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河南省猪伪狂犬病病毒野毒感染血清学调查及gE基因遗传变异分析.pdf
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1、中国畜牧兽医 ,():C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e河南省猪伪狂犬病病毒野毒感染血清学调查及g E基因遗传变异分析王林青,赵丽,陈曦艋,吴少峰,韩莹莹,刘芳,金钺,陈红英(河南农业大学动物医学院,郑州 ;郑州师范学院分子生物学郑州市重点实验室,郑州 ;河南牧业经济学院动物医药学院,郑州 ;河南农业大学动物科技学院,郑州 )摘要:【目的】调查河南省猪伪狂犬病病毒(P s e u d o r a b i e sv i r u s,P R V)野毒流行特征及遗传变异情况.【方法】用E L
2、 I S A法检测 年从河南省 个不同养殖规模猪场采集的 份血清样本的g E抗体水平;采用P C R法对从 个猪场疑似P R V感染猪群中收集的 份病料进行g E基因扩增,并将阳性病料样品接种S T细胞进行病毒分离、g E全基因测序和遗传进化分析.【结果】血清样品g E抗体总阳性率为 ,从 年的 降至 年的 ,猪场阳性率为 .随着猪场规模增大,猪场阳性率、血清样本阳性率呈下降趋势;商品代养殖场、屠宰场和种猪场的场阳性率、血清样本阳性率依次降低;豫东、豫西、豫南、豫北和豫中血清g E抗体阳性率分别为 、和 ,月阳性率最高,月最低.组织病料样品中P R V阳性率为 (/),从P R V阳性病料样品
3、中共分离出株P R V分离株.g E全基因序列遗传进化分析结果显示,分离株都属于G e n o t y p e 型,且猪群中既有P R V经典株也有P R V变异株.【结论】河南省猪场中仍然存在P R V感染,且同时存在P R V经典株和P R V变异株,本研究结果为河南省猪伪狂犬病的防控与净化提供参考依据.关键词:猪;伪狂犬病病毒(P R V);血清学调查;g E基因;遗传变异中图分类号:S 文献标识码:AD o i:/j c n k i 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):收稿日期:基金项目:河南省科技攻关项目(、);河南省自然科学基金面上项目();河南省高校科技创新人才支持计划
4、(HA S T I T );河南牧业经济学院博士启动基金(HNUAHE D F )联系方式:王林青,E m a i l:w a n g l i n t s i n g c o m;赵丽,E m a i l:z h a o l i s q c o m.王林青和赵丽对本文具有同等贡献,并列为第一作者.通信作者金钺,E m a i l:j i n y u e c o m;陈红英,E m a i l:c h h y c o mS e r o l o g i c a l I n v e s t i g a t i o no fP o r c i n eP s e u d o r a b i e sV i
5、 r u s I n f e c t i o na n dG e n e t i cV a r i a t i o nA n a l y s i so fg EG e n e i nH e n a nP r o v i n c eWANGL i n q i n g,Z HAOL i,CHE NX i m e n g,WUS h a o f e n g,HANY i n g y i n g,L I UF a n g,J I NY u e,CHE N H o n g y i n g(C o l l e g e o fV e t e r i n a r yM e d i c i n e,H e n
6、a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,Z h e n g z h o u ,C h i n a;Z h e n g z h o uK e yL a b o r a t o r yo fM o l e c u l a rB i o l o g y,Z h e n g z h o uN o r m a lU n i v e r s i t y,Z h e n g z h o u ,C h i n a;C o l l e g e o fV e t e r i n a r yM e d i c i n e,H e n a nU n i v e r
7、s i t yo fA n i m a lH u s b a n d r ya n dE c o n o m y,Z h e n g z h o u ,C h i n a;C o l l e g e o fA n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,H e n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,Z h e n g z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】T h e p u r p o s e o ft h i s
8、s t u d y w a st oi n v e s t i g a t e t h e e p i d e m i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dg e n e t i cv a r i a t i o no fP s e u d o r a b i e sv i r u s(P R V)i ns w i n ei n H e n a nP r o v i n c e【M e t h o d】g Ea n t i b o d y l e v e l sw e r ed e t e c t e db yE L I S Ai
9、n s e r u ms a m p l e s c o l l e c t e d f r o m p i gf a r m s i nH e n a nP r o v i n c ed u r i n g g Eg e n ew a sa m p l i f i e db yP C Ri n s a m p l e s期王林青等:河南省猪伪狂犬病病毒野毒感染血清学调查及g E基因遗传变异分析f r o m p i gf a r m ss u s p e c t e do fP R V i n f e c t e dp i g s,a n dt h ep o s i t i v es a m
10、 p l e sw e r e i n o c u l a t e dw i t hS Tc e l l s f o rv i r u s i s o l a t i o n,g Eg e n e s e q u e n c i n ga n dg e n e t i c e v o l u t i o na n a l y s i s【R e s u l t】T h e t o t a lp o s i t i v er a t eo f g Ea n t i b o d y i ns e r u ms a m p l e sw a s ,w h i c hd e c r e a s e d
11、 f r o m i n t o i n T h ep o s i t i v er a t ei np i gf a r m sw a s W i t ht h ei n c r e a s eo fp i gf a r ms i z e,t h ep o s i t i v er a t eo f f a r ma n ds e r u ms a m p l es h o w e dad o w n w a r dt r e n d T h e f a r ma n ds e r u mp o s i t i v er a t e i nc o mm o d i t yf a r m,s
12、l a u g h t e r h o u s ea n dp i gb r e e d i n gf a r md e c r e a s e ds u c c e s s i v e l y T h ep o s i t i v er a t e so fg Ea n t i b o d yi ne a s t e r n,w e s t e r n,s o u t h e r n,n o r t h e r na n dc e n t r a lH e n a nw e r e ,a n d ,r e s p e c t i v e l y T h ep o s i t i v er a
13、 t e sw e r et h eh i g h e s t f r o mJ a n u a r y t oM a r c ha n d t h e l o w e s t f r o mO c t o b e r t oD e c e m b e r T h ep o s i t i v e r a t eo fP R Vi nt i s s u es a m p l e sw a s (/)At o t a l o f P R Vi s o l a t e sw e r e i s o l a t e df r o mP R Vp o s i t i v es a m p l e s
14、P h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do nt h eg Ec o m p l e t es e q u e n c e si n d i c a t e dt h a ta l li s o l a t e sb e l o n g e dt oG e n o t y p e a n dt h e r ew e r eb o t hc l a s s i c a ls t r a i n sa n dv a r i a n ts t r a i n s i np i gh e r d s【C o n c l u s i o n】P R
15、Vc l a s s i c a ls t r a i n sa n dP R Vv a r i a n ts t r a i n ss t i l le x i s t e di np i gf a r m si nH e n a np r o v i n c e T h er e s u l t sp r o v i d e dr e f e r e n c e f o r t h ep r e v e n t i o na n dc o n t r o l a n dp u r i f i c a t i o no fP R Vi nH e n a np r o v i n c e K
16、e yw o r d s:p i g;P s e u d o r a b i e sv i r u s(P R V);s e r o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n;g Eg e n e;g e n e t i cv a r i a t i o n伪狂犬病(P s e u d o r a b i e s,P R)是由伪狂犬病病毒(P s e u d o r a b i e sv i r u s,P R V)引起的多种动物共患的一种急性传染病.猪是P R V的自然储存宿主,一旦感染后呈潜伏感染状态,可终身带毒.猪感染P R V后会引起发热、母猪流产
17、、仔猪神经症状、高死亡率、育肥猪呼吸道症状等临床表现.年 在 匈 牙 利 猪 群 首 先 发 现P R V,后 于 年传入中国.世纪 年代,中国引进了匈牙利B a r t h aK 株,世纪 年代大规模使用基于B a r t h aK 的基因缺失疫苗进行免疫接种,同时严格 执 行“感 染 动 物 和 疫 苗 接 种 动 物 的 区 分(D I VA)”策略,猪伪狂犬病在国内猪场得到了有效控制.然而 年底,猪伪狂犬病在国内已免疫伪狂犬病疫苗的猪场中暴发,首先在华北、华中、东北流行,随后迅速蔓延到国内多个省份 ,对养猪业造成毁灭性打击.研究发现,新一轮暴发的P R V已发生变异,而现有疫苗只能提供
18、部分保护,且抗体阳性率逐年上升,严重制约着养猪业的可持续发展.近年来,从人类急性脑炎病例中分离出P R V,表明人类可能是P R V的潜在宿主,再次引起了学者的关注 .g E作为P R V的一个重要的毒力决定基因,通常利用g E基因缺失来制备P R V疫苗,欧、美国家规定,缺 失g E基 因 的 疫 苗 才 可 被 使 用,用g E E L I S A方 法 即 可 区 分 野 毒 株 和 疫 苗 株,有 利 于P R V的逐步根除.为了解河南省猪伪狂犬病流行动态,分析P R V野毒流行特征及遗传变异情况,本研究 采 用E L I S A鉴 别 诊 断 方 法 对 年月至 年 月从河 南省 个
19、 猪场 采 集 的 份血清进行g E抗体检测,并对P R V分离株g E基因进行遗传进化分析,以期为猪伪狂犬病的防控和相关产品的研发提供参考.材料与方法 材料 细胞、血清和组织病料 猪睾丸细胞(S T)购自中国兽药监察所.采集的 份猪血清样本来源于 年月至 年 月河南省 个地区 个不同规模猪场(包括屠宰场、商品代养殖场和种猪场),根据猪场规模分为小型(头)、中型(头)和大型养猪场(头).份临床病料样品(包含大脑、淋巴结和肺脏),分别采自 年河南省 个规模化猪场疑似患有伪狂犬病的 头病猪,于 保存备用.主 要 试 剂 P s e u d o r a b i e s V i r u sg EA n
20、 t i b o d yT e s tK i t购自I D E X XL a b o r a t o r i e s公司;T a qM a s t e r M i x购自南京诺唯赞生物科技有限公司;D L D NA M a r k e r、p MD T载体、大肠杆菌DH 感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司;柱式D NA抽提试剂盒、D NA凝胶回收试剂盒、柱式质粒D NA提取剂盒购自Om e g a公司;胎牛血清和DMEM培养基购自G i b c o公司.方法 血清学检测按照P s e u d o r a b i e sV i r u s中国畜牧兽医 卷g EA n t i b o d y
21、T e s tK i t说明对采集的血清样本进行g E抗体检测.以S/N值区分感染和接种疫苗的动物(S为样品孔D n m值,N为阴性对照孔D n m值),S/N 时,判为阳性;S/N 时,判为阴性;S/N 时,判定样品可疑且需要重新检测.病料样品P R V的P C R鉴定取组织病料样品,加入适量磷酸盐缓冲液(P B S,p H)研磨、制成匀浆,冻融次,r/m i n离心m i n.收取上清液,利用柱式D NA抽提试剂盒抽提样 品D NA.参 照Z h a n g等 方 法 合 成 靶 向P R Vg E基因的 检测引物,引 物 序 列:g E p F:T G G GA C A C G T T
22、C GA C C T GAT G ;g E p R:C C T T GAT GA C C G T GA C G T A C T ,以病料D N A为模板,进行P C R扩增.P C R反应体系 L:模板L,T a qM a s t e r M i x L,上、下 游 引 物(p m o l/L)各 L,双 蒸 水 补 足 至 L.P C R反应程序:预变性m i n;变性 s,退火 s,伸延 s,共 个循环;伸延 m i n.P C R产物用 琼脂糖凝胶电泳检测.病毒分离P C R鉴定阳性组织样品经 m滤膜过滤后接种S T细胞,并盲传代.当 的S T细胞呈现细胞病变(c y t o p a t
23、 h i c e f f e c t,C P E)时,收集病毒细胞液,进行噬斑纯化.用柱式D NA抽提试剂盒提取细胞病毒D NA,用P R V特异性检测引物g E p F/R进行P C R检测.P C R扩增体系、程序同 .P R Vg E全基因克隆及遗传进化分析参照Z h a o等 方法合成扩增g E全基因P C R扩增引物(引 物 序 列:F:G G T G T G G G T G G C G T T T T AT C T ;R:T T T G G T G G G C AT G T C G G AAT G ).利用柱式D NA抽提试剂盒抽提分离株的D NA,以P R V分离株D NA为模板
24、,进行P C R扩增.P C R反应体系 L:模板L,T a qM a s t e r M i x L,上、下游引物(p m o l/L)各L,双蒸水 L.P C R反应程序:预变性m i n;变性 s,退火 s,延伸 s,共 个循环;延伸 m i n.用D NA凝胶回 收 试 剂 盒 回 收P C R产 物,纯 化 后 产 物 与p MD T载体连接后转化大肠杆菌DH 感受态细胞,接种L B肉汤培养基,用柱式质粒D NA提取剂盒提取质粒,筛选阳性克隆送生工生物工程(上海)股 份 有 限 公 司 测 序.应 用D NA S t a r软 件 的E d i t S e q程序对测序结果进行编辑,
25、并用M e g A l i g n程序对P R Vg E基因核苷酸序列进行相似性分析.通过M e g a 软件的C l u s t a lW进行序列比对,并用邻近法(n e i g h b o r j o i n i n g)进行P R Vg E基因系统进化树构建和氨基酸变异位点分析.结果 河南省猪群g E抗体阳性率对 年月至 年 月间河南省 个猪场 份血清样本进行P R V感染调查,E L I S A检测结果显示,份血清样本中 份样本g E抗体为阳性,阳性率为 ;个猪场共有 个猪场检出g E抗体阳性,阳性率为 (表).表 年河南省猪群血清样品P R Vg E抗体检测结果T a b l eD
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