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生物检测PCR技术.ppt
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1、生物技术教研室:郑 鸣目 录pPCR技术简史 pPCR的原理pPCR的反应条件pPCR的类型和应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史
2、DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年,Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,
3、所以,Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR)基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mul
4、lis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR只是一个简单的不起眼玩艺。凯利穆利斯(KaryMullis)我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR,我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作,学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。凯利穆利斯(KaryMullis)生物样品生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物Mullis的构思DNA聚合酶D
5、NA聚合酶特定DNA片段94变性50-65退火XX延伸945537Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20729455PCR循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间(min)温度()PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温
6、退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理1234522557294时间(min)温度()适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理50引物1引物2DNA引物PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理72引物1引物2DNA引
7、物Taq酶Taq酶PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理第1轮结束95第2轮开始PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理955072TaqTaqTaqTaqPCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理72第2轮结束PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3
8、个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性高引物的特异性。引物延伸时,碱基配对的正确性。TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域,扩增产物的特异性程度就更高。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点简便、快速整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成,过程也只是简单的温度变化,耐高温的Taq DNA聚合酶的应用,避免了DNA聚合酶的反复加入。一次性加好反应液,24 小时完成扩增对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCRPCR反应五要素反应五要素引物(引物(primerprimer)酶酶
9、(Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase)dNTP dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP)模板模板 (templatetemplate)MgMg2+2+(magnesiummagnesium)引物(primer)引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计是PCR 技术中至关重要的一环,使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的
10、多条带,不出带或出带很弱,等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。引物设计的基本原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物(primer)具体因素引物长度(primer length)产物长度(product length)序列Tm 值(melting temperature)引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,用G 值反映)形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值在错配位点(fa
11、lse priming site)的引发效率,引物及产物的GC 含量(composition)引物(primer)u引物的长度:一般为15-30 bp,常用的是18-24 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,即Taq 酶的最适温度。引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于16bp是必要的(不容易引起错配)。例如:一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物(28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位
12、点。引物(primer)引物设计的一般原则引物(primer)引物设计的一般原则u引物的Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过46度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.经验公式:Tm=2(A+T)+4(C+G)(primer5.0)Nearest nei:最近邻位(oligo6.0)引物(primer)引物设计的一般原则u引物序列的GC含量 一般为40-60%,以45-55为宜,过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的
13、GC 含量以及Tm 值保持接近(上下游引物的GC含量不能相差太大),以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出,则在引物的5端增加A或T;而如果A-T比例过高,则同样在5端增加G或C。u引物3端的序列要比5端重要 引物3端的碱基一般不用A(3端碱基序列最好是G、C、CG、GC),因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不大,因此常用来引进修饰位点或标记物。引物(primer)引物设计的一般原则u引物序列在模板内应当没有相似性较高、尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基
14、,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。u引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物(primer)引物设计的一般原则u可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性,相似性高则错误引发率高。错误引发的引发率一般不要高过100,如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为450 以上,而在错误位点的引发效率为130,并且不好找其他更合适的引物,那么这对引物也是可以接受的。引物(primer)引物设计的一般原则uG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度,该值反映了
15、双链结构内部碱基对的相对稳定性。一般情况下,引物的G值最好呈正弦曲线形状,即5端和中间G值较高,而3端G值相对较低,且不要超过9(G值为负值,这里取绝对值),如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物的3端的G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。(能值越高越容易结合)引物(primer)引物设计的一般原则u引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行。与二聚体相关的一个参数是碱基的分布,3端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定,越不符合要求。与二聚体相同,发夹结
16、构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环,其G为3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果,但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦,即会引发引物内部的延伸反应,减少了参与正式反应引物的数量。当然,如果发夹环在5末端对反应就没有多大的影响了。引物(primer)引物设计的一般原则Oligo 6(引物评价)*Primer Premier(自动搜索)*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 (在线服务)*引物(primer)引物设计的常用软件Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 的的使用简介使用简介主要功能:引
17、物设计限制性内切酶位点分析DNA 基元(motif)查找同源性分析简并引物设计简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)2、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion)3、支原体(Mycoplasma)4、植物线粒体(Plant Mitochondrion)5、原生动物线粒体(Protozoan Mitochondrion)6、一般标准(Standard)7、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondrion)8、酵母线粒体
18、(Yeast Mitochondrion)Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)PreimerPremier启动界面Load sequence基本信息基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面引物设计界面Sensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprime
19、rFirstyoucandesigntheprimermanually引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏都none,But引物编辑引物编辑引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresult
20、Returntothemainwindow用用primer5.0primer5.0对引物评价对引物评价duplex formation:这是评价引物二聚体形成的,包括自身形成二聚体和引物间二聚体,形成二聚体的能值,引物3端有无配对碱基(最好没有)。hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构,主要也是看3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值,不超过4.5。false priming site:如果模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,需要进行错配的分析,看你的引物(尤其3端)是否与特定模板的其他位点结合。PCR:总结性的显示引物位置,产物大小,Tm值等参数,你
21、可以横向比较一下,Oligo 6.0 Oligo 6.0 使用说明使用说明主要功能:专门的引物设计和分析软件Oligo 6.44 Oligo 6.44 启动界面启动界面Opensequencefile3 3个弹出窗口个弹出窗口MeltingtemperatureMeltingtemperatureG Internal StabilityFrq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。用用Oligo Oligo 设计引物时的设计引物时的3 3个标准个标准Tm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线宜选用3端Frq
22、值相对较低的片段。G 值在5端和中间值比较高,而在3端相对低。选中引物选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析引物分析首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。引物分析引物分析二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。引物分析引物分析第三项检查为GC 含量,以45-55为宜。第四False priming 检查引物分析引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformationFinal PCR informationFinal PCR informationSear
23、ch for primer using Oligo Search for primer using Oligo 6.06.0Searchprimer利用利用oligo6.0oligo6.0进行引物评价进行引物评价duplex formation:这是评价引物二聚体形成的,包括自身形成二聚体和引物间二聚体,主要是看引物3端有无配对碱基(最好没有)。形成的二聚体要看能值,能值越低越好,最好不要超过4.5hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构,主要也是看3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值,不超过4.5。如果引物中加入酶切位点,可能会有发夹结构且能值不会太低,这就
24、需要灵活控制退火温度了。composition and Tm:分析上下游引物的碱基组成,GC比和Tm值,原则我就不多说了。falseprimingsite:如果模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,需要进行错配的分析,看你的引物(尤其3端)是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好,但并不绝对,如果正确结合位点的引发效率为450以上,而有一个错配的引发效率是120左右的,这个引物也是可以接受地!PCR:总结性的显示引物位置,产物大小,Tm值等参数,你可以横向比较一下,尤其是给了一个optimalannealingtem还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。利
25、用利用oligo6.0oligo6.0进行引物评价进行引物评价每条引物的浓度0.1 1umol或10100 pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。引物(primer)引物浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应天然酶:从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶:大肠菌合成一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100 ul时)浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少酶(Taq DNA polymerase)dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关
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