环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 4 期 2023 年 8 月Vol.18,No.4 Aug.2023 基金项目:中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-IQSTAP);国家乳液技术创新中心创建重点项目(2021-国家乳创中心-10)第一作者:卯明彩(1996),女,硕士研究生,研究方向为食品质量与安全,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221010001卯明彩,孟瑞媛,李亚梦,等.环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究J.生态毒理学报,2023,18(4):411-420Mao M C,Meng R Y,Li Y M,et al.Neurotoxicity of ciprofloxacin on early life stages ofDanio rerioJ.Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(4):411-420(in Chinese)环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究卯明彩,孟瑞媛,李亚梦,赵小余,钱永忠,邱静中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,农业农村部农产品质量安全重点实验室,北京 100081收稿日期:2022-10-10 录用日期:2022-12-16摘要:环丙沙星是恩诺沙星的主要代谢产物,因其抗菌谱广、杀菌力强、起效快等优点而被广泛应用,在土壤、水体等环境中被不同程度检出,然而目前有关环丙沙星对鱼类早期生命发育阶段的神经毒性效应研究较少。采用模式动物斑马鱼(Danio re-rio)作为研究对象,在 0.1、1 mg L-1浓度水平上,从胚胎自发运动、运动活性、乙酰胆碱酶活性及多巴胺、血清素通路和神经发?育关键基因的表达等方面评估环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性。结果表明,0.1 mg L-1浓度组抑制斑马鱼胚胎自发运动(P0.001),1 mg L-1浓度组诱导乙酰胆碱酯酶活性(P0.05);1 mg L-1浓度组斑马鱼运动行为活跃(P0.05)和光照刺激?惊恐反应性增加(P0.01);同时,胆碱能系统、多巴胺、血清素通路和神经发育系统的ache、shha、th2、htr1aa、htr5a表达上调(P?0.05),gfap、dat、nestin基因表达下调(P0.05)。这些结果表明环丙沙星可能通过影响多巴胺、血清素和神经发育关键基因的表?达产生神经毒性,进而影响运动行为。关键词:环丙沙星;斑马鱼;神经毒性;行为学;乙酰胆碱酯酶文章编号:1673-5897(2023)4-411-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:ANeurotoxicity of Ciprofloxacin on Early Life Stages of Danio rerioMao Mingcai,Meng Ruiyuan,Li Yameng,Zhao Xiaoyu,Qian Yongzhong,Qiu JingInstitute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory forQuality and Safety of Agricultural Products of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100081,ChinaReceived 10 October 2022 accepted 16 December 2022Abstract:Ciprofloxacin is the main metabolite of enrofloxacin,which is widely used because of its broad antibac-terial spectrum,strong bactericidal force and rapid onset of action,and has been detected in soil,water and otherenvironments to varying degrees.However,there are few studies on the neurotoxic effects of ciprofloxacin on earlylife stages of fish development.Therefore,in this study,the model animal zebrafish(Danio rerio)was used to assessthe neurotoxicity of ciprofloxacin on zebrafish at early developmental stages in terms of embryonic spontaneousmovements,motor activity,acetylcholinesterase activity and expression of dopamine and serotonin pathways andkey neurodevelopmental genes at concentrations of 0.1 mg L-1and 1 mg L-1.Our results showed that the 0.1 mg L-1concentration group inhibited the spontaneous movement of zebrafish embryos(P0.001),and the 1 mg L-1?concentration group induced acetylcholinesterase activity(P0.05).Zebrafish in 1 mg L-1group showed active lo-?comotor activity(P0.05)and increased startle response upon light stimulation(P0.01);at the same time,upregu-412 生态毒理学报第 18 卷?lation of the expression levels of genesache,shha,th2,htr1aaandhtr5a(P0.05),and downregulation of the ex-?pression levels of genesgfap,datandnestin(P99%,天津阿尔塔科技有限公司);乙酰胆碱酯酶活性试剂盒(南京建成生物工程研究所);RNA 提取、反转录和荧光定量 PCR 试剂盒第 4 期卯明彩等:环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究413(北京京北日晟生物科技有限公司)。斑马鱼养殖系统(Z-A-S5,上海海圣生物实验设备有限公司,中国)、体式光学显微镜(SZX2-ILLT,日本奥林巴斯);人工气候培养箱(RXM 智能型,宁波江南仪器厂,中国);酶标仪(Infinite M200 PRO,美国TECAN 公司),斑马鱼行为分析仪(DanioVison,Nol-dus 公司,荷兰);荧光定量 PCR 仪(CFX96TM RealTime PCR Detection System,BioRad,美国)。1.2 实验动物本实验所用斑马鱼为 AB 系野生鱼,购自南京一树梨花生物科技有限公司。饲养条件如下:光照周期 14 h(光)/10 h(暗),水温(280.5),pH=7.200.3,电导率(50030)Sm-1,每天投喂丰年虾活体(Artemia nauplii)2 次。实验前一晚,将健康斑马鱼?按雌鱼和雄鱼 2 2(个体数目比)的比例放置于产卵缸内,次日清晨完成交配和产卵,挑选发育正常的斑马鱼胚胎用于药物暴露实验。1.3 斑马鱼胚胎暴露实验实验前配制系列浓度暴露溶液,实验共设 3 个环丙沙星浓度梯度:0(超纯水)、0.1、1 mgL-1,收集斑马鱼胚胎,于显微镜下挑选发育正常,同一时期的胚胎置于 6 孔板中,加入相应体积的暴露液,于恒温培养箱中培养至 120 hpf(hours post fertilization,hpf),每个浓度设置 6 个平行,每个平行 30 枚胚胎,每 24 h 更换一次暴露液,暴露浓度依据农产品抽检结果和预实验结果选定。分别在暴露 0 h 和 24 h 取 100 L 暴露液进行浓度测定,色谱条件:XBridgeC18 色谱柱(2.1 mm100 mm,3.5 m),流动相为 0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),流速为 0.4 mLmin-1;柱温为 40;进样量为 1 L。质谱条件:电喷雾离子源;去簇电压(DP)为 73 V;正离子模式扫描;离子源电压为4 500 V;雾化器温度为 500;检测方式为多反应监测(multiple reaction monitoring mode,MRM),碰撞能为 23 V,保留时间为 2.02 min。1.4 胚胎自发运动测定从不同浓度暴露组中随机挑选 20 枚发育至 24hpf 的斑马鱼胚胎,于显微镜下视频记录并计数斑马鱼胚胎的自发胎动情况,每次 30 s,重复观察 2次,观测前,将胚胎置于显微镜下适应 2 min。1.5 运动行为测定分析经环丙沙星暴露后,每组随机取出 30 条发育至120 hpf 的斑马鱼幼鱼进行运动行为分析测定。将选取的幼鱼置于 96 孔板内,每孔 1 尾幼鱼和 300L 暴露液。完成准备工作后,将 96 孔板置于斑马鱼行为分析仪中进行运动行为测试,测试幼鱼在持续光照(自由游泳行为)、光暗周期下(运动活性监测)和不同光照刺激时长(光照刺激惊恐反应)下的运动行为。自由游泳行为检测程序为 10 min 暗-20 min亮,检测斑马鱼仔鱼在连续光照下的运动行为;运动活性监测测定程序为 10 min 暗-5 min 亮-5 min 暗-5min 亮-5 min 暗,检测斑马鱼仔鱼在光暗周期刺激下的游泳行为;光照刺激惊恐反应检测程序为 10min 暗-1 min 亮-5 min 暗-2 min 亮-5 min 暗-3 min亮,检测斑马鱼仔鱼在不同强光刺激时长下的应激惊恐行为。1.6 乙酰胆碱酯酶活性检测按照上述暴露条件处理斑马鱼胚胎至 120 hpf,收集幼鱼并整体组织匀浆,检测其乙酰胆碱酯酶活性。每个处理组 3 个平行,每个平行 30 条幼鱼(剔除未正常发育个体)。使用乙酰胆碱酯酶检测试剂盒进行测定。测定过程为:准确称取幼鱼组织质量,按照质量(g)体积(mL)为 1 9 的比例,加入 9 倍体积的生理盐水,在0 下超声破碎15 min,2 500 r min-1离心 10 min,于冰上待用,取上清液 30 L 用于测定乙酰胆碱酯酶活性,依次添加底物缓冲液和显色应用液 500 L(以上步骤于冰上避光操作),混匀,37 准确反应 6 min 后,依次添加抑制剂 30L、透明剂 100 L(以上步骤于常温条件下操作),混匀,静止 15 min 后,使用酶标仪于 412 nm 测定各管吸光度值。为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差,使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白量。1.7 实时荧光定量 PCR按照上述暴露条件处理斑马鱼胚胎至 120 hpf,收集幼鱼,每个处理组 3 个平行,每个平行 50 条幼鱼(剔除未正常发育个体),液氮速冻,置于-80 冰箱保存,使用试剂盒进行总 RNA 提取,提取过程为:获得的幼鱼组织中,加入 500 L 的 Buffer RL1于 20 条件下破碎匀浆 15 min,将匀浆液转移至DNA-Cleaning Column 中(DNA-Cleaning Column 放入收集管中),12 000 r min-1离心 2 min,移除 DNA-Cleaning Column,保留收集管内上清液,加入 1.6 倍体积的 Buffer RL2,轻柔混匀,将混合液转移至RNA-Only Column 中(纯化柱放入收集管中),12 000r min-1离心 1 min,弃收集管中的废液,重复一次,414 生态毒理学报第 18 卷向纯化柱中加入 500 L 的 Buffer RW1,12 000 rmin-1离心 1 min,弃收集管中的废液,加入 700 L的 Buffer RW2,12 000 rmin-1离心 1 min,弃收集管中的废液,重复一次,将纯化柱放入收集管中,12 000 r min-1空管离心 2 min,将纯化柱转移至新的收集管中,加入已于 65 预热的 RNase-FreeddH2O,室温放置 2 min,12 000 rmin-1离 心 1min,收集 RNA 溶液,注意以上全程常温操作,勿低温离心。cDNA 的合成依据 All-in-One First-Strand Syn-thesis MasterMix(with dsDNase)试剂盒说明书进行,荧光定量 PCR 按照 2SYBR Green qPCR Premix(Universal)试剂盒进行操作,使用实时荧光定量 PCR仪对各个基因进行扩增,以-actin为内参基因,Re-?al-time PCR 扩增结束后,用 2-Ct相对定量法计算?各组基因的相对表达量,目的基因引物序列信息26-27如表 1 所示。1.8 统计与分析实验数据采用 Graphpad Prism 8 软件进行数据分析和绘图。组间差异分析通过单因素方差分析(ANOVA)并以 Dunnetts 检验进行多重比较,设P?0.05 时有统计学差异,*P0.05、*P0.01。2 结果(Results)2.1 环丙沙星暴露前后浓度测定在暴露 0 h 和 24 h 时取 100 L 暴露液进行浓度测定,对其峰面积进行定量。定量结果为0.1 mg L-1(0 h:4.21E+05,24 h:3.83E+05)、1 mgL-1(0 h:4.32E+05,24 h:4.05E+05),这表明,在 24 h 暴露期间药物浓度基本维持恒定。根据定量结果,每 24 h更换一次暴露液可维持暴露浓度恒定。2.2 环丙沙星暴露对胚胎自发运动的影响斑马鱼胚胎的自主摆尾运动主要是斑马鱼尾部的摆动,与斑马鱼的次级神经元无关,是受到初级神经元支配的运动,不依赖斑马鱼的脑部神经元,是可检测到的最早神经行为28-29,可作为检测神经毒性的初始指标。各浓度暴露组的 24 hpf 自主运动次数如图 1 所示,0.1 mgL-1浓度组与对照组相比其胚胎自发运动次数(1.80 次min-1)显著降低(P?0.001),1 mg L-1浓度暴露下的胚胎自发运动次数(2.25 次 min-1)与对照组(2.90 次 min-1)相比显著降低(P0.05),因此其可显著抑制胚胎早期的自主运动次数,这表明,环丙沙星抑制斑马鱼胚胎的自主运动行为。表 1 目的基因引物序列信息Table 1 Gene primer sequence information基因Gene引物序列(5 3)Primer sequence(5 3)-actinF:CGAGCAGGAGATGGGAACCR:CAACGGAAACGCTCATTGCacheF:CCCTCCAGTGGGTACAAGAAR:GGGCCTCATCAAAGGTAACAth1F:GGTCTCACGGCTGGTATCCTR:TGCCTCGCAGAGCTTCACTdatF:TGGACTTCCGCGCCTGTATGATGR:TCCGGGCAGCGAGCAGAACTTGTAnr4a2bF:GAAGACGGCGAAATCGATGCR:CTGGCGGTTCTGACAACTTCCbdnfF:ATAGTAACGAACAGGATGGR:GCTCAGTCATGGGAGTCCth2F:ACATTCACGGCTGAGGAGTTTR:ATGCTGCCATACGTTTGGTChtr1aaF:TTCTACATCCCGCTCATCCTCAR:CCTCCAAGTTTTACCCACCTCTChtr5aF:TGGATCAAAGAGGACCAACACCR:CTGAAACGTCACCGTGGCAThtr1bF:GCTACGTCAACTCACTCATCAAR:TCCTATCGTCTGCAACATCTAAAhtr2aF:TACGGTGGCTGGGAACATTTTAGR:GGGACACAGTGATGCAGGGAAAsyn2aF:CTCCCAGCCCACCAATAAGGR:CATCCGTGTGCGAAAAGCAGmbpF:AATCAGCAGGTTCTTCGGAGGAGAR:AAGAAATGCACGACAGGGTTGACGshhaF:GCAAGATAACGCGCAATTCGGAGAR:TGCATCTCTGTGTCATGAGCCTGT1-tubulinF:AATCACCAATGCTTGCTTCGAGCCR:TTCACGTCTTTGGGTACCACGTCAgfapF:GGATGCAGCCAATCGTAATR:TTCCAGGTCACAGGTCAGelavl3F:AGACAAGATCACAGGCCAGAGCTTR:TGGTCTGCAGTTTGAGACCGTTGAgap43F:TGCTGCATCAGAAGAACTAAR:CCTCCGGTTTGATTCCATCnestinF:ATGCTGGAGAAACATGCCATGCAGR:AGGGTGTTTACTTGGGCCTGAAGAmanfF:AGATGGAGAGTGTGAAGTCTGTGTGR:CAATTGAGTCGCTGTCAAAACTTGchrn7F:TCAGTATTTTGCCACCACCAR:CTTTGTCTTCGCCAGGTCTC第 4 期卯明彩等:环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究415 图 1 环丙沙星暴露对斑马鱼胚胎自主运动的影响注:与对照组相比,*表示P0.05,*表示P0.001。Fig.1 Effect of ciprofloxacin exposure on the autonomicmovement of zebrafish embryosNote:Compared with control,*representsP0.05,*representsP0.001.2.3 环丙沙星暴露对幼鱼运动行为的影响在设定的检测程序内,暴露至 120 hpf 的幼鱼在光暗周期、持续光照和不同光照刺激时长下的运动速度如图 2(a)(c)所示,在运动活性(图 2(a)监测时间内,与对照组相比,各剂量组的运动速度随着暴露浓度的升高而降低,1 mgL-1浓度组(0.411 mms-1)与对照组(0.659 mm s-1)相比显著降低(P0.05);?自由游泳行为(图 2(b)检测结果显示,在持续光照刺激下,各浓度组的运动速度与对照组相比,有降低的趋势,但未见显著性差异;在不同光照刺激时长(图2(c)下,与对照组(0.729 mm s-1)相比,0.1、1 mg L-1暴露组的运动速度(1.02 mm s-1、1.06 mm s-1)随着暴露浓度的升高而加快,且具有显著差异(P0.05),?这表明环丙沙星可能使仔鱼处于应激紧张状态,改变其运动行为。2.4 环丙沙星暴露对幼鱼乙酰胆碱酯酶活性的影响一般认为乙酰胆碱酯酶是水环境中暴露于神经性药物的生物标志物,乙酰胆碱酯酶通过催化水解乙酰胆碱来终止其对胆碱受体的兴奋作用,维持神经冲动。由图 3 可知,与对照组相比,不同浓度的环丙沙星能够诱导乙酰胆碱酯酶活性上升,且 1 mgL-1(8.92 Umg-1)与对照组(6.96 Umg-1)之间有显著差异(P0.05),乙酰胆碱酯酶活性的升高使乙酰胆碱的受体减少,抑制兴奋的传递从而破坏神经递质系统,这表明环丙沙星对斑马鱼幼鱼存在神经毒性作用,其作用可能是由于乙酰胆碱供应不足而导致的。2.5 环丙沙星影响胆碱能系统相关基因表达为了探究乙酰胆碱酯酶活性变化的原因,本研究对胆碱类的相关基因(chrn7和ache)进行验证,?结果如图 4 所示,烟碱型胆碱受体 7(chrn7)与对?照组相比,其表达量随着环丙沙星浓度的升高而下调,未见显著差异。乙酰胆碱酯酶(ache)基因表达量?随着浓度升高而上调,1 mgL-1浓度组与对照组相比有显著差异(P0.05),这与酶活测量结果一致,表?明环丙沙星上调ache基因表达,诱导乙酰胆碱酯酶图 2 环丙沙星暴露对幼鱼运动行为的影响注:(a)幼鱼在光暗周期下的运动速度,(b)幼鱼在持续光照条件下的运动速度,(c)幼鱼在不同光照刺激时长下运动速度;与对照组相比,*表示P0.05,*表示P0.01。Fig.2 The effect of ciprofloxacin exposure on the movement behavior of juvenile fishNote:(a)The movement speed of zebrafish larvae under light dark cycle,(b)The movement speed of zebrafish larvae under continuous light conditions,(c)The movement speed of zebrafish larvae under different light stimulation duration;compared with control,*representsP0.05,*representsP0.01.416 生态毒理学报第 18 卷图 3 环丙沙星暴露对幼鱼乙酰胆碱酯酶活性的影响注:与对照组相比,*表示P0.05。Fig.3 Effect of ciprofloxacin exposure on acetylcholinesteraseactivity of juvenile fishNote:Compared with control,*representsP0.05.活性,破坏胆碱能系统。2.6 环丙沙星影响神经递质相关基因表达为了探究环丙沙星暴露引起的运动活性和应激惊恐反应行为变化的原因,测定了多巴胺通路关键基因(th1、dat、nr4a2b和bdnf)和血清素通路关键基?因(th2、htr1aa、htr5a、htr1b和htr2a)的表达。结果如?图5(a)所示,在多巴胺通路所验证的基因只有dat出现显著差异(P0.01),随着浓度的升高而下调;th1和nr4a2b基因表达量下调,bdnf基因表达上调,未?见显著差异。如图 5(b)所示,血清素通路的th2、htr1aa和htr5a基因表达量随着浓度升高而显著上调(P0.05),而htr1b和htr2a基因表达量亦上调,未?见显著差异,这提示环丙沙星影响多巴胺和血清素通路关键基因的表达,影响仔鱼运动活性和光照刺激惊恐反应。2.7 环丙沙星影响神经发育相关的基因表达为了进一步探究环丙沙星对斑马鱼神经毒性的内在机制,测定了神经发育系统的关键基因表达,结果如图 6 所示,syn2a、mbp、1-tubulin、gfap、nestin和?manf基因表达量下调,shha、elavl3基因表达量上调,?gap43基因表达量低浓度上调、高浓度下调,而shha、?gfap和nestin基因表达量与对照组相比有显著差异?(P0.05),表明环丙沙星扰乱幼鱼的神经发育关键基?因的表达,从而影响仔鱼运动行为,诱导神经毒性。图 4 环丙沙星暴露对幼鱼胆碱类受体相关基因表达的影响注:与对照组相比,*表示P0.05。Fig.4 Effect of ciprofloxacin exposure on the expressionof choline receptor related genes in juvenile fishNote:Compared with control,*representsP0.05.图 5 环丙沙星暴露对幼鱼神经递质相关基因表达的影响注:(a)多巴胺通路相关基因的表达水平,(b)血清素通路相关基因的表达水平;与对照组相比,*表示P0.05,*表示P0.01。Fig.5 Effect of ciprofloxacin exposure on expression of neurotransmitter related genes in juvenile fishNote:(a)The expression level of dopamine pathway related genes,(b)The expression level of serotoninpathway related genes;compared with control,*representsP0.05,*representsP0.01.第 4 期卯明彩等:环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究417 图 6 环丙沙星暴露对幼鱼神经发育基因表达的影响注:与对照组相比,*表示P0.05。Fig.6 Effect of ciprofloxacin exposure on the expression of neurodevelopmental genes in juvenile fishNote:Compared with control,*representsP0.05.3 讨论(Discussion)3.1 环丙沙星对运动行为的影响斑马鱼胚胎的自发运动反映斑马鱼的神经元活力,20 28 hpf 的自发运动表型为尾部交替摆动,其运动频率较为稳定30。本研究结果表明,环丙沙星抑制斑马鱼胚胎的自发运动次数,具有浓度依赖性,这种自发运动行为常作为生命早期阶段神经发育毒性的评价指标31。刘倩等32的研究表明双酚 S(BPS)显著抑制斑马鱼仔鱼的平均速度,对其运动行为能力产生影响,说明 BPS 对斑马鱼仔鱼具有早期神经毒性作用;胡占英和张靖溥33研究结果显示长春新碱暴露斑马鱼胚胎后出现运动速度降低,不活跃运动持续时间增加等神经抑制行为;尚艳楠等34用细辛脑溶液暴露斑马鱼胚胎后导致其运动行为活跃度减低,表明细辛脑对斑马鱼胚胎有神经发育毒性作用。而本研究结果显示,环丙沙星暴露后,光暗周期下的运动速度降低、不同光照刺激时长条件下运动速度上升,惊恐反应性增加,使仔鱼处于应激紧张状态,改变其运动行为。3.2 环丙沙星对神经递质相关基因的影响乙酰胆碱酯酶是水环境中暴露于神经性药物的生物标志物,乙酰胆碱酯酶通过催化水解乙酰胆碱来终止其对胆碱受体的兴奋作用,维持神经冲动35。本研究结果表明,环丙沙星暴露后斑马鱼幼鱼的乙酰胆碱酯酶酶活性升高,表明乙酰胆碱受体减少,抑制神经兴奋冲动的传递。本研究也验证了胆碱能系统相关基因的表达,乙酰胆碱酯酶活性基因表达上调,与酶活结果一致,另烟碱类胆碱受体(乙酰胆碱)表达量下调,这表明环丙沙星暴露抑制胆碱类受体的表达,抑制兴奋传递,进而破坏胆碱能系统,对斑马鱼仔鱼产生神经性影响。有文章报道神经递质的合成分泌、神经元发育和眼部发育等因素能够影响斑马鱼幼鱼的运动行为36-37。多巴胺调节斑马鱼的运动活性,血清素调节斑马鱼焦虑行为38,因此,本研究选择中枢神经发育系统、多巴胺和血清素通路的关键基因进行验证,探究环丙沙星暴露对斑马鱼幼鱼运动行为的内在分子机制变化。在多巴胺信号通路中,酪氨酸羟化酶(TH)是合成多巴胺的限速酶39,而多巴胺转运蛋白(DAT)可转运多巴胺至胞浆分解,是调节多巴胺的神经递质,nr4a2b负责多巴胺祖细胞的成熟、分化和存活,而?bdnf基因在神经发育中发挥着重要作用40。杨丽?华等41用双酚 A 暴露斑马鱼后干扰了nr4a2b和th1的表达,促进神经递质的分化。在本研究中,dat基?因显著下调,th2、htr1aa、htr5a和htr2a基因表达显?著上调,这与 Jia 等27的研究结果一致,这提示环丙沙星暴露扰乱斑马鱼幼鱼的多巴胺神经递质系统,进而引发运动活性和自由游泳行为的改变;上调血清素受体表达,促进兴奋传递,进而影响斑马鱼幼鱼的光照应激惊恐反应行为。3.3 环丙沙星对神经发育相关基因的影响验证中枢神经系统(CNS)相关基因的表达,其中 1-tubulin、gfap和nestin对神经系统形成有重要?作用,syn2a参与突触形成,mbp参与髓鞘形成,shha在神经系统中充当信号分子,elavl3负责一种 RNA?结合蛋白的表达,gap43负责神经细胞修复,而manf是一种重要的神经营养因子42-43,杨玉莹等44的研418 生态毒理学报第 18 卷?究表明全反式维甲酸通过抑制mbp与syn2a的表达干扰斑马鱼仔鱼的神经发育及行为活力。而本研究中mbp与syn2a的基因表达下调,朱晓宇等45的研?究结果表明仲丁威暴露斑马鱼胚胎后 1-tublin、?shha、elavl3、gap43、syn2a、gfap、mbp和manf等基因?的表达显著下调。本研究结果显示,shha基因表达?量与对照组相比显著上升;gfap和nestin与对照组?相比表达量显著下调,这表明环丙沙星暴露可能通过扰乱中枢神经系统的发育,进而对斑马鱼胚胎产生神经发育毒性。综上所述,环丙沙星暴露会抑制斑马鱼胚胎 24hpf 自发运动,诱导乙酰胆碱酯酶活性,运动行为活跃和光照应激惊恐反应改变。同时,基因表达结果显示,多巴胺通路、中枢神经发育系统的dat、gfap和?nestin基因下调,血清素通路、胆碱能系统和中枢神?经发育系统的th2、htr1aa、htr5a、ache和shha基因上?调可能与环丙沙星暴露后引起的神经毒性相关,但神经毒性背后的机制往往是高度复杂的,今后还需要进一步研究以深度解析环丙沙星对斑马鱼胚胎的神经毒性机制。通信作者简介:邱静(1979),男,研究员,博士生导师,研究方向为农产品质量安全风险评估。参考文献(References):1 Bird A.Molecular biology.Methylation talk between his-tones and DNA J.Science,2001,294(5549):2113-21152 Bondarczuk K,Markowicz A,Piotrowska-Seget Z.Theurgent need for risk assessment on the antibiotic resist-ance spread via sewage sludge land application J.Envi-ronment International,2016,87:49-553 Chai T T,Cui F,Yin Z Q,et al.Chiral PCB 91 and 149toxicity testing in embryo and larvae(Danio rerio):Appli-?cation of targeted metabolomics via UPLC-MS/MS J.Scientific Reports,2016,6:334814 Costa V,Angelini C,De Feis I,et al.Uncovering thecomplexity of transcriptomes with RNA-seq J.Journalof Biomedicine&Biotechnology,2010,2010:853916 5 Silveira A T,Maranho L A,Torres N H,et al.Assessmentof14C-sulfadiazine onDanio rerio(zebrafish)J.Journal?of Radioanalytical and Nuclear Chemistry,2018,318(2):1001-10086 Datson N A,van der Perk J,de Kloet E R,et al.Identifi-cation of corticosteroid-responsive genes in rat hippocam-pus using serial analysis of gene expression J.The Euro-pean Journal of Neuroscience,2001,14(4):675-6897 Ding L H,Zang L X,Zhang Y N,et al.Joint toxicity offluoroquinolone and tetracycline antibiotics to zebrafish(Danio rerio)based on biochemical biomarkers and his-?topathological observation J.The Journal of Toxicologi-cal Sciences,2017,42(3):267-2808 Ellerbrock R E,Canisso I F,Podico G,et al.Diffusion offluoroquinolones into equine fetal fluids did not induce fe-tal lesions after enrofloxacin treatment in early gestationJ.Veterinary Journal,2019,253:1053769 Etminan M,Westerberg B D,Kozak F K,et al.Risk ofsensorineural hearing loss with macrolide antibiotics:Anested case-control study J.The Laryngoscope,2017,127:229-23210Gao D X,Lin J,Ou K L,et al.Embryonic exposure tobenzo(a)pyrene inhibits reproductive capability in adultfemale zebrafish and correlation with DNA methylationJ.Environmental Pollution,2018,240:403-41111 肖超强.利用斑马鱼探讨氟喹诺酮结构与毒性的关系研究D.北京:北京协和医学院,2018:7-8Xiao C Q.Study on structure-toxicity relationship of fluo-roquinolones revealed by zebrafish D.Beijing:PekingUnion Medical College,2018:7-8(in Chinese)12 刘畅,杨琳燕,张伟,等.磁性微球免疫层析试纸快速检测牛奶中恩诺沙星和环丙沙星J.中国兽医杂志,2022,58(7):38-43Liu C,Yang L Y,Zhang W,et al.Rapid detection of enro-floxacin and ciprofloxacin in milk by magnetic micro-sphere immunochromatographic test strip J.ChineseJournal of Veterinary Medicine,2022,58(7):38-43(inChinese)13 牛曰华,张天闻,邹红梅,等.恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在大黄鱼体内的代谢动力学J.中国渔业质量与标准,2018,8(1):24-33Niu Y H,Zhang T W,Zou H M,et al.Pharmacokineticsof e