化学蛋白质组学在天然产物分子靶标鉴定中的应用.pdf
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1、生物技术通报综述与专论BIOTECHNOLOGYBULLETIN2023,39(9):12-26化学蛋白质组学在天然产物分子靶标鉴定中的应用Targets of Natural Products周璐祺崔婷茹?郝楠赵雨薇赵斌刘颖超(1.河北农业大学植物保护学院河北省植物生理与分子病理学重点实验室,保定0 7 10 0 0;2.保定市气象局,保定0 7 10 0 0)摘要:绿色新农药的开发和利用有利于农业的可持续发展,基于天然产物进行活性先导发现及作用机制研究是重要的新农药创制策略,然而其作用靶标和作用机制难以确定,阻碍了其在新农药中的应用。因此发现化合物新靶点对于新农药创制来说是一项既重要又艰巨
2、的任务。化学蛋白质组学作为后基因组时代的新技术,目前已经成为研究药物靶点的重要手段之一。本文对基于化学蛋白组学的化合物作用分子靶点发现方法和典型案例进行探析,介绍这些技术的主要原理、应用以及各自的优点和局限性,旨在阐述基于化学蛋白质组学发现药物作用靶标的最新方法,并为天然产物靶点及新农药创制研究提供参考。关键词:化学蛋白组学;药物靶点鉴定;化学标记法;非化学标记法;天然产物D0I:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0188Application of Chemical Proteomics in Identifying the MolecularZHOU L
3、u-qi CUI Ting-ru?HAO Nan ZHAO Yu-wei ZHAO Bin LIU Ying-chao1(1.Hebei Agricultural University,College of Plant Protection,Hebei Key Laboratory of Plant Physiology and Molecular Pathology,Baoding071000;2.Baoding Meteorological Bureau,Baoding 071000)Abstract:The development and utilization of new green
4、 pesticides are conducive to the sustainable development of agriculture.Studyingactiveleading discovery and action mechanisms based on natural products is essential for creating new pesticides.However,its target and actionmechanism are difficult to determine,which hinders its development in new drug
5、 research and development.Therefore,discovering compoundnew targets is an important and arduous task for creating new pesticides.As a new technology in the post-genomic era,chemical proteomicshas become one of the essential means of drug targeting.This paper reviewed the discovery methods and typica
6、l cases of molecular targets ofchemical compounds based on proteomics and introduced main principles applications,advantages and limitations of these technologies,aimingto provide references for the research of natural product targets and new pesticide creation by explaining the progress of the late
7、st methods ofdiscovering drug action targets based on chemical proteomics.Key words:chemical proteomics;target identification;chemical probe;non-chemical probe;natural products粮食安全是关系到国民经济可持续发展和社会稳定的国家战略,也是国家安全体系的重要内容。绿色农药在保障农产品产量和质量、防治各种农作物病虫草害的发生、保障粮食安全方面起着重要作用。通过农药的合理使用,可挽回世界农作物总产30%-40%的损失【1。绿色新
8、农药的开发和利用有利于农业增产增收和可持续发展,是各国农药产业发展的主要方向。经过2 0 年的发展,虽然我收稿日期:2 0 2 3-0 3-0 3基金项目:河北省自然科学基金重点项目(C2021204093),河北省重点研发计划项目(2 0 32 6 510 D),河北省高等学校科学技术研究重点项目(ZD2020319),河北省自然科学基金面上项目(C2021204137)作者简介:周璐祺,男,硕士研究生,研究方向:井冈霉素调控伏马毒素合成的分子作用机理;E-mail:luqizhou_通讯作者:赵斌,男,博士,副教授,研究方向:新农药作用机理;E-mail:;刘颖超,女,博士,教授,研究方向
9、:农药残留分析;E-mail:2023,39(9)国在绿色农药的创制和应用上取得了较多原创性成果,但仍然存在较多问题,例如原创性靶标少、新农药品种单一、植物耐药性增强等2 。近年来,在医学上,天然产物已经逐渐被开发为新型药剂用于治疗各类疾病3。在农业上,我国的植物化学家们也基于天然的活性物质开发了农用化学品,但是品种相对较少,例如以白头翁(Pulsatilla chinensis(Bu n g e)Re g e l)、虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc)、蛇床花(Cnidium monnieri(L.)Cu s s)、马蓝(Baphicacanthus cu
10、sia(Ne e s)Br e me k)等植物为材料,提取到活性物质并以其为基础开发了原白头翁素A、大黄素甲醚、蛇床子素、喹唑啉酮等4种新型杀菌剂4;基于苦皮藤(Celastrus angulatusMaxim)开发出了对鳞翅目昆虫具有较好的杀虫效果的杀虫剂苦皮藤素5。尽管天然产物具有安全无毒、结构新颖等特点,但其化学结构复杂不能直接作为农药使用。天然产物具有多元的结构,可以以天然产物为先导设计新型衍生物或研究其新型作用靶标,进而加速具有自主知识产权的新型农药创制与开发。新农药创制可以采取不同策略,常见创制方法有表型筛选和靶向筛选。基于药物靶向筛选策略是目前较为常用的新农药分子设计方法;然而
11、大量、重复使用单一靶标农药,无疑会使“农药残留、有害生物再猬癫及生物抗药性”问题日益凸显,若轮换使用靶标相同或相似的农药,也会增加此类风险。近年来有研究表明,基于表型筛选发现新药的成功率高于靶向筛选6 1,基于表型筛选获得的生物活性化合物是以相关病虫草害为基础进行筛选,并不限于单一的基因或者蛋白质。因此表型筛选近年来重新受到重视,但表型筛选的最大问题在于得到的化合物靶点未知7 ,尽管在新农药创制的早期阶段不一定需要了解药物靶标,但是对候选化合物的靶点研究对全面解析候选化合物的作用模式是非常有必要的【8 。同时一个新靶标的价值往往高于一个新产品,例如以鱼尼丁为探针发现细胞膜上一类独特的作用靶标鱼
12、尼丁受体(ryanodine receptors,RyRs),化学家们基于鱼尼丁受体开发出目前常用的邻苯二甲酰类和邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂9。新靶标的发掘作为绿色农药创制的重要途径之一,周璐祺等:化学蛋白质组学在天然产物分子靶标鉴定中的应用物靶点及新农药创制研究提供参考。1基于标记的化学蛋白质组学靶标识别方法生物体中小分子化合物与蛋白质相互作用关系是药物结构改造及成药的关键,分析小分子药物与靶点相互作用的信号和代谢规律变得日益重要,一方面通过活性分子的靶点信息可以对化合物进行针对性的改造从而提高其作用效果,另一方面可以确定活性分子对目标靶标的选择性,有效的预测其潜在的毒副作用,降低研发风险。
13、化学蛋白质组学是化学生物学研究的重要手段之一,有别于以往对蛋白质进行定性或者定量鉴定的蛋白质组学技术,化学蛋白质组学旨在通过一系列功能各异的化学探针,结合蛋白质组学技术,解决复杂体系如细胞裂解液、活细胞、组织中的蛋白质如何与小分子药物相互作用的问题,目前已被应用于小分子药物靶点发现、药物先导化合物的筛选等研究中14。其一般流13已成为国内外研究的重点和热点。蛋白质是大多数药物的主要靶点,小分子化合物与细胞内的蛋白靶点相结合是药物发挥药理活性的基础,然而监测蛋白活性及功能的方法在药物发现过程中仍未得到系统性的应用10 。同时,药剂在发挥活性时往往不是针对单一蛋白,而是与多个蛋白质相互作用11。这
14、种多靶点的作用模式使得确定天然产物的单一靶点并对其进行特异性研究十分困难。因此迫切需要一种能够全面识别天然产物靶点的方法。以小分子天然产物为起点筛选靶标蛋白常用技术手段,包括化学蛋白质组学、化学基因组学和生物物理学等,其中化学蛋白质组学可以直接分析小分子化合物的靶标蛋白,是一种捕获和鉴定小分子化合物蛋白质靶标的有效方法,已经成为蛋白质组与药物靶点研究和新药研究的重要手段,及在蛋白质水平上鉴定小分子化合物与细胞内蛋白质相互作用的主要方法之一12-13。在本综述中,通过药物靶标发现实例,总结了基于化学蛋白质组学开发出的药物靶标鉴定方法,包括标记法和非标记法,并详细探讨了它们的原理、实验流程、优缺点
15、及适用范围。由于医药领域的发展要先于农药,因此本文以医药靶标开发方法为主,旨在通过阐述基于化学蛋白质组学发现药物作用靶标最新方法的进展,为天然产14生物技术通报BiotechnologyBulletin2023,Vol.39,No.9程为将引入亲和基质或报告基团的化学探针与蛋白质组进行孵育,利用亲和纯化等方法富集与探针结合的蛋白,再通过质谱等其他辅助技术来分析。常用的基于化学蛋白质组学的小分子药物靶点研究方法有以化合物为中心的化学蛋白质组学(compound-centric chemical proteomics,C C C P)和以活性探针为基础的蛋白质谱分析(activity-based
16、proteinprofiling,ABPP),工作流程如图1所示15。ABPPIncubation1DProteinCCCP2D图1CCCP和ABPP化学蛋白质组比较Fig.1 Comparison of CCCP and ABPP chemical proteome1.1以化合物为中心的化学蛋白质组学靶标鉴定方法CCCP是最早用于确定靶标蛋白的方法,早在20世纪90 年代,Harding等16 就通过亲和层析方法筛选到天然免疫抑制剂FK506的结合蛋白FKBP12(FK 50 6 b i n d i n g p r o t e i n 12)。CCCP 将药物分子进行修饰后引人标签分子,然后
17、固定到基质上如琼脂糖凝珠或其他树脂,富集可以与药物分子结合的蛋白质,然后通过质谱技术进行鉴定。这是鉴定化合物靶标较为经典的方法,具有快速、大量富集靶标蛋白的优点。该技术主要用于研究具有生物活性的小分子化合物与蛋白质的相互作用,更有利于识别目标蛋白质以外的蛋白质,为新药开发提供理论依据。Bach等17】发现(R)-r o s c o v i t i n e 除可作为周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CD K s)的专性抑制剂外,还可以抑制吡哆醛激酶的活性。酪蛋白激酶2(caseinkinase 2,CK2)是一种临床上常见的治疗癌症的靶点,Gyenis等18
18、利用固定在Sepharose磁珠上的ATP/CK,抑制剂TBB,从细胞裂解液中捕获和识别结合蛋白,证明CK2可以与TBB相互作用,同时还识别到一些潜在的目标蛋白,如羰基磷酸合成酶I(c a r b a mo y l-p h o s p h a t e s y n t h a s e I,CPSM)、真核细胞生长因子l(e u k a r y o t i c e l o n g a t i o nfactor1-alpha1,EEF1l)等,并为CK2激酶抑制剂以及抗癌药物的开发奠定了基础。Faiela等19对Hardwickic acid(H A A)进行修饰并固定在基质载体上与细胞裂解液进行
19、孵育发现,HAA可以与Hsp27结合,为Hsp27化学抑制剂的开发提供了方向【19。苦皮藤素作为化学杀虫剂可以影响昆虫的消化系统,Lu等2 0 1采用亲和层析的方法,从昆虫中肠中鉴定到11种可以作为苦皮藤素的潜在靶标蛋白的蛋白质,并成功预测了苦皮藤素与V-ATPase的结合位点。尽管利用亲和色谱的方法鉴定小分子化合物靶标较为经典,但其对细胞材料要求较高,同时亲和层析实验在体外进行无法反映生理条件下药物与活细胞中蛋白质的相互作用。在此基础上,Hu等2 1开发了水溶性纳米聚合物药物载体,并利用其在活细胞中筛选药物靶点。此外,Bantscheff等2 2 开发出kinobeads技术,成功解决了小分
20、子药物无法进行化学修饰的问题。1.2V以活性探针为基础的蛋白质谱靶标鉴定方法ABPP是由美国的Cravatt课题组最先提出的蛋白质组学技术【2 3】,是目前应用较为广泛的化学蛋白质组学技术。其在CCCP技术的基础上改进,是一种更为简便且适用性更为广泛的鉴定方法。与CCCP不同,ABPP的核心是将基于活性的探针(activity-based probes,A BPs)用于靶向功能相关的蛋白质组,并且这些探针可以共价修饰从丝氨酸水解酶到糖苷周璐祺等:化学蛋白质组学在天然产物分子靶标鉴定中的应用2023,39(9)酶等酶类的活性位点2 4。因此,ABPP技术的关键步骤在于活性探针的设计及合成。一般来
21、说,探针分子应以活性化合物为基础进行设计,同时探针分子可以与靶标蛋白共价结合,但在探针合成的过程15中引入的标记物会影响小分子化合物的活性,点击化学(clickchemistry)及光亲和标记技术(photoaffinitylabeling technique)的引人进一步开拓了ABPP技术的适用范围2 5,具体流程如图2 所示。MS+MS/MSAIncubateABPBCC-ABPPAL-ABPA:与生物素偶联结合;B:基于生物正交反应基团(炔基)的探针;C:基于光亲和基团的生物探针A:Conjugated with biotin.B:Probes based on the bioortho
22、gonal reactive groups(alkynyl).C:Biological probes based on photoaffinity groupsFig.2 Analysis strategies based on affinity proteomicABPP技术最初用于某一类蛋白质的活性监测,如半胱天冬酶、丝氨酸水解酶等2 6 。除此之外,ABPP还可以作为工具来研究某一类化合物的具体作用机制,确定其有效官能团或者骨架,为开发更有效的药物提供基础2 7 。近年来,利用ABPP鉴定小分子化合物在全蛋白组水平的作用靶标也得到了越来越多的应用,该技术以天然产物分子骨架中特定官能团的活
23、性功能为基础,选择相应的活性探针,利用竞争性策略筛选靶标蛋白【2 8 ,主要通过如下手段来实现。1.2.1生物素修饰生物素修饰是一种被广泛应用的亲和纯化方法,生物素能与链霉抗生素蛋白(s t r e p t a v i d i n)和亲和素(neutravidin)特异性结合,是目前已知蛋白配体作用力中最强的一种,因此链霉抗生素蛋白或亲和素常被用于与生物素结合来富集、纯化和识别活性小分子在细胞内的靶点。该方法的优点是生物素修饰的小分子化合物可以在进行亲和纯化之前,与细胞蛋白质组甚至与细胞膜内的靶蛋白充分接触。生物素富集方式主要为生物素Pull-downN3IncubateClickIncuba
24、teUv图2 基于亲和蛋白质组分析策略与链霉亲和素不可逆结合,因此会对ABPP工作流程的复杂程度和质谱能检测到的蛋白数量产生较大影响,因而被不断优化与开发,如2 0 19年,Zanon等2 9开发了一种脱硫生物素(desthiobiotin,D T B,结构式见图3)标签可被轻松洗脱,排除了内源生物素化的干扰,减少了肽段的损失,通过合成带有DTB标签的探针分子与金黄色葡萄球菌蛋白质组进行孵育,结果表明,带有DTB标签的探针分子操作起来较为简便,同时增加了金黄色葡萄球菌蛋白质组中半胱氨酸的覆盖率。EriocalyxinB是从中草药枇杷素中提取的抗肿OHNOHNH2Fig.3Molecular s
25、tructure of DTB labelm/zPull-downN3ClickPull-downO图3DTB标签的分子结构工艺二NHNH16瘤有效成分,Kong等30 采用生物素富集的方式对EriocalyxinB的靶标蛋白进行富集,成功鉴定到P50蛋白为其靶标蛋白。小白菊内酯具有抗炎活性,为确定其在体内的直接作用靶点,Kwok等31对小白菊内酯结构进行改造以合成亲和素探针,试Table 1 Examples of biotin probes used for the target identification of small molecular compounds小分子化合物Small
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