生物技术在天然药物研究中的应用.ppt

生物技术在天然药物研究中的应用马建苹马建苹Tel:0931-2976699(O)E-mail: 绪论一天然药物生物转化基本概念 生物转化技术:应用植物细胞培养体系、微生物或酶等生物体系对外源化合物进行合成和结构修饰。天然药物生物转化：利用生物转化技术对天然活性化合物进行合成和结构修饰。喜树碱人参皂苷Rh2紫杉醇二天然药物生物转化的发展第一阶段：植物组织和细胞培养罗汉果怀地黄人参第二阶段：悬浮细胞培养紫草红豆杉黄芪三天然药物生物转化的特点1.专一性强2.副产物少、产量高3.反应条件温和 常温 常压 pH近中性4.可以进行化学方法难以进行的反应第三阶段：微生物、酶转化技术的应用泼尼松四生物转化在天然药物研究中的应用1.为天然药物的生产提供有效途径2.为天然药物的结构修饰与设计提供新的工具3.结合药物筛选,为新药开发提供了研究手段4.提高天然活性成分的生物利用度5.成为中药制剂中除去大分子杂质的有效方法 天然药物的微生物转化一微生物转化的应用 微生物转化:通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰,也就是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。特点:生物量积累快 转化时间短 转化酶表达效率高 便于工业化生产（一）在有机合成领域的应用 应用于微生物转化的酶：乙酰转移酶、糖苷酶、糖基转移酶、环氧酶、羟基化酶、醛缩酶等。六大类：氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂合酶类 异构酶类 合成酶（连接酶）类优点：高度选择性（化学、区域、非对映体、对映体选择性）反应条件温和 酶种类多样 酶量充足 转化效率高 产品质量稳定 对环境污染少缺点：酶易失活（pH、温度和高盐浓度）产物和底物的抑制现象1.手性化合物合成与拆分 “反应停”（沙利度安）事件 R-对映体 镇静作用 S-对映体 致畸作用 手性化技术：色谱法 化学不对称合成法 生物合成与拆分法项目色谱法化学法生物法生产效率选择源手性源产率产物回收操作条件生产成本必需条件生产规模开发周期开发成本法律限制低较高需要较高简单常温常压高基础和方法研究小短低小高变动需要变动一般高温高压可变需要新反应验证可大长高大中高不需要高比较复杂常温常压中酶筛选、酶工程可大较短中一般三种手性化技术方法的比较生物合成手性化合物：外消旋体拆分为两个光活性对映体 酶催化生成不对称的光活性产物实例：消旋布洛芬酰胺Rhodococcus AJ270S-布洛芬黑根酶 90%2.食品添加剂的合成 维生素C的合成D-葡萄糖H2/NiD-山梨醇L-山梨糖2-酮基-L-古龙酸维生素C乙酸杆菌混合菌烯醇化、内酯化香草醛的合成微生物-氧化诺卡菌（二）在新药开发中的应用 新药合成：化学合成 生物转化 生物转化方法：天然活性成分（先导化合物）结构新颖的化合物 发现关键活性成分利用多种不同催化功能的酶系（三）作为体外模型预测代谢 药物代谢：研究药物分子在体内以不同的规模发生的生物化学转化 相代谢functionalization：氧化、还原、水解 相代谢conjugation：葡萄糖醛酸结合、硫酸结合、谷光甘肽结合 预测代谢的优点：可提供大量的筛选模型 成本较低、操作简单、易于控制 调节优化条件，显著提高代谢产物收率，作为代谢产物的对照品进行药 理和毒理研究 减少实验动物用量二微生物转化方法（一）微生物转化的反应1.应用于氧化反应（1）脱氢反应 细菌（2）羟基化反应 放线菌2.应用于水解反应 细菌、酵母菌和霉菌3.应用于还原反应 酵母菌和霉菌4.应用于酰基化反应 细菌5.应用于降解反应 细菌6.应用于脱水反应 细菌和霉菌（二）微生物转化的一般过程1.选择菌种2.制备培养基3.加转化底物4.添加刺激剂或抑制剂5.控制好转化反应培养时间6.调控好影响因素7.控制好转化反应终点8.分离纯化转化产物（三）几种常用的微生物转化方法1.分批培养转化法2.利用酶进行生物转化3.应用渗透细胞进行生物转化4.应用孢子进行生物转化5.应用固定化细胞进行生物转化6.应用干燥细胞进行生物转化7.静息细胞转化法（四）微生物转化反应的特点1.反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快2.可以减少反应步骤3.对立体结构合成上具有高度的专一性4.回收率高、成本低三微生物转化的影响因素1.转化的时间和温度2.底物添加方法3.酶的抑制剂4.酶的诱导剂5.生长调节剂四新技术在微生物转化中的应用1.基因工程技术2.固定化细胞转化技术3.双水相转化技术4.超声波技术5.有机介质中的微生物转化6.生物反应器的应用7.核磁共振、质谱技术五天然药物的微生物转化 结构修饰和改造 复杂结构天然产物 转化产生新的组合天 然化合物群 改变药物的功能疗效 定向合成 天然活性成分含量低 以微生物为反应器 定向合成（一）喜树碱喜树碱，20(S)-camptothecin，CPTl 1966年美国化学家Wall和Wani从喜树Camptotheca acuminata Decne中分离得到l 具有较强抗肿瘤和抗病毒活性的生物碱成分u 不具有明显的生物碱性质近中性分子u 不溶于酸，与酸不成盐，难溶于水及一般有机溶剂 可溶于吡啶、二甲基亚砜、乙酸和氯仿与甲醇的混合液，呈蓝色荧光u 对光、热敏感，光照射后，吸光度降低，避光稳定，加热可使喜树碱分解 分子式 C20H16N2O4 M 348.36 熔点 258-263拓扑特肯，Topotecan，TPT依诺替康，Irinotecan，CPT-11羟喜树碱l动物药理和临床试验证明，羟喜树碱有较好的治疗效果和较低的毒副反应 1977年，国内通过鉴定，治疗肝癌、胃癌和白血病等l喜树碱及其衍生物对卵巢癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、直肠癌和白血病等 恶性肿瘤均有一定的疗效l 1992年，TPT和CPT-11获美国FDA认证，是卵巢癌和结肠癌的特效抗肿瘤药物l 羟喜树碱得率非常低，约为生药的十万分之二l 提取过程需用大量有毒的氯仿和甲醇l 利用含量较高的喜树碱（万分之七）生物转化曲霉T-36黄曲霉T-41920%50%（二）雷公藤内酯u 中药雷公藤来源于卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.的根、叶及花u 产于福建、浙江、安徽、湖南、湖北、贵州等地，主要分布在长江中下游地区u 临床上治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、麻风病、自身免疫性疾病、皮肤病u 化学成分有生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类、糖和木质素类u 雷公藤二萜属松香烷型二萜，多数具有,-不饱和内酯结构u 具有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤等多种显著生理活性u 肾毒性大，限制了临床应用雷公藤甲素的微生物转化雷公藤甲素5-羟基19-羟基19-羟基16-羟基雷公藤乙素15-羟基1-羟基Cunninghamellablakesleana雷公藤内酯酮的微生物转化Aspergillus niger雷公藤内酯酮雷公藤甲素17-羟基16-羟基5-羟基u 除19-位羟基化产物外，大多数转化产物表现出较强的体外细胞毒活性u 对BGC-823、Hela、HL-60、KB等人癌细胞株 IC50 10-8-10-7 M 均比底物有所降低（三）鬼臼毒素u 小檗科植物喜马拉雅鬼臼Podophyllum emodi和美洲鬼臼P.peltatum分离得到u 1946年King和Sullivan证实鬼臼树脂和鬼臼毒素对动物实验癌细胞有破坏作用u 副作用太大，影响临床应用u 50年代开始对鬼臼毒素进行结构改造鬼臼毒素，Podophyllotoxin 无色针状结晶 分子式C22H22O8 M 414 熔点112-117 溶于乙醇、氯仿、丙酮、热苯、冰醋酸u70年代出现2个半合成抗肿瘤药物鬼臼乙叉苷，Etoposide，VP-16鬼臼甲叉苷，Teniposide，VM-26依托泊苷特尼泊苷u 1984和1992年，美国FDA批准依托泊苷和特尼泊苷上市u 全球市场份额达40-100亿美金u 两种抗癌药对淋巴肉瘤、膀胱癌、乳腺癌和儿童急性白血病有效u依托泊苷对小细胞肺癌、淋巴瘤疗效显著 对卵巢癌、乳腺癌、神经母细胞瘤也有效 毒副作用大、生物利用率低和难溶于水NPFGL331（四）蟾毒配基l 蟾酥为两栖纲无尾目蟾蜍科中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor和黑眶蟾蜍 Bufo melanostictus Schneider耳后腺和皮肤腺分泌物的干燥物l 复方和中成药配伍中具有重要地位 如“六神丸”和“症喉丸”l 西欧，17-18世纪用蟾皮干燥粉末治疗浮肿l 蟾酥主要有效成分为蟾毒配基类bufogenins化合物，具有很强的强心升压作用蟾毒配基类化合物基本骨架l 华蟾毒精、蟾毒灵和脂蟾毒配基的含量最高，三者约占药材干重10%l 具有强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗肿瘤等生理活性 对肿瘤细胞 IC50 1-100 nM 蟾毒灵活性尤为显著l 抗肿瘤的作用机制通过诱导细胞凋亡，促进细胞分化cinobufagin华蟾毒精bufalin蟾毒灵resibufogenin脂蟾毒配基华蟾毒精的微生物转化n Mucor，Alternaria，Syncephalastrumn 选择链格孢A.alternata AS3.4578制备转化华蟾毒精+3-羰基-12-羟基12-羟基12-羟基-去乙酰3-羰基-12-羟基3-羰基-12-羟基-去乙酰12-羰基蟾毒灵的微生物转化n 选择刺囊毛霉Mucor spinosus AS3.3450制备转化蟾毒灵1-羟基15 -羟基15-羟基5-羟基12-羟基7-羟基11-羟基16-羟基7,16-二羟基1,7-二羟基1,12-二羟基3-表-7-羟基脂蟾毒配基的微生物转化n 选择细孢毛霉Mucor subtilissimus AS3.2454制备转化脂蟾毒配基11-羟基12-羟基16-羟基1,11-二羟基1,12-二羟基12,16-二羟基12-O-D-葡萄糖苷（五）大黄蒽醌类u 蓼科掌叶大黄 Rheum palmatum L.唐古特大黄 R.tanguticum Maxim.Ex Reg.南大黄 R.officinale Baill.的根状茎u 产于四川、甘肃、青海、西藏、宁夏、陕西、湖北、云南、贵州等地u 生用或酒制、蒸熟、炒黑用u 功效：泻下、健胃、清热、解毒u 富含的大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素，具致泻和抗菌作用u 刺囊毛酶Mucor spinosus对大黄酚、大黄素甲醚、大黄素具有转化作用u 蓝色梨头酶3.3389可以使大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素糖苷化大黄酚大黄素甲醚大黄素Mucor spinosus285天Mucor spinosus285天Mucor spinosus285天Mucor spinosus285天（六）麻黄碱n 又称麻黄素，l-麻黄碱和 d-伪麻黄碱是麻黄的主要活性成分n 麻黄碱属拟肾上腺激动药 治疗支气管哮喘、各种咳嗽、过敏反应、低血压等症 还具有松弛平滑肌、收缩血管、加速心率、升高血压及中枢神经兴奋作用n 伪麻黄碱为拟交感神经药 收缩上呼吸道黏膜血管作用 与麻黄碱相当 升压作用 只及l-麻黄碱一半 对心血管和中枢神经系统兴奋作用 明显弱于麻黄碱 加快心率、升高血压、中枢兴奋等不良反应较轻 有显著的利尿作用n 临床上治疗感冒如白加黑、新康泰克、银得菲、泰诺感冒片等 治疗咳嗽如定喘宁胶囊、小儿止咳糖浆生产方式l 植物提取法l 直接化学合成法l 半生物合成法l 微生物直接转化法 国内外报道很少丙酮酸脱羧酶CO2L-麻黄碱D-麻黄碱（七）延胡索素n 罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang块茎的化学成分n 延胡索性微温，味辛，能和血散瘀、行气止痛 具有镇痛、镇静、安定及催眠作用 对慢性持续性疼痛效果较好 对创伤及手术后疼痛作用较差n 主要有延胡索甲素、乙素、丙素、丁素、戊素、己素等n 延胡索乙素dl-tetrahydropalmatine,THP为优良的镇痛、镇静、催眠药物延胡索乙素THPStreptomyces griseus左旋四氢帕马丁L-tetrahydropalmatine,L-THP左旋紫堇达明L-corydalmin,L-CDL 天然药物的酶法生物转化酶的特性：u 加快反应速度u 降低反应活化能u 不改变反应性质u 反应前后数量和性质不变u 催化效率高 酶催化比非酶催化快106-1012 催化剂用量少u 专一性强 作用的底物和催化反应都是高度专一的u 反应条件温和 pH5-8 温度 20-40u 酶的催化活性受到调节和控制一酶生物转化的方式（一）酶与底物的结合方式 1.酶与底物多点结合 2.酶-底物络合物的形成和分解 3.分子内催化 4.静电催化 5.金属离子催化（二）反应的类型 1.氧化还原方式(oxidoreductase)催化底物分子发生电子迁移过程 体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成 常需要辅酶NAD或NADP以及FAD或FMN参与，有的不需要辅酶参与 各种脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶和细胞色素氧化酶 2.转移基团方式(transferase)催化功能团转移 体内参与核酸、蛋白质、糖及脂肪的代谢和合成 转氨酶、糖基转移酶、羰基转移酶、酮醛基转移酶和酰基转移酶 3.水解方式(hydrolase)降解作用 来源丰富 应用广泛 脂肪酶、糖苷酶和蛋白酶 4.裂解方式(lyase)脱去底物上某基团留下双键或在双键处加入基团 5.异构体转化方式(isomerase)生物代谢需要进行分子异构化 外消旋、差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移和分子内裂解 6.连接方式(ligase)关系很多生命物质的合成 如脂酰CoA合成酶二酶生物转化的调节（一）转化的时间和温度（二）转化的pH（三）转化体系中的水含量（四）有机溶剂对酶转化的影响（五）激活剂和抑制剂对酶转化的影响（六）表面活性剂对酶转化的影响（七）射线对酶反应的影响（八）超声波对酶反应的影响三天然药物酶法生物转化（一）紫杉醇Streptomyces sp.MA 7065羟 基 化紫杉醇水 解 反 应sinenxan A可水解稳定Microsphaeropsis onychiuriMucor sp.10-deacetyl-7-epitaxol10-deacetylbacctin 酰 化 反 应C.echinulata10-deacetylbacctin bacctin（二）皂苷类人 参 皂 苷u 三萜皂苷 分为三类：二醇型 如Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rh2 三醇型 如Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1 齐墩果酸型 如R0，Rh3u 人参皂苷没有化学合成的，从人参植株或愈伤组织提取u 人参稀有皂苷包括Rh1，Rh2，Rh3，Rg1，Rg3，Rg5u 人参稀有皂苷具有很高的生理活性 抗癌 软化血管和抗癌ReRg1人参皂苷-鼠李糖苷酶RhaRg5Rg3Rh2Rh3二醇类皂苷白 头 翁 皂 苷l 毛茛科白头翁属白头翁Pulsatilla chinensis Regel的干燥根l 性寒味苦，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫的功效l 主要有效成分为三萜皂苷及毛茛苷l 抗癌 抗黑色素瘤白头翁皂苷白头翁皂苷白头翁皂苷得率44%得率4.08%（三）黄酮类大 豆 异 黄 酮n 有12种异构体，分为游离型和结合型n 苷元占总量2-3%，糖苷占总量的97-98%染料木苷染料木素异 槲 皮 苷l 植物界分布较广，芦丁的衍生物l 具有抗氧化剂的特异性质 人体老化和疾病发生l 芦丁在自然界含量十分丰富，槐花中高达28%异槲皮苷含量极低，万分之一或十几万分之一l 利用酶法将芦丁水解转化为异槲皮苷的研究具有广阔的前景芦丁-鼠李糖苷酶Rha芦丁异槲皮苷新橙皮苷二氢异黄酮u 新橙皮苷是柑橘皮类含有的黄酮类化合物，苦味 新橙皮苷二氢查耳酮，甜度是蔗糖的1000倍，是高甜度、无热量、无毒、安全的甜味剂u缺点：溶解度低+（四）红景天苷n 抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等明显功能 具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效n 医药工业和食品工业最有发展前途n 红景天苷是合理开发利用红景天植物资源的重要指标n 最优条件：温度45，pH 5.0，反应时间6h，酪醇15g/L，葡萄糖60g/L 天然药物的植物细胞法生物转化一概述（一）植物细胞培养的基本概念 细胞:细胞是生命结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单元。组织培养:无菌条件下，利用植物离体器官（根、茎、叶、花、果实和种子等）、组织（如花药组织、胚乳和皮层等）或细胞（包括原生质体），在适宜的人工培养基上进行培养，在一定的培养条件诱导下，使其产生愈伤组织、芽或者发育形成小植株的一种实验技术。细胞培养:在离体培养条件下，将愈伤组织或其他易分散的的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到游离状态的悬浮细胞，然后通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体或产物的一种技术。（二）植物细胞培养方法 1.外植体的选择 2.愈伤组织诱导 3.细胞的选育与诱变 4.培养基 5.培养方法二植物细胞生物转化的主要反应类型（一）羟基化反应（二）糖基化反应（三）氧化还原反应（四）水解反应三植物细胞生物转化系统（一）悬浮细胞（二）固定化细胞转化系统（三）发根转化系统四植物细胞生物转化的调节（一）植物细胞的影响（二）外源底物的影响（三）培养条件的影响五天然药物的植物细胞生物转化（一）紫杉烷类化合物sinenxan Au 银杏悬浮细胞 C6羟基化；C9羟基化、甲酰化、选择性乙酰化；C10脱乙酰基、甲酰化；C14脱乙酰基u 桔梗悬浮细胞 C10脱乙酰基u 长春花悬浮细胞10-deacetylbacctin bacctin 2-debenzoyltaxol紫杉醇u 桉树悬浮细胞（二）鬼臼毒素类化合物coniferyl alcohol(+)-pinoresinol(-)-matairesinol4-demethyl yateinyatein6-methoxypodophyllotoxin-peltatindeoxypodophyllotoxinpodophyllotoxin4-demethpodophyllum lignans金亚麻悬浮细胞的生物转化6-methoxypodophyllotoxin7-hydroxy-matairesinol(-)-matairesinol-peltatindeoxypodophyllotoxinpodophyllotoxin-peltatin-methylether（三）强心苷类洋地黄毒苷的生物转化-methyldigitoxin-methyldigoxin蟾毒配基类的生物转化u 长春花悬浮细胞培养对华蟾毒精的生物转化 3-OH、16-OH糖苷化 5位羟基化、1位羟基化、3-OH脱氢反应 16位脱乙酰基反应u 桔梗悬浮培养体系对华蟾毒精的生物转化 5位羟基化、16位脱乙酰基反应华蟾毒精（四）雷公藤内酯雷公藤甲素triptonide雷公藤内酯三醇12,13-dihydroxytriptonide长春花悬浮细胞培养生物转化研究进展（一）新型生物催化剂的发现u 生物转化反应多限在水解、氧化、还原，扩大转化反应类型u 寻找热稳定性好、耐酸碱、耐高压的新型生物催化剂，拓宽应用范围 1997年欧盟启动“极端细胞工厂”的研究计划 中国将极端微生物列入2004年度“973”计划指南（二）生物催化剂的定向改造u 提高催化活性、耐酸碱性、热稳定性及稳定性，扩大底物选择性u 涉及两种方法 定向进化：对靶基因进行任意突变或重组 合理设计：基于对蛋白质结构、功能和机制的详细了解，定点突变引入改变（三）高通量筛选技术平台的建立u 瓶颈：“生物催化剂库”中筛选目的催化剂 “类天然活性化合物库”中筛选高效、低毒的化合物u 提高筛选效率、降低筛选成本（四）生物转化机理研究u 确定生物转化反应的关键酶及其基因序列（五）组合生物转化研究u 建立分子结构多样性的化合物库，为新药筛选提供资源（六）非水相中的生物转化u 天然活性化合物的溶解性u 改变酶的底物特异性u 非水相生物转化过程较容易放大