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生物化学BioChemistry杨力权 第一章第一章 蛋白质化学蛋白质化学本章重点：本章重点：蛋白质的立体结构（一、二、三、四级结构）蛋白质的立体结构（一、二、三、四级结构）蛋白质的结构和功能的关系蛋白质的结构和功能的关系第二部分第二部分 蛋白质的纯化和表征蛋白质的纯化和表征第三部分第三部分 蛋白质的立体结构蛋白质的立体结构第四部分第四部分 蛋白质的功能蛋白质的功能第三部分第三部分 蛋白质的立体结构蛋白质的立体结构一级结构指的是多肽链的氨基酸序列一级结构指的是多肽链的氨基酸序列二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规律的、局部的结构律的、局部的结构三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象折叠成具有特定走向的紧密球状构象四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚基间不同的排列方式会形成不同的构象。基间不同的排列方式会形成不同的构象。稳定蛋白质三维结构的作用力图示 盐键盐键 氢键氢键 疏水作用疏水作用 范德华力范德华力 二硫键二硫键螺旋（helix）1 1、右手螺旋，、右手螺旋，2、肽肽链链的的主主链链形形成成紧紧密密的的螺螺旋旋,侧侧链链伸向外侧伸向外侧3、每每圈圈螺螺旋旋占占3.6个个氨氨基基酸酸残残基基，沿沿螺螺旋旋轴轴方方向向上上升升0.54nm。每每个个残残基基绕绕轴轴旋旋转转100，沿沿轴轴上上升升0.15nm。残残基基的侧链伸向外侧，的侧链伸向外侧，4、螺螺旋旋通通过过氢氢键键维维持持稳稳定定，氢氢键键的的取向几乎与螺旋轴平行。取向几乎与螺旋轴平行。5、从从N末末端端出出发发，氢氢键键是是由由每每个个肽肽基基的的C=O与与其其前前面面第第3个个肽肽基基的的NH之间形成的。之间形成的。6、由由氢氢键键封封闭闭的的环环是是13元元环环，因因此此螺旋也称为螺旋也称为3.613螺旋。螺旋。折叠片（pleated sheet）可可以以把把折折叠叠片片想想象象为为由由折折叠叠的的条条状状纸纸片片侧侧向向并并排排而而成成。每每条条纸纸片片代代表表一一条条肽肽链链，肽肽链链沿沿纸纸条条成成锯锯齿齿状状，碳碳原原子子位位于于折折叠叠线线上上。侧侧链链基基团团都都垂垂直直于折叠片的平面，并交替地从平面上下二侧伸出。于折叠片的平面，并交替地从平面上下二侧伸出。氢氢键键在在股股间间形形成成。折折叠叠片片中中的的每每条条肽肽链链称称为为折折叠叠股或股或股（股（strand）。）。黑黑 C 红红 O 蓝蓝 N 白白 H 黄黄 R 基基-折叠有两种类型折叠有两种类型:平行平行-折叠折叠明显折叠更规则，明显折叠更规则，疏水侧链分两侧。疏水侧链分两侧。大结构、球状蛋白大结构、球状蛋白反平行反平行-折叠折叠转角（turn）转转角角可可以以使使肽肽链链倒倒转转。在在转转角角中中，第第一一个个残残基的基的C=O与第四个残基与第四个残基NH形成氢键。形成氢键。由由于于甘甘氨氨酸酸缺缺少少侧侧链链，在在转转角角中中能能很很好好地地调调整整其其它它残残基基的的空空间间障障碍碍，因因此此甘甘氨氨酸酸是是形形成成转转角角最最合合适适的的氨氨基基酸酸。脯脯氨氨酸酸具具有有固固定定的的角角，在在一一定定程度上迫使程度上迫使转角形成。转角形成。目前发现的目前发现的转角多数处于蛋白质分子的表面。转角多数处于蛋白质分子的表面。凸起（bulge）Classic bulge G-1 bulge wide bulge 凸起可以认为是凸起可以认为是折叠股中多了一个氨基酸折叠股中多了一个氨基酸残基，它的凸起使得肽链的走向发生弯曲。残基，它的凸起使得肽链的走向发生弯曲。无规卷曲（random coil)无无规规卷卷曲曲泛泛指指那那些些没没有有明明确确的的、有有规规律律的的二二级级结结构构的的肽肽链链区区段段。但但对对于于一一个个特特定定的的蛋蛋白白质质分分子子来来说说，无无规规卷卷曲曲也也是是有有一一定定的的卷卷曲结构的。曲结构的。五、纤维状蛋白质 纤纤维维状状蛋蛋白白质质可可分分为为不不溶溶性性和和可可溶溶性性两两类类，不不溶溶性性的的有有角角蛋蛋白白、胶胶原原蛋蛋白白和和弹弹性性蛋蛋白白等等，其其中中角角蛋蛋白白又又分分为为角角蛋蛋白白和和角角蛋蛋白白；可可溶溶性性的的有肌球蛋白和血纤维蛋白原等。有肌球蛋白和血纤维蛋白原等。角蛋白（keratin）角角蛋蛋白白是是毛毛发发中中的的主主要要蛋蛋白白，角角蛋蛋白白亚亚基基由由富富含含螺螺旋旋的的中中央央棒棒状状区区（长长度度为为311314个个氨氨基基酸酸残残基基）及及两两端端的的非非螺螺旋旋区区组组成成。三三个个这这样样的的亚亚基基结结合合成成左左手手螺螺旋旋的的初初原原纤纤维维，直直径径2nm；11根根初初原原纤纤维维以以92的的形形式式结结合合成成微微原原纤纤维维，直直径径8nm；成成百百根根微微原原纤纤维维再再结结合合成成不不规规则则的的纤纤维维束束，称称为为大大原原纤纤维维，直直径径200nm。很很多多大大原原纤纤维维存存在在于于没没有有生生命命的的细细胞胞当当中中，这这些些细细胞胞组组成成毛毛发发的的核核心心，毛毛发发的的外外层层是是皮皮层层细细胞胞和和鳞鳞状细胞。状细胞。-角蛋白及毛发的结构N-terminal Rod C-terminal domain domain domain左手超螺旋右手螺旋原纤丝初原纤维毛发的结构直径直径2 2nm直径直径8 8nm直径直径200200nm毛发的结构角蛋白的若干性质 角角蛋蛋白白的的伸伸缩缩性性很很强强，一一根根毛毛发发纤纤维维在在湿湿热热时时可可以以拉拉长长到到原原有有长长度度的的2倍倍，这这时时螺螺旋旋被被撑撑开开，各各圈圈的的氢氢键被破坏，转变成键被破坏，转变成构象。构象。螺螺旋旋之之间间有有许许多多二二硫硫键键连连接接，一一般般认认为为每每4个个螺螺圈圈就有一个二硫键。二硫键的数目越多，纤维的刚性越强。就有一个二硫键。二硫键的数目越多，纤维的刚性越强。根根据据含含硫硫量量的的大大小小，角角蛋蛋白白可可以以分分成成硬硬角角蛋蛋白白和和软软角角蛋蛋白白两两种种类类型型。蹄蹄、爪爪、角角、甲甲中中的的角角蛋蛋白白是是高高硫硫硬硬角角蛋白，皮肤和胼胝中的角蛋白是低硫软角蛋白。蛋白，皮肤和胼胝中的角蛋白是低硫软角蛋白。丝丝心心蛋蛋白白是是反反平平行行的的折折叠叠片片堆堆积积成成的的多多层层结结构构，链链间间主主要要以以氢氢键键连连接接，层层间间主主要要以以范范德德华华力力结结合合。丝丝心心蛋蛋白白的的一一级级结结构构分分析析表表明明，它它主主要要是是由由具具有有小小侧侧链链基基团团的的甘甘氨氨酸酸、丝丝氨氨酸酸和和丙丙氨氨酸酸组组成成，在在一一级级结结构构上上每每隔隔1个个残残基基就就是是甘甘氨氨酸酸残残基基，所所以以所所有有的的甘甘氨氨酸酸都都位位于于折折叠叠片片平平面面的的一一侧侧，丝丝氨氨酸酸和和丙丙氨氨酸酸的的侧链基团位于折叠片平面的另一侧。侧链基团位于折叠片平面的另一侧。丝心蛋白丝心蛋白的结构 丝丝心心蛋蛋白白是是蚕蚕丝丝和和蜘蜘蛛蛛丝丝中中的的一一种种蛋蛋白白质质，属属于于角角蛋蛋白白。丝丝心心蛋蛋白白抗抗张张强强度度高高，质质地地柔柔软软。但但不能拉伸。不能拉伸。堆积的折叠片的三维结构丝心蛋白层间距离示意图蜘蛛排丝胶原蛋白 胶胶原原蛋蛋白白(胶胶原原)是是很很多多脊脊椎椎动动物物体体内内含含量量最最丰丰富富的的蛋白质，它是一种结构蛋白。蛋白质，它是一种结构蛋白。胶原蛋白是糖蛋白，包括多种类型。胶原蛋白是糖蛋白，包括多种类型。在在体体内内胶胶原原蛋蛋白白以以胶胶原原原原纤纤维维的的形形式式存存在在，胶胶原原原原纤纤维维的的基基本本结结构构单单位位是是原原胶胶原原，原原胶胶原原分分子子是是由由三三股股多多肽肽链链缠缠绕绕成成具具有有四四级级结结构构的的右右手手超超螺螺旋旋缆缆，称称为为三三股股螺螺旋。旋。每股螺旋本身是一种左手螺旋。每股螺旋本身是一种左手螺旋。胶胶原原三三螺螺旋旋只只存存在在于于胶胶原原纤纤维维中中。至至今今没没有有在在球球状状蛋白质中发现。具有很高的抗张强度。蛋白质中发现。具有很高的抗张强度。胶原纤维的结构胶原纤维胶原纤维 原胶原分子原胶原分子六、超二级结构和结构域v若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多、有规则、稳定的二级结构组合用，形成种类不多、有规则、稳定的二级结构组合或二级结构串，称为超二级结构。或二级结构串，称为超二级结构。v在球状蛋白质中特别常见。在球状蛋白质中特别常见。v（super-secondary structure,folding motif,folding unit）超二级结构Rossman折叠折叠 发夹发夹曲折曲折希腊钥匙结构希腊钥匙结构亲水面朝亲水面朝向观察者向观察者超螺旋结构中两股螺旋链的非极性边缘的疏水作用 在在超超螺螺旋旋中中，每每7 7个个氨氨基基酸酸残残基基形形成成一一个个周周期期，其其中中第第1个个和和第第4个个残残基基的的侧侧链链是是疏疏水水基基团团，两两个这样的个这样的螺旋靠疏水作用结合。螺旋靠疏水作用结合。单元中的右手交叉发夹连接发夹连接右手交叉连接右手交叉连接左手交叉连接左手交叉连接右手扭曲的天然倾向及由此形成右手扭曲的天然倾向及由此形成的的右手交叉连接右手交叉连接结构域 结结构构域域（domain）是是多多肽肽链链在在二二级级结结构构或或超超二二级级结结构构的的基基础础上上形形成成三三级级结结构构的的局局部部折折叠叠区区，它它是是相对独立的紧密球状实体。相对独立的紧密球状实体。结结构构域域是是球球状状蛋蛋白白质质的的独独立立折折叠叠单单位位。有有些些单单体体蛋蛋白白质质或或寡寡聚聚蛋蛋白白质质的的亚亚基基只只有有一一个个结结构构域域，有有些些具具有有两两个个以以上上的的结结构构域域，结结构构域域之之间间由由相相对对柔柔性性的肽链连接。的肽链连接。结构域的分类 结结构构域域大大体体可可分分为为 4 类类：反反平平行行螺螺旋旋结结构构域域（全全结结构构），平平行行或或混混合合型型折折叠叠片片结结构构域域（，结结构构），反反平平行行折折叠叠片片结结构构域域（全全结结构构），富富含含金金属属或或二二硫硫键键结结构构域域（不不规规则则小小蛋蛋白白结结构构）。酶酶的的活活性性中中心心往往往往处处于于两两个个结结构构域域之之间。间。己糖激酶的两个结构域Active sitecleftHexokinase molecule免疫球蛋白的多结构域（共有（共有4 4个亚基）个亚基）七、球状蛋白质与三级结构球状蛋白质球状蛋白质全全-结结构（反平行螺旋）构（反平行螺旋），-结结构（平行或构（平行或混合型混合型-折叠）折叠）全全 折叠（反平行折叠（反平行 折叠片）折叠片）富含金属或二硫键富含金属或二硫键（小的不规则）（小的不规则）球状蛋白的分类球状蛋白的分类球状蛋白质的分类全结构（反平行螺旋束）TMV外壳蛋白外壳蛋白结构，以结构，以螺旋为主，螺旋为主，螺旋一顺一反地排列。螺旋一顺一反地排列。蚯蚓血红蛋白蚯蚓血红蛋白球状蛋白质的分类平行折叠片结构域（平行桶）磷酸丙糖异构酶（侧面）磷酸丙糖异构酶（侧面）丙酮酸激酶（侧面）丙酮酸激酶（侧面）磷酸丙糖异构酶（顶面）磷酸丙糖异构酶（顶面）平平行行桶桶：结结构构，呈呈右右手手交交叉叉，平平行行折折叠叠片片在在内内形形成成一一个个桶桶状状，外外侧侧是是螺螺旋旋。也也叫叫单单绕绕平平行行桶桶。高高度度对称性。对称性。结结构构，呈呈右右手手交交叉叉，肽肽链链从从折折叠叠片片中中开开始始向向一一个个方方向向卷卷绕绕成成Rossman折折叠叠，螺螺旋旋覆覆盖盖在在折折叠叠片片的的一一侧侧，然然后后改改变变方方向向回回到到折折叠叠片片的的中中部部向向相相反反的的方方向向卷卷绕绕再再形形成成Rossman折折叠叠，此此时时螺螺旋旋覆覆盖盖在在折折叠叠片片的的另另一一侧侧。所所以以也也叫叫双双绕绕平平行行折折叠叠片片。有有时时有有发发夹夹连连接接的的反反平平行行折折叠叠股股混混杂杂在在平平行行折叠股之间，形成混合型折叠股之间，形成混合型折叠片蛋白质。折叠片蛋白质。球状蛋白质的分类平行折叠片结构域（马鞍形扭曲片）球状蛋白质的分类平行折叠片结构域（马鞍形扭曲片）乳酸脱氢酶结构域乳酸脱氢酶结构域1（侧面）（侧面）磷酸甘油激酶结构域磷酸甘油激酶结构域2乳酸脱氢酶结构域乳酸脱氢酶结构域1（顶面）（顶面）球状蛋白质的分类反平行折叠片结构域CuZn超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 免疫球蛋白免疫球蛋白 VL 结构域结构域 两层两层折叠片结构，折叠片结构，疏水面相对，疏水面相对，亲水面朝外。亲水面朝外。反平行桶 反反平平行行桶桶也也叫叫上上下下型型桶桶，属属于于结结构构，以以折折叠叠片片为为主主，反反平平行行折折叠叠片片一一面面是是亲亲水水基基团团，另一侧是疏水基团。另一侧是疏水基团。球状蛋白质的分类反平行折叠片结构域（露面夹心结构）链霉菌枯草蛋白酶抑制剂链霉菌枯草蛋白酶抑制剂 谷胱甘肽还原酶结构域谷胱甘肽还原酶结构域3 只只有有一一片片反反平平行行折折叠叠片片，亲亲水水一一侧侧朝朝外外，疏疏水水一一侧侧有有螺螺旋旋和和回回环环（属属无无规规卷曲）覆盖。卷曲）覆盖。球状蛋白质的分类富含二硫键蛋白质胰岛素胰岛素 二节荠蛋白二节荠蛋白球状蛋白质的分类富含金属蛋白质高氧还势铁蛋白高氧还势铁蛋白 铁氧还蛋白铁氧还蛋白球状蛋白质的特征1 1球状蛋白质含有多种二级结构元件。球状蛋白质含有多种二级结构元件。2 2球球状状蛋蛋白白质质具具有有明明显显的的折折叠叠层层次次。先先折折叠叠出出二二级级结结构构，然然后后形形成成超超二二级级结结构构，再再装装配配成成相相对对独独立立的的球球状状实实体体结结构构域域或或三三级级结结构构。如如果果是是寡寡聚聚蛋蛋白白质质，则再缔合成四级结构。则再缔合成四级结构。3 3疏水部分在内，亲水部分在外。疏水部分在内，亲水部分在外。4 4折折叠叠紧紧密密。以以一一个个蛋蛋白白质质的的组组成成氨氨基基酸酸的的范范德德华华体体积积总总和和除除以以蛋蛋白白质质所所占占的的总总体体积积，即即得得到到装装配配密密度度，装配密度一般为装配密度一般为0.720.720.770.77。5 5分子表面有一个空穴或裂沟，是与配体结合的部位。分子表面有一个空穴或裂沟，是与配体结合的部位。鸡卵清溶菌酶的三级结构（示各种二级结构元件）（示各种二级结构元件）折叠折叠转角转角螺旋螺旋无规卷曲无规卷曲 蛋白质的四级结构指的是具有三级结构蛋白质的四级结构指的是具有三级结构的多肽链按一定的空间排列方式通过非共价的多肽链按一定的空间排列方式通过非共价键缔合形成的蛋白质大分子。键缔合形成的蛋白质大分子。很多蛋白质是以三级结构的球状蛋白质很多蛋白质是以三级结构的球状蛋白质的聚集体（的聚集体（aggregate）形式存在的。这些）形式存在的。这些球状蛋白质通过非共价键彼此缔合在一起。球状蛋白质通过非共价键彼此缔合在一起。这样的聚集体称为蛋白质的四级结构。这样的聚集体称为蛋白质的四级结构。四级结构的蛋白质（四级结构的蛋白质（quaternary protein）中每个球状蛋白质称为亚基或亚单）中每个球状蛋白质称为亚基或亚单位（位（subunit）。）。八、蛋白质的四级结构(亚基缔合与四级结构)血红蛋白的立体结构(四级结构)11221122v也也可可以以这这样样说说，蛋蛋白白质质的的四四级级结结构构就就是是指指蛋蛋白白质质分分子子中中亚亚基基的的立立体体排排布布，亚亚基基间间的的相相互互作用与接触部位的布局。作用与接触部位的布局。v亚亚基基(subunit)就就是是指指参参与与构构成成蛋蛋白白质质四四级级结结构的、每条具有三级结构的多肽链。构的、每条具有三级结构的多肽链。若若干干个个亚亚基基通通过过非非共共价价键键聚聚集集成成一一个个多多亚亚基基蛋白质，这种蛋白质叫蛋白质，这种蛋白质叫寡聚蛋白质或多聚蛋白质，寡聚蛋白质或多聚蛋白质，由由两两个个亚亚基基组组成成的的蛋蛋白白质质称称为为二二聚聚体体蛋蛋白白质质，由四个亚基组成的蛋白质称为四聚体蛋白质。由四个亚基组成的蛋白质称为四聚体蛋白质。有有些些多多聚聚蛋蛋白白质质只只由由一一种种亚亚基基组组成成，称称为为同同多多聚聚蛋蛋白白质质；有有些些由由两两种种以以上上的的亚亚基基组组成成，称称为为杂多聚蛋白质杂多聚蛋白质。单体和原体 亚亚基基有有时时也也称称为为单单体体（monomer），对对于于杂杂多多聚聚蛋蛋白白质质来来说说，不不同同种种类类的的一一套套亚亚基基组组成成一一个个不不对对称称结结构构，称称为为原原体体（protomer），若若干干个个原原体体再再组组成成对对称称的的多多聚聚蛋蛋白白质质。对对于于同同多多聚聚蛋蛋白白质质来来说说，一一个个单单体体也也就就是是一一个个原原体体。比比如如血血红红蛋蛋白白，由由4个个亚亚基基组组成成，两两个个亚亚基基，两两个个亚亚基基。其其中中就就是是一一个个原原体体，一一共两个原体。共两个原体。四级缔合的驱动力 主主要要是是疏疏水水作作用用使使亚亚基基缔缔合合在在一一起起，还还有有极极性性基基团团之之间间的的作作用用。极极性性基基团团之之间间的的作作用用决决定定亚亚基基间间缔缔合合的的专专一一性性。虽虽说说亚亚基基间间的的缔缔合合是是非非共共价价键键，但但也也有有很很多多亚亚基基间间有有共共价价键键交交联联的的情情况况，主主要要是是亚亚基基间间形形成成二二硫硫键键，形形成成二二硫硫键键可可以以增增加加亚亚基基间间的的稳稳定定性。性。四级结构的对称性 由由于于多多肽肽链链的的所所有有碳碳是是不不对对称称的的，并并且且多多肽肽链链几几乎乎总总是是折折叠叠成成不不对对称称或或低低对对称称的的结结构构，因因此此单单体体蛋蛋白白质质和和亚亚基基都都是是手手性性分分子子，而而大大多多数数寡寡聚聚蛋蛋白白质质的的亚亚基基排排列列是是对对称称的的。对对称称性性是是四四级级结结构蛋白质最重要的性质之一。构蛋白质最重要的性质之一。三级结构四级结构四级缔合在结构和功能上的优越性 增增强强稳稳定定性性：比比表表面面积积减减小小，减减少少了了与与水水的的相相互作用。互作用。提提高高遗遗传传经经济济性性和和效效率率：用用较较少少的的遗遗传传物物质质产产生较多的蛋白质。生较多的蛋白质。使使催催化化基基团团汇汇集集在在一一起起：有有些些酶酶的的催催化化基基团团位位于于不不同同的的亚亚基基上上，形形成成寡寡聚聚体体后后，这这些些基基团团汇汇集到一起，形成活性中心。集到一起，形成活性中心。具有协同性和别构效应。具有协同性和别构效应。第四部分 蛋白质的功能一、肌红蛋白的结构与功能二、血红蛋白的结构与功能三、蛋白质一二三四级结构与功 能的关系肌红蛋白 肌红蛋白是肌红蛋白是19571957年用年用X X射线晶体分析法测定射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。它是典型的球的有三维结构的第一个蛋白质。它是典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌肌红红蛋蛋白白（myoglobin，Mb）主主要要存存在在于于肌肌肉肉中中，是是哺哺乳乳动动物物细细胞胞主主要要是是肌肌细细胞胞贮贮存存和和分配氧的蛋白质。分配氧的蛋白质。一、肌红蛋白的结构与功能 肌红蛋白由一条多肽链肌红蛋白由一条多肽链(8条条-螺旋螺旋)和一个辅和一个辅基血红素（基血红素（heme）构成，由多肽的折叠形成的疏水）构成，由多肽的折叠形成的疏水空隙内是血红素辅基，空隙内是血红素辅基，相对分子量相对分子量16700，含，含153个个氨基酸残基。氨基酸残基。除去血红素后仅剩下的肽链部分称为珠蛋白除去血红素后仅剩下的肽链部分称为珠蛋白（globin），），它和血红蛋白的它和血红蛋白的、亚基有明显的同亚基有明显的同源性，它们的构象和功能也极为相似。血红素非共源性，它们的构象和功能也极为相似。血红素非共价地结合在珠蛋白的疏水空穴中。价地结合在珠蛋白的疏水空穴中。肌红蛋白的结构myoglobin肌红蛋白的结构myoglobin肌红蛋白的结构myoglobin 血红素由原卟啉血红素由原卟啉中间结合一个中间结合一个Fe原子构成，（原子构成，（4个吡咯个吡咯环连接而成的络合物）。卟啉环中央结合环连接而成的络合物）。卟啉环中央结合Fe原子，原子，Fe原子有原子有6个配位键，其中个配位键，其中4个配位键与个配位键与4个吡咯环的个吡咯环的N原子相连，另两个原子相连，另两个配位键分布在卟啉环的上下。配位键分布在卟啉环的上下。辅基血红素氧合肌红蛋白中血红素铁离子的6个配体近侧近侧His远侧远侧HisO2与肌红蛋白的结合与肌红蛋白的结合 Fe的第六配位键在没有的第六配位键在没有O2时，是空着的，时，是空着的，O2与肌红蛋白中的与肌红蛋白中的Fe 结合，结合，结合以后与结合以后与Fe-O键形成键形成60度的夹角，同时夹在远侧组氨酸的中度的夹角，同时夹在远侧组氨酸的中间。间。肌红蛋白的结构特点及其结构变化的作用：肌红蛋白的结构特点及其结构变化的作用：1.固定血红素；固定血红素；2.保护血红素保护血红素Fe不被氧化；不被氧化；3.为分子氧提供一个合适的结合部位。为分子氧提供一个合适的结合部位。O2与血红素与血红素Fe结合后，会改变肌红蛋白的结合后，会改变肌红蛋白的构象。没有结合氧时，铁卟啉处于凸出位构象。没有结合氧时，铁卟啉处于凸出位置，并且置，并且Fe是圆顶状，结合氧后铁卟啉收是圆顶状，结合氧后铁卟啉收回形成平面状。回形成平面状。肌红蛋白的贮氧和输氧作用 肌肌红红蛋蛋白白也也有有利利于于细细胞胞内内氧氧从从细细胞胞的的内内表表面面向向线线粒粒体体转转运运，因因为为这这种种运运转转是是顺顺浓浓度度梯梯度度的的，细细胞胞内内表表面面的的氧氧浓浓度度约约为为10 torr（肌肌红红蛋蛋白白的的氧氧饱饱和和度度约约为为80%），而而线线粒粒体体内内的的氧氧浓浓度度约约为为1 torr（肌肌红红蛋蛋白白的的氧氧饱饱和和度度约约为为25%），肌肌红红蛋蛋白白可可以以从从细细胞胞内表面结合氧，而运到线粒体内表面结合氧，而运到线粒体中释放氧。中释放氧。二、血红蛋白的结构与功能血红蛋白的三维结构11221122血红蛋白的氨基酸组成 链链或或样样链链由由141个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，链链或或样样链链由由146个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，而而肌肌红红蛋蛋白白的的肽肽链链由由153个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，它它们们都都叫叫珠珠蛋蛋白白。同同一一类类型型不不同同希希腊腊字字母母代代表表的的链链有有个个别别氨基酸残基不同。氨基酸残基不同。肌红蛋白的结构myoglobin肌红蛋白的结构myoglobinHb的链、链和Mb链构象的相似性 血血红红蛋蛋白白链链、链链及及肌肌红红蛋蛋白白链链的的三三级级结结构构非非常常相相似似，但但这这三三种种肽肽链链的的氨氨基基酸酸序序列列有有很很大大不不同同，141个个氨氨基基酸酸残残基基位位置置中中只只有有27个个位位置置的的残残基在这三种肽链中是相同的。基在这三种肽链中是相同的。Mb Hb Hb血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)(hemoglobin)的四级结构的四级结构血红蛋白的别构效应 血红蛋白是一个四聚体蛋白，它与肌红蛋白血红蛋白是一个四聚体蛋白，它与肌红蛋白相比，出现了一些新的性质。相比，出现了一些新的性质。血红蛋白的氧合具血红蛋白的氧合具有正协同同促效应，即一个有正协同同促效应，即一个O2的结合促进同一分的结合促进同一分子其它亚基与子其它亚基与O2的结合。的结合。具有这种性质的蛋白质具有这种性质的蛋白质称为别构蛋白（其它蛋白质也有负协同效应的）。称为别构蛋白（其它蛋白质也有负协同效应的）。一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称为别影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称为别构效应，构效应，具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白。具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白。三、蛋白质一二三四级结构与功 能的关系蛋白质的一二三四级结构v蛋白质的一级结构决定高级结构，立体构型蛋白质的一级结构决定高级结构，立体构型的变化影响功能。的变化影响功能。v在在镰镰刀刀状状红红细细胞胞贫贫血血患患者者中中，由由于于基基因因突突变变导导致致血血红红蛋蛋白白-链链第第六六位位氨氨基基酸酸残残基基由由谷谷氨氨酸酸改改变变为为缬缬氨氨酸酸，血血红红蛋蛋白白的的亲亲水水性性明明显显下下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。镰刀状红细胞贫血病镰刀状红细胞贫血病镰刀状红细胞贫血镰刀状红细胞贫血HbHb -链一级结构的改变链一级结构的改变N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 链链HbA 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)6正常红细胞与镰刀状红细胞贫血病人的红细胞比较九、蛋白质折叠一、蛋白质的变性二、蛋白质折叠蛋白质的变性 蛋蛋白白质质变变性性的的实实质质是是分分子子中中的的次次级级键键被被破破坏坏，引起天然构象发生重大变化，但一级结构保持不变。引起天然构象发生重大变化，但一级结构保持不变。一、蛋白质的变性 蛋白质的变性是指蛋白质空间结构发生蛋白质的变性是指蛋白质空间结构发生改变，活性丧失的现象。改变，活性丧失的现象。变性不是降解（分解）变性不是降解（分解）蛋白质变性过程中，往往发生下列现象：蛋白质变性过程中，往往发生下列现象：1 1生物活性丧失：催化活性、运输功能、运动功生物活性丧失：催化活性、运输功能、运动功 能、与其它物质结合的功能等丧失。能、与其它物质结合的功能等丧失。2 2一些侧链基团暴露：结构变得松散。一些侧链基团暴露：结构变得松散。3 3一些物理化学性质改变：聚集、沉淀、粘度增一些物理化学性质改变：聚集、沉淀、粘度增 加、旋光及紫外吸收改变。加、旋光及紫外吸收改变。4 4生物化学性质改变：易受蛋白酶水解。生物化学性质改变：易受蛋白酶水解。蛋白质的变性 变变性性剂剂（denaturing agent）尿尿素素和和盐盐酸酸胍胍能能与与主主链链竞竞争争形形成成氢氢键键，破破坏坏蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构。还还能能增增加加疏水基团在水中的溶解度，破坏蛋白质的三级结构。疏水基团在水中的溶解度，破坏蛋白质的三级结构。SDS（十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠）也也是是蛋蛋白白质质的的变变性性剂剂，它也是破坏蛋白质分子内的疏水作用。它也是破坏蛋白质分子内的疏水作用。有有些些蛋蛋白白质质变变性性是是可可逆逆的的，当当变变性性因因素素消消除除后后，肽肽链链可可自自动动折折叠叠到到天天然然构构象象，恢恢复复功功能能。但但也也有有一一些些蛋蛋 白白 质质 难难 以以 恢恢 复复 天天 然然 构构 象象，可可 能能 是是 复复 性性（renaturation）所需的条件不具备所致。）所需的条件不具备所致。核糖核酸酶的变性与复性 结论：结论：蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。蛋白质的折叠 肽链在折叠成蛋白质天然构象的过程中能量降低。肽链在折叠成蛋白质天然构象的过程中能量降低。体体 内内 蛋蛋 白白 质质 折折 叠叠 有有 酶酶 和和 分分 子子 伴伴 侣侣（molecular chaperone）协协助助。协协助助蛋蛋白白质质折折叠叠的的酶酶有有蛋蛋白白质质二二硫硫键键异异构构酶酶，肽肽基基脯脯氨氨酰酰异异构构酶酶；分分子子伴伴侣侣起起初初是是作作为为热热休休克克蛋蛋白白（heat shock protein）而而发发现现的的,它它们们协协助助蛋蛋白白质质折折叠叠的的机机理理还不清楚。还不清楚。二、蛋白质折叠复习题1、简述蛋白质二级结构-螺旋、-折叠的结构特点。2、简述蛋白质一、二、三、四级结构的定义及内涵，维系各级结构的作用力，并谈谈你对蛋白质四个结构的认识。3、什么是蛋白质的变性，变性后蛋白质发生了那些变化，蛋白质的变性实验证明了什么？vThank you第二部分第二部分 蛋白质的纯化和表征蛋白质的纯化和表征一、蛋白质的性质一、蛋白质的性质1、蛋白质的相对分子量、蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10 0001 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。s=v2x v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）v2 2、蛋白质的酸碱性质、蛋白质的酸碱性质v蛋白质分子由氨基酸组成，因此也和氨蛋白质分子由氨基酸组成，因此也和氨基酸一样，具有酸碱性质。是一类两性基酸一样，具有酸碱性质。是一类两性电解质。也有其等电点。在等电点是时电解质。也有其等电点。在等电点是时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。v 和多肽一样，在不同的和多肽一样，在不同的PHPH值的条件值的条件下，蛋白质的电学性质也不同。利用蛋下，蛋白质的电学性质也不同。利用蛋白质在不同白质在不同PHPH的溶液中电荷性不同而进的溶液中电荷性不同而进行的电泳可对蛋白质进行分离纯化。行的电泳可对蛋白质进行分离纯化。3 3、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一种分散系统（蛋白质溶液是一种分散系统（disperse disperse systemsystem）。属于胶体系统。根据分散程度可）。属于胶体系统。根据分散程度可以把分散系统分为三类：分散相质点小于以把分散系统分为三类：分散相质点小于1nm1nm的为真溶液，大于的为真溶液，大于100nm100nm的为悬浊液，的为悬浊液，介于介于1-100nm1-100nm的为胶体溶液。蛋白质具有胶的为胶体溶液。蛋白质具有胶体溶液的典型性质，也可以用透析的方法将体溶液的典型性质，也可以用透析的方法将非蛋白质的小分子物质除去。（胶体溶液中非蛋白质的小分子物质除去。（胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜）的蛋白质不能通过半透膜）4 4、蛋白质的沉淀、蛋白质的沉淀 蛋白质的胶体溶液是比较稳定的，其稳定的蛋白质的胶体溶液是比较稳定的，其稳定的因素有两个：因素有两个：1 1、蛋白质质点能与水形成水化、蛋白质质点能与水形成水化层（水膜），致使质点不易靠拢而聚集层（水膜），致使质点不易靠拢而聚集2 2、蛋、蛋白质质点带相同的电荷，互相排斥，不易靠白质质点带相同的电荷，互相排斥，不易靠拢而聚集。可以设想，只要破坏以上两个稳拢而聚集。可以设想，只要破坏以上两个稳定的因素，就可以将蛋白质从胶体溶液中沉定的因素，就可以将蛋白质从胶体溶液中沉淀出来。蛋白质的沉淀作用可分为可逆沉淀淀出来。蛋白质的沉淀作用可分为可逆沉淀和不可逆沉淀。和不可逆沉淀。盐析：盐析：v在在蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入大大量量中中性性盐盐，以以破破坏坏蛋蛋白白质质的的胶胶体体性性质质，使使蛋蛋白白质质从从溶溶液液中中 沉沉 淀淀 析析 出出，称称 为为 盐盐 析析（salt precipitation）。（1）高浓度中性盐）高浓度中性盐v常用的中性盐有：常用的中性盐有：硫酸铵硫酸铵、氯化钠、硫、氯化钠、硫酸钠等。酸钠等。v盐析时，溶液的盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处在蛋白质的等电点处效果最好。效果最好。v盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。质的变性。v分段盐析：分段盐析：不同蛋白质由于所带的电荷和 水化程度不同，盐析所需要的盐的浓度也不同，因此可通过调节盐的浓度将不同的蛋白质将以分离。盐溶低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶（度，这种现象称为盐溶（salting insalting in）。盐）。盐溶溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。因而溶解度提高。（2）有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：v凡凡能能与与水水以以任任意意比比例例混混合合的的有有机机溶溶剂剂，如如乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮等等，均均可可用用于于沉沉淀淀蛋白质。蛋白质。v沉沉淀淀原原理理是是：脱脱水水作作用用；使使水水的的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。介电常数降低，蛋白质溶解度降低。（3 3）重金属盐）重金属盐（4 4）生物碱试剂）生物碱试剂5 5、蛋白质的变性（、蛋白质的变性（denaturationdenaturation）天然蛋白质分子受到某些物理因素如热、紫天然蛋白质分子受到某些物理因素如热、紫外线照射，高压和表面张力等或化学因素如外线照射，高压和表面张力等或化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的影响时，生有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变，这种过程及其他的物理化学常数发生改变，这种过程称为变性作用。变形其一级结构保持不变，称为变性作用。变形其一级结构保持不变，空间结构遭到破坏，变性因素可以破坏维持空间结构遭到破坏，变性因素可以破坏维持蛋白质空间构象的非共价键。蛋白质空间构象的非共价键。v引起蛋白质变性的因素有：引起蛋白质变性的因素有：物物理理因因素素：高高温温、高高压压、紫紫外外线线、电电离离辐射、超声波等；辐射、超声波等；化化学学因因素素：强强酸酸、强强碱碱、有有机机溶溶剂剂、重重金属盐等。金属盐等。v变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变：物物理理性性质质：旋旋光光性性改改变变，溶溶解解度度下下降降，沉沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；化学性质化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。酶水解。生物学性质生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原：原有生物学活性丧失，抗原性改变。性改变。v蛋白质变性的可逆性：蛋白质变性的可逆性：a)蛋蛋白白质质在在体体外外变变性性后后，绝绝大大多多数数情情况况下下是不能复性的；是不能复性的；b)如如变变性性程程度度浅浅，蛋蛋白白质质分分子子的的构构象象未未被被严严重重破破坏坏；或或者者蛋蛋白白质质具具有有特特殊殊的的分分子子结构，并经特殊处理则结构，并经特殊处理则可以复性。可以复性。核糖核酸酶的变性与复性核糖核酸酶的变性与复性去除变性剂去除变性剂并缓慢氧化并缓慢氧化天然构象天然构象尿素，尿素，-巯基乙醇巯基乙醇变性状态变性状态二、蛋白质的分离提纯1 1、根据分子大小不同的分离方法、根据分子大小不同的分离方法v1 1）透析和超过滤）透析和超过滤v 透析（透析（dialysisdialysis）就是利用蛋白质分子不能通）就是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。机盐、单糖、水等分开。v2 2）密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心v 蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。且也取决于它的密度。v3 3）凝胶过滤凝胶过滤 即凝胶过滤层析（即凝胶过滤层析（gel filtration gel fil