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医学免疫学实验课医学免疫学实验课免疫学教研室李宗喜 5346第一部分第一部分 体液免疫实验体液免疫实验实验一实验一l对流免疫电泳对流免疫电泳l凝集实验凝集实验l动物免疫动物免疫对流免疫电泳操作步骤对流免疫电泳操作步骤1.1.打孔：用直径打孔：用直径3mm3mm的打孔器成对打孔，孔距的打孔器成对打孔，孔距为为8-10mm8-10mm。2.2.加样：用微量加样器将加样：用微量加样器将10l10l（勿溢出）待（勿溢出）待检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗人检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗人IgGIgG血清加到阳极（左侧）侧孔内。血清加到阳极（左侧）侧孔内。3.3.电泳电泳2.5h2.5h。+-8mm兔抗人兔抗人IgGIgG血清血清待检血清待检血清左左右右注意事项注意事项l打孔无裂缝打孔无裂缝l孔勿靠近琼脂边缘孔勿靠近琼脂边缘l加样不溢出加样不溢出l加样无气泡加样无气泡l清洗加样器清洗加样器要求要求l准时准时l白大衣白大衣l认真记录认真记录l爱惜实验室爱惜实验室l水、电、煤气水、电、煤气l名单名单l课堂纪律课堂纪律l两次试验报告两次试验报告l期末考试期末考试免疫实验内容免疫实验内容免疫应答免疫应答体液免疫应答体液免疫应答细胞免疫应答细胞免疫应答抗体的检测抗体的检测其它的抗原抗体反应其它的抗原抗体反应血清抗体的检测血清抗体的检测抗体生成细胞的检测抗体生成细胞的检测凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应腹腔巨噬细胞吞噬功能测定腹腔巨噬细胞吞噬功能测定实验一、二、三实验一、二、三实验四实验四实验一实验一 体液免疫应答体液免疫应答抗体的检测抗体的检测其它抗原抗体反应其它抗原抗体反应血清抗体的检测血清抗体的检测凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应ABOABO血型的鉴定血型的鉴定对流免疫电泳对流免疫电泳动物免疫动物免疫体液免疫试验流程体液免疫试验流程l动物免疫动物免疫l血清分离，细胞提取血清分离，细胞提取l指标检测指标检测l经典抗原抗体反应经典抗原抗体反应l沉淀反应：对流免疫电泳沉淀反应：对流免疫电泳l凝集反应：凝集反应：ABOABO血型鉴定血型鉴定l小鼠抗体水平的检测小鼠抗体水平的检测l抗体生成细胞检测：溶血空斑试验抗体生成细胞检测：溶血空斑试验l血清中抗体水平的测定：血清中抗体水平的测定：ELISAELISA抗原抗原-抗体反应抗体反应l概念：概念：体内外发生的高度特异性结合反应，体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。结合位点的结构互补。l特点：特点：l特异性特异性l非共价键结合非共价键结合l比例要适当比例要适当影响抗原影响抗原-抗体反应的因素抗体反应的因素l电解质：电解质：0.85%0.85%氯化钠氯化钠l温度：温度：3737l酸碱度：酸碱度：pH6-8pH6-8沉淀反应沉淀反应 可溶性抗原（如细菌培养滤液、外毒可溶性抗原（如细菌培养滤液、外毒素、血清蛋白等）与相应的抗体结合，在素、血清蛋白等）与相应的抗体结合，在一定条件（适量的电解质，合适的酸碱度一定条件（适量的电解质，合适的酸碱度和温度）下，形成肉眼可见的沉淀现象，和温度）下，形成肉眼可见的沉淀现象，这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原为沉淀原(precipitinogenprecipitinogen)，其相应抗体，其相应抗体称为沉淀素称为沉淀素(precipitin)(precipitin)。将抗体预先混入琼脂中，铺板，然后将抗体预先混入琼脂中，铺板，然后在板上打孔，孔中加入抗原。因为抗原能在板上打孔，孔中加入抗原。因为抗原能在琼脂中扩散，所以在抗原抗体比例适宜在琼脂中扩散，所以在抗原抗体比例适宜处形成白色沉淀环。环的直径与抗原量成处形成白色沉淀环。环的直径与抗原量成正相关。正相关。单向免疫扩散单向免疫扩散结果分析结果分析183672144288NS火箭免疫电泳火箭免疫电泳 当抗原和抗体加入含有适量电解当抗原和抗体加入含有适量电解质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向四周扩散，若两者相互对应，分子比四周扩散，若两者相互对应，分子比例适合，在扩散一定时间后在两孔之例适合，在扩散一定时间后在两孔之间相遇并结合生成白色沉淀线。间相遇并结合生成白色沉淀线。双向免疫扩散双向免疫扩散结果分析结果分析AbAg沉淀线位置靠近浓度较小的一方沉淀线位置靠近浓度较小的一方沉淀线弯曲向分子量较大的一方沉淀线弯曲向分子量较大的一方一、对流免疫电泳一、对流免疫电泳 对流免疫电泳试验是将双向免疫扩对流免疫电泳试验是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。蛋白质抗原、抗体在电场中作定技术。蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度双向免疫扩散，从而加速沉淀向加速度双向免疫扩散，从而加速沉淀线的形成。线的形成。实验原理实验原理l在在偏偏碱碱性性的的缓缓冲冲液液和和电电场场中中，大大部部分分抗抗原原带负电荷，向阳极泳动；带负电荷，向阳极泳动；lIgGIgG等等电电点点与与缓缓冲冲液液的的pHpH接接近近，故故极极性性基基团解离很少，负电荷少；团解离很少，负电荷少；lIgGIgG分分子子量量大大，电电渗渗作作用用使使其其缓缓慢慢向向阴阴极极移动。移动。蛋白质是一种两性电解质蛋白质是一种两性电解质,它同时具它同时具有游离氨基和羧基。当蛋白质溶液处于有游离氨基和羧基。当蛋白质溶液处于某一某一pHpH时，蛋白质解离成正、负离子的时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，静电荷为趋势相等，即成为兼性离子，静电荷为零，此时溶液的零，此时溶液的pHpH称为蛋白质的等电点称为蛋白质的等电点（isoelectricisoelectric point,point,pIpI）。蛋白质溶）。蛋白质溶液的液的pHpH大于等电点时，该蛋白质颗粒带大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。负电荷，反之则带正电荷。等电点等电点电渗作用电渗作用 电渗是在电场中液体对于固体支持物电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有的相对移动。由于琼脂中含有SOSO4 42-2-，带负，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的移动，血清中的球蛋白就是如此。球蛋白就是如此。对流免疫电泳示意图对流免疫电泳示意图AgNa+羧基糖羧基糖-+AbPH=8.6AgNa+羧基糖羧基糖-+AbPH=8.6主要试剂与器材主要试剂与器材1.1.兔抗人免疫血清兔抗人免疫血清2.2.待检人血清待检人血清3.3.阴性对照血清阴性对照血清4.pH8.64.pH8.6巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液5.5.琼脂琼脂6.6.电泳仪电泳仪7.7.载玻片、打孔器、微量加样器载玻片、打孔器、微量加样器步骤步骤1.1.浇板：用浇板：用5 510ml10ml吸管吸取溶化的吸管吸取溶化的15g/l15g/l琼脂巴琼脂巴比妥溶液比妥溶液4ml4ml，浇注于洁净载玻片上。，浇注于洁净载玻片上。2.2.打孔：待琼脂凝固后，用直径打孔：待琼脂凝固后，用直径3mm3mm的打孔器成的打孔器成对打孔，孔距为对打孔，孔距为10mm10mm。3.3.加样：用微量加样器将加样：用微量加样器将10l10l待检血清加在阴待检血清加在阴极侧孔内（左侧），诊断血清加到阳极侧孔内极侧孔内（左侧），诊断血清加到阳极侧孔内（右侧）。然后将琼脂板置于电泳槽中，槽两（右侧）。然后将琼脂板置于电泳槽中，槽两侧搭用纱布或两层滤纸做盐桥（侧搭用纱布或两层滤纸做盐桥（56.5cm56.5cm）。）。每端约贴上每端约贴上1cm1cm，其余浸入缓冲液中。，其余浸入缓冲液中。4.4.电泳：接通电源，控制电流强度在电泳：接通电源，控制电流强度在2 23mA/cm3mA/cm板宽，电泳板宽，电泳2.5h2.5h。操作方法操作方法1.1.打孔：用直径打孔：用直径3mm3mm的打孔器成对打孔，孔距的打孔器成对打孔，孔距为为8-10mm8-10mm。（注意：尽量别打裂）。（注意：尽量别打裂）2.2.加样：用微量加样器将加样：用微量加样器将10l10l（勿溢出）待（勿溢出）待检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗人检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗人IgGIgG血清加到阳极（左侧）侧孔内。血清加到阳极（左侧）侧孔内。3.3.电泳电泳2.5h2.5h。8mm+-兔抗人兔抗人IgGIgG血清血清待检血清待检血清左左右右结果判断结果判断 l待检孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性，待检孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性，否则为阴性。否则为阴性。l在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于微沉淀条纹不清晰，于3737保温数小时可保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。增强沉淀条纹的清晰度。免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳凝集反应凝集反应 在在颗颗粒粒性性抗抗原原或或吸吸附附于于颗颗粒粒上上的的可可溶溶性性抗抗原原（或或抗抗体体）中中加加入入相相应应的的抗抗体体（或或抗抗原原），在在电电解解质质存存在在的的条条件件下下出出现凝集物的现象，称凝集反应。现凝集物的现象，称凝集反应。直接凝集反应直接凝集反应试管法凝集试验试管法凝集试验玻片法凝集试验玻片法凝集试验试管法凝集试验试管法凝集试验效价：效价：将待检血清进行倍比稀释后，加入等量抗将待检血清进行倍比稀释后，加入等量抗原进行反应。其中能够凝集抗原的最大血清稀原进行反应。其中能够凝集抗原的最大血清稀释倍数为血清的效价。释倍数为血清的效价。二、玻片法凝集试验二、玻片法凝集试验试剂与器材试剂与器材1.1.人外周血红细胞人外周血红细胞2.2.抗抗A A及抗及抗B B标准血清标准血清3.3.生理盐水生理盐水4.4.载玻片、采血针、消毒棉球等载玻片、采血针、消毒棉球等操作方法操作方法1.1.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。于第一格和第二格内各加一滴抗号码。于第一格和第二格内各加一滴抗A A及抗及抗B B标标准血清，第三格内滴加一滴生理盐水。准血清，第三格内滴加一滴生理盐水。2.2.用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的三用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的三个角分别取血，加入个角分别取血，加入1 1、2 2、3 3 格内。格内。3.3.轻轻摇动玻片，经轻轻摇动玻片，经1 12 2 分钟后用肉眼观察结果，分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。片放于低倍显微镜下观察。间接凝集抑制实验间接凝集抑制实验 将待检可溶性抗原与标准抗体混合，再加入将待检可溶性抗原与标准抗体混合，再加入标准抗原结合的载体微球。待检抗原与标准抗原标准抗原结合的载体微球。待检抗原与标准抗原竞争结合标准抗体，导致凝集现象被抑制。竞争结合标准抗体，导致凝集现象被抑制。间接凝集抑制实验原理间接凝集抑制实验原理小鼠抗体水平的检测小鼠抗体水平的检测一、免疫血清制备一、免疫血清制备二、血清分离二、血清分离三、酶联免疫吸附试验（三、酶联免疫吸附试验（ELISEELISE）检测抗体）检测抗体三、腹腔免疫三、腹腔免疫l动物：昆明鼠动物：昆明鼠6-86-8周，雌性周，雌性l抗原抗原：绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBCSRBC）l腹腔注射：腹腔注射：5%5%的的SRBCSRBC注射注射2ml2ml小鼠抓取方法小鼠抓取方法l用用左左手手拇拇指指和和食食指指捏捏住住小小鼠鼠尾尾巴巴中中部部，放放在在铁铁笼笼上上，小小鼠鼠自自然向前挣扎；然向前挣扎；l用用另另外外三三个个手手指指压压住住小小鼠鼠的的尾尾巴根部握入手掌；巴根部握入手掌；l放放松松拇拇指指和和食食指指，用用另另外外三三个个手手指指控控制制小小鼠鼠尾尾部部，然然后后用用食食指指和和拇拇指指捏捏住住小小鼠鼠头头部部两两边边疏疏松的皮肤提起小鼠；松的皮肤提起小鼠；l注注意意：小小鼠鼠尾尾巴巴的的尾尾端端容容易易断断裂裂，抓抓小小鼠鼠应应抓抓尾尾巴巴中中部部或或根根部。部。小鼠抓取方法小鼠抓取方法腹腔注射腹腔注射 左左手手提提起起并并固固定定小小鼠鼠，使使鼠鼠腹腹部部朝朝上上，鼠鼠头头略略低低于于尾尾部部，右右手手持持注注射射器器将将针针头头在在下下腹腹部部靠靠近近腹腹白白线线的的两两侧侧进进行行穿穿刺刺，针针头头刺刺入入皮皮肤肤后后进进针针3mm3mm左左右右，接接着着使使注注射射针针头头与与皮皮肤肤呈呈4545角角刺刺入入腹腹肌肌，穿穿过过腹腹肌肌进进入入腹腹膜膜腔腔，当当针针尖尖穿穿过过腹腹肌肌进进入入腹腹膜膜腔腔后后阻阻力力消消失失，有有落落空空感感。固固定定针针头头，保保持持针针尖尖不不动动，回回抽抽针针栓栓，如如无无回回血血、肠肠液液或或尿尿液液后后即即可可注注射射。注注射射量为量为0.1-0.2ml/10g0.1-0.2ml/10g体重。体重。