸可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端，使产生新的酶切化的接头或适当分子连到平末端，使产生新的酶切位点，再用识别新位点的限制酶切割，产生粘性末位点，再用识别新位点的限制酶切割，产生粘性末端，这也是粘性末端连接的一种特殊形式。端，这也是粘性末端连接的一种特殊形式。目录目录（四）重组（四）重组DNADNA导入受体菌导入受体菌u外源外源DNA(DNA(含目的含目的DNA)DNA)与载体在体外连接成重组与载体在体外连接成重组DNADNA分子后，需将其导入受体细胞分子后，需将其导入受体细胞(形成转化子形成转化子)。随受。随受体细胞生长、增殖，重组体细胞生长、增殖，重组DNADNA分子也复制、扩增，这分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖。一过程即为无性繁殖。目录目录受体菌条件：受体菌条件：1 1）容易接纳重组分子）容易接纳重组分子2 2）对载体的复制扩增无严格要求）对载体的复制扩增无严格要求3 3）不存在特异的限制）不存在特异的限制-修饰酶体系降解或修修饰酶体系降解或修饰饰 外源外源DNADNA4 4）符合）符合“重组重组DNADNA操作规则操作规则”的安全标准。的安全标准。目录目录1.1.直接选择法直接选择法(1)(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)(2)标志补救标志补救(marker rescue)(marker rescue)(3)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交SouthernSouthern印迹印迹2.2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选目录目录对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。入灭活法进行筛选。抗药性标记选择抗药性标记选择(插入失活法插入失活法)目录目录概念：若克隆的基因能够在宿主菌表达，概念：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救。就是标志补救。例如：例如：u标志补救标志补救目录目录组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成 噬菌体噬菌体DNADNA重组体重组体标标志志补补救救目录目录互补互补(alpha complementation)(alpha complementation)Lac Z-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端端146个氨基酸残基个氨基酸残基C端端2 2个片段组合后有活性，可使个片段组合后有活性，可使X-galX-gal水解成深蓝水解成深蓝色产物。色产物。X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲吲哚哚-b-D-b-D-半半乳乳糖糖）形形成成蓝蓝色菌落色菌落目录目录 蓝白筛选示意图蓝白筛选示意图 互互补补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18pUC18 目录目录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小结小结（）分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 目录目录重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤（）载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目录目录蛋白质表达体系的建立：蛋白质表达体系的建立：表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达表达体系包括原核表达体系和真核表达体系两类。表达体系包括原核表达体系和真核表达体系两类。目录目录1.1.原核表达体系原核表达体系 （E.coliE.coli表达体系最为常用表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coliE.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNADNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body)(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白（）目录目录优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNAcDNA及真核基因组及真核基因组DNADNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济2.2.真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞酵母、昆虫、哺乳类动物细胞应用较多的哺乳类细胞是应用较多的哺乳类细胞是（）COSCOS细胞（猿猴肾细胞）细胞（猿猴肾细胞）CHO CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞）细胞（中国仓鼠卵巢细胞）目录目录第三节第三节 重组重组DNADNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine Closly Related with Medicine and has a Good Perspectiveand has a Good Perspective目录目录一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。疾病基因发现的两个典型例子疾病基因发现的两个典型例子:脆性脆性X X综合征综合征KallmannKallmann综合征综合征目录目录二、生二、生物制药物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。美国美国Eli LillyEli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有物工程药物时代的开始。迄今为止，已有5050多种基因工程药物上市，近千种处于研发状多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。不可估量的社会效益和经济效益。目录目录 重组重组DNADNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱目录目录（一）基因诊断（一）基因诊断(genetic diagnosis)(genetic diagnosis)基基因因诊诊断断是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNADNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因的置换、缺失或插入等突变。因的置换、缺失或插入等突变。（）三、基因诊断与基因治疗三、基因诊断与基因治疗基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNADNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNADNA片断片断目录目录标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNADNA的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。目录目录（二）基因治疗（二）基因治疗1.1.定义定义（）基因治疗基因治疗(gene therapy)(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。2.2.方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene(somatic cell gene therapy)therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene(germ line gene therapy)therapy)目录目录四、遗传疾病的预防四、遗传疾病的预防1.1.产前诊断产前诊断2.2.携带者测试携带者测试3.3.症候前诊断症候前诊断4.4.遗传病易感性遗传病易感性目录目录THANK YOUSUCCESS2024/5/8 周三67可编辑