化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征大鼠的改善作用及对TGF-β_CTGF通路的影响.pdf
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1、【实验研究】化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征大鼠的改善作用及对 TGF-/CTGF 通路的影响岳美宏1,姜大成1,雷钧涛2(1.长春中医药大学药学院,长春 130117;2.吉林医药学院药学院,吉林吉林 132013)摘要:目的 探究化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠的改善作用及对卵巢组织转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF)-/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)通路的影响。方法选取 45 只 SD 雌性大鼠,其中随机取 8 只为
2、对照组,其余大鼠给予来曲唑加高脂乳剂建立肥胖型 PCOS 模型。32 只大鼠建模成功并随机分为 4 组,模型组,化痰祛湿方高、低剂量组及阳性组,每组各 8 只。低、高剂量组分别给予 16.65 g/kg、83.25 g/kg 化痰祛湿汤,阳性组给予二甲双胍0.3 g/kg。21 d 后检测各组大鼠体质量,血清黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)水平,卵巢组织病理学变化及 TGF-/CTGF 通路 mRNA 及蛋白表达情
3、况。结果 与对照组比较,模型组大鼠血清 LH、T 水平上升,FSH、E2 水平下降(P0.05);卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA与蛋白表达均上调(P0.05);卵巢组织可见闭锁卵泡数增加,颗粒细胞层减少。与模型组比较,化痰祛湿方低、高剂量组及阳性组大鼠上述指标均有明显改善(P0.05),且高剂量组与阳性组的改善效果优于低剂量组大鼠(P0.05),两组大鼠卵巢内可见成熟卵泡。结论 化痰祛湿方能够改善肥胖型多囊卵巢综合征,其作用机制可能与 TGF-/CTGF 信号通路有关。关键词:化痰祛湿方;肥胖;多囊卵巢综合征;转化生长因子-;结缔组织生长因子 中图分类号:R285.5 文献标识码:A
4、文章编号:1006-3250(2023)08-1279-05 基 金 项 目:吉 林 省 科 技 发 展 计 划 重 点 科 技 攻 关 项 目(20180201004YY)作者简介:岳美宏(1996-),女,硕士研究生,从事中药品质鉴定、质量标准及其开发利用的研究。通讯作者:雷钧涛(1971-),男,教授,从事中药及其开发的研究,E-mail:qunjixin8 。Effect of Huatan Qushi Recipe on TGF-/CTGF of Ovarian Tissue in Obese Polycystic Ovary Syndrome RatsYUE Meihong1,JI
5、ANG Dacheng 1,LEI Juntao2(1.College of Medicine,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.School of Pharmacy,Jilin Medical University,Jilin 132013,China)Abstract:Objective To explore the improvement effect of Huatan Qushi recipe on obese polycystic ovary syndrome(PCOS)rats,an
6、d the effect of connective tissue growth factor(CTGF)pathway on the transforming growth factor(TGF)-/CTGF pathway.Methods Forty-five SD female rats were selected,of which 8 were randomly selected as the control group,and the remaining rats were given letrozole plus high-fat emulsion to establish an
7、obese PCOS model.Thirty-two rats were successfully modeled and randomly divided into 4 groups,model group,Huatan Qushi recipe high,low dose groups and positive group,with 8 rats in each group.The low-dose and high-dose groups were given 16.65 and 83.25 g/kg Huatan Qushi recipe,respectively,and the p
8、ositive group was given metformin 0.3 g/kg after 21 days,the body weight,serum hormone levels Luteinizing hormone(LH),follicle-stimulating hormone(FSH),testosterone(T),estradiol(E2)levels,ovarian histopathological changes and TGF-/CTGF pathway mRNA and protein expressions were detected in each group
9、.Results Compared with the control group,the levels of serum LH and T in the model group increased,while the levels of FSH and E2 decreased(P0.05).The mRNA and protein expressions of TGF-and CTGF in ovarian tissue were up-regulated(P0.05).The number of atretic follicles increased and the granulosa c
10、ell layer decreased in ovarian tissue.Compared with the model group,the above indicators in the low-dose,high-dose and positive groups of Huatan Qushi recipe were significantly improved(P0.05).And the improvement effect of the high-dose group and the positive group was better than that of the low-do
11、se group(P 0.05),and mature follicles were found in the ovaries of the two groups.Conclusion Huatan Qushi recipe can improve obese polycystic ovary syndrome,its mechanism of action may be related to the TGF-/CTGF signaling pathway.Key words:Huatan Qushi recipe;Obesity;Polycystic ovary syndrome;Trans
12、forming growth factor-;Connective tissue growth factor多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的内分泌疾病,临床表现为月经不调,脱发及不孕等1。PCOS 的发病机制至今尚未明确,目前认为激素水平失调,胰岛素抵抗以及卵巢间质纤维化均与 PCOS 的发生密切相关2。西医主要以药物或手术为主,对于改善 PCOS 患者激素水平97212023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8 中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine等临
13、床症状效果显著,但后期复发率较高,因此本研究考虑中药干预3。中医认为,痰湿蕴结是肥胖型PCOS 的重要病理特征,应以祛湿化痰为立法原则,化痰祛湿汤出自证治宝鉴卷十二,具有改善痰湿体质的功效,但作用机制尚不明确4-5。卵巢间质纤维化是导致 PCOS 的重要原因,而转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)水平与卵巢间质纤维化程度有关6-7。故本研究选用化痰祛湿方治疗肥胖型 PCOS,观察化痰祛湿方对肥胖型 PCOS 大鼠卵巢组织 TGF-、CTGF 的影响,以期为 P
14、COS 的治疗提供新的研究方向。1 材料与方法1.1 动物SPF 级、SD 雌性大鼠 45 只,体质量 185225 g,平均(20520)g,购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司,实验动物许可证为SCXK(京)2020-0007,本研究已通过本院伦理委员会批准,伦理批准文号:2020-0175。1.2 药物二甲双胍片(国药准字 H20023371,中美上海施贵宝制药有限公司,规格:0.5 mg);来曲唑(国药准字 H19991001,江苏恒瑞医药股份有限公司,规格:2.5 mg)。化痰祛湿方组方:薏苡仁 30 g,泽泻 30 g,茯苓10 g,白术 15 g,半夏 10 g,藿香 10 g,
15、猪苓 10 g,赤芍25 g,天竺黄 12 g,石菖蒲 12 g,蒲黄 12 g,陈皮12 g8。所有药材洗净后浸泡 20 min,并加入水没过药材,煮沸后文火浓缩至 50 mL,并根据配方将生药浓度调整为为 5 g/mL,作为储存液,使用进行稀释,化痰祛湿方所用药物均由本研究中心于海口市张仲景大药房集中采购。1.3 主要试剂及仪器戊巴比妥钠(CAS 号:57-33-0),上海哈灵生物科技有限公司;中性甲醛(CAS 号:50-00-0),北京华科盛精细化工产品贸易有限公司;苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染 色 试 剂 盒(货 号:YT8310),北京伊塔生物科技有限公
16、司;RNA 提取试剂盒(货号:FT30506yy),上海梵态生物科技有限公司;实 时 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒(货号:qPCR001),北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;TGF-单克隆抗体(货号:IBIO-17268R)及山羊抗兔二抗(货号:IBIO-18015R),江西艾博因生物科 技 有 限 公 司;CTGF 单 克 隆 抗 体(货 号:A-6216-100)及山羊抗兔二抗(货号:A-6233-100),美国 Epigentek 公司;SIGMA/3-18
17、KS 型台式高速冷冻离心机,北京博劢行仪器有限公司;BS-350 型全自动生化分析仪,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;UV-9000 型紫外分光光度计,上海添时科学仪器有限公司;BT-2 型电泳仪,俄罗斯 Service 公司。1.4 大鼠模型建立选用 45 只动情周期正常的雌性大鼠,于 22,湿度 50%,通风,洁净度一万级的环境下进行适应性饲养,所有大鼠均记录初始体质量,随机选取 8 只为对照组,进行基础饲料喂养,其余大鼠建立肥胖型PCOS 模型。除对照组外,其余组给予高脂混悬液联合来曲唑(letrozole,LE)进行诱导,每天给予高脂混悬液 15 mg/kg,同时给予 LE 1 mg
18、/kg,连续给药28 d,给药 18 d 后,每日进行阴道脱落细胞涂片,第28 天记录大鼠体质量。大鼠动情周期紊乱,同时体重增长率高于对照组即判定为肥胖型 PCOS 大鼠模型建立成功9。1.5 分组及药物干预建模过程中 5 只大鼠建模失败,其余大鼠随机分为模型组,化痰祛湿方高、低剂量组及阳性组 4组,每组各 8 只。建模成功后,根据人与大鼠的体重及给药剂量换算公式,阳性组给予 0.3 g/kg 二甲双胍,低、高剂量组分别给予 16.65 g/kg、83.25 g/kg 化痰祛湿汤,对照组、模型组给予等量的氯化钠溶液,均灌胃给药,1 次/d,连续给药 21 d。1.6 取材最后一次给药后,禁食
19、12 h,对大鼠进行体质量称重并记录,采用 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,采集大鼠股动脉血 5 mL,室 温 放 置 1 h,离 心(2000 r/min,10 min,离心半径 12 cm)分离上层血清,于-80 环境下冻备用。血液采集完成后迅速将大鼠处死,并于无菌环境下取出右侧卵巢组织,并将周围血管及脂肪组织分离,每组四只置于 4%多聚甲醛中固定处理,用于 HE 染色,另外四只迅速置于液氮 10 min 后,于-80 环境下冷冻保存,用于RT-qPCR 及 Western Blot 检测。1.7 测量指标1.7.1 大鼠血清激素水平取 5 mL 上层血清,室温解冻,采用放射免疫法检测血清黄
20、体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)水平,严格按照相应试剂盒说明书进行操作10。1.7.2大鼠卵巢组织病理检测取 4%中性甲醛固定的卵巢组织样本,脱水,透明,浸蜡,包埋,制备成 4 m 切片,加入染液进行 HE 染色,将切片置于光镜下观察卵巢组织病理学变化11。1.7.3RT-qPCR 检测大鼠卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA 表达情况 取部分液氮保存的卵巢组织,根据 TRIzol 试剂盒说明书提取卵巢组织总RNA
21、,经逆转录得到 cRNA,根据 RT-qPCR 试剂盒检0821中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine 2023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8测卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA 表达。RT-qPCR反应体系:SYBR 10 mL,上游引物 0.4 L、引物0.4 L,cDNA 模板 2 L,H2O 加至 20 L;反应条件:先 95 作用 2 min;变性 95 10 s,退火 58 15 s,延伸72 10 s,循环40 次12。GAPDH 为内参基因,2-CT为目的基因相对定量,引物序列见表
22、1。表 1 各基因 PCR 引物序列基因引物序列引物长度GAPDHForward:5-TGGATTTGGACGCATTGGTC-320 bpReverse:5-TTTGCACTGGTACGTGTTGA-3TGF-Forward:5-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-320 bpReverse:5-TGGGACTGATCCVATTGATT-3CTGFForward:5-GGGCCTCTTCTGCGATTC-318 bpReverse:5-ATCCAGGCAAGTCAGGTA-31.7.4Western Blot 注检测大鼠卵巢 TGF-、CTGF 蛋白表达情况取液氮保存的卵巢组织,加入适
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