基因工程的原理和技术-PPT.ppt

基因工程的原理和技术一、基因工程的操作步骤：一、基因工程的操作步骤：目的基因的获取；目的基因的获取；形成重组形成重组DNA分子；分子；重组重组DNA 导入受体细胞；导入受体细胞；筛选含有目的基因的受体细胞；筛选含有目的基因的受体细胞；目的基因表达。目的基因表达。1.第一步：目的基因的获取第一步：目的基因的获取（1）方法：）方法：从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用聚合酶链式反应利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基技术扩增目的基因（目的基因的序列已知）因（目的基因的序列已知）化学方法合成目的基因（目的基因的序列化学方法合成目的基因（目的基因的序列已知）已知）从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因用限制酶用限制酶用限制酶用限制酶切成许多切成许多切成许多切成许多片断片断片断片断 将含有某种生物不同基将含有某种生物不同基因的许多因的许多DNA片断，导入受片断，导入受体菌的群体储存，各个受体体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同菌分别含有这种生物的不同的基因，称为的基因，称为基因文库。基因文库。利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。因。uu聚合酶链式反应（PCR技术）变性：变性：双链双链DNADNA解链解链成为单链成为单链DNADNA复性（退火）：复性（退火）：部分部分引物与模板的单链引物与模板的单链DNADNA的特定互补部位的特定互补部位相配对和结合相配对和结合延伸：延伸：以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的模板，合成互补的新新DNADNA链链大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点双链双链DNA1.变性变性升温至升温至95单链单链DNA2.复性复性降温至降温至60引物与母引物与母链结合链结合3.延伸延伸升温至升温至72DNA聚合酶聚合酶解旋解旋PCRPCR技术与原理技术与原理Taq DNA聚合酶聚合酶有耐高温的特点有耐高温的特点思考：思考：PCRPCR技术扩增目的基因，需要什么前提和技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？条件？过程如何？原理是什么？聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR(PCR技术技术)扩增扩增原理：原理：目的：目的：前提：前提：条件：条件：DNA复制复制获得大量的目的基因获得大量的目的基因有一段已知目的基因（两端）有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列的核苷酸序列,以便根据这一以便根据这一序列合成引物。序列合成引物。模板模板DNA（目的基因）（目的基因）耐高温耐高温DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA(TaqDNA聚合酶聚合酶)四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸两种两种DNADNA引物引物人工合成基因的方法人工合成基因的方法人工合成基因的方法人工合成基因的方法反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列合成合成DNA化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成双链双链双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA(cDNA)DNA(cDNA)化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因通过化学合成的目的基因通过化学合成的目的基因通过化学合成的目的基因通过化学合成的目的基因是否含有粘性末端？是否含有粘性末端？是否含有粘性末端？是否含有粘性末端？大片段大片段DNA打成许多小片段打成许多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因载入运载体载入运载体细菌细菌重组重组DNA分子分子重组重组DNA分子分子例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因如果运气不如果运气不好，在打成好，在打成小片段时，小片段时，有可能把抗有可能把抗虫基因打断虫基因打断基因组文库基因组文库如何从基如何从基因文库中因文库中获取目的获取目的基因基因?大片段大片段DNA打成许多小片段打成许多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因载入运载体载入运载体细菌细菌重组重组DNA分子分子重组重组DNA分子分子基因组文库基因组文库对基因组文库对基因组文库的所有细菌进的所有细菌进行逐一筛查行逐一筛查找出有抗虫蛋找出有抗虫蛋白的菌落白的菌落该菌落所携带该菌落所携带的基因片段就的基因片段就含有目的基因含有目的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因容易吗？容易吗？2 2、形成重组形成重组DNADNA分子（构建基因表达载体分子（构建基因表达载体)基因表基因表达载体达载体的组成的组成启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子复制起点复制起点标记基因标记基因通常用同一种限制酶切割目的基因和载体通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒质粒)，形成相同，形成相同的粘性末端，再用的粘性末端，再用DNADNA连接酶将二者连接连接酶将二者连接,形成重组形成重组DNADNA分子分子（基因表达载体）。（基因表达载体）。3 3、将重组、将重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞转化转化常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1.1.将重组将重组DNADNA导入植物细胞导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法2.2.将重组将重组DNADNA导入动物细胞导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将重组将重组DNADNA导入微生物细胞导入微生物细胞Ca2+处理，处理，以增加细菌细胞壁的通透性。以增加细菌细胞壁的通透性。（1 1）将重组）将重组DNADNA导入植物细胞导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法（2 2）将重组）将重组DNADNA导入动物细胞导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植重组质粒重组质粒大肠杆菌的拟核大肠杆菌的拟核目的基因目的基因氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（标记基因）（标记基因）将细菌用将细菌用CaCl2处理，使处理，使细胞处于感受态，可促细胞处于感受态，可促进细胞吸收进细胞吸收DNA分子分子（3 3）如果是导入微生物（如细菌）如果是导入微生物（如细菌）感受态：细胞处于容易吸收外源性感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。的状态。处于感受态的细胞称为感受态细胞处于感受态的细胞称为感受态细胞.CaClCaCl2 20重组载体重组载体重组载体重组载体感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞42抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质粒A的结合点的结合点四环素抗性基因四环素抗性基因目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A A，只有，只有少数导入的是重组质粒。少数导入的是重组质粒。v 4.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：如以质粒做为载体可进行抗性的检测如以质粒做为载体可进行抗性的检测如以质粒做为载体可进行抗性的检测如以质粒做为载体可进行抗性的检测原理：质粒上有抗生素的抗性基因原理：质粒上有抗生素的抗性基因方法：利用选择培养基筛选方法：利用选择培养基筛选思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？没有质粒没有质粒含目的基含目的基因的质粒因的质粒正常质粒正常质粒没有质粒没有质粒含目的基因的质粒含目的基因的质粒正常质粒正常质粒检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNA上是否插入上是否插入了目的基因（关键）了目的基因（关键）检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）（2）常用的技术：）常用的技术：DNA分子杂交技术分子杂交技术蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交5.目的基因的表达目的基因的表达（1）内容：）内容：（2 2）基因工程的）基因工程的的原理及技术的原理及技术分子水平：分子水平：DNA分子杂交技术分子杂交技术核心核心DNA探针探针目的基因的脱氧核苷目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段酸（单链）序列片段用荧光分子或放射性用荧光分子或放射性同位素标记同位素标记看能否形看能否形成杂合的成杂合的双链区双链区检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定等过程过程:A.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段片段(单链单链)用放射性同位素等作标记用放射性同位素等作标记,以此做探针以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂若出现杂交带交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA.目的基因与质粒的连接目的基因与质粒的连接基因基因DNADNA文库的构建文库的构建 将将总总DNADNA经经过过酶酶解解，分分离离不不同同长长短短的的DNADNA片片段段。包包含含的的基基因因片片段段分分别别克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体体上上，感感染染细细菌菌或或体体外外包包装装到到噬噬菌菌体体颗颗粒粒上上便便构构成成了了该该生生物物的的基基因文库。因文库。基因探针：基因探针：基因探针：基因探针：基因探针就是一段与目的基因或基因探针就是一段与目的基因或基因探针就是一段与目的基因或基因探针就是一段与目的基因或DNADNADNADNA互补的互补的互补的互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是一部分；可以是一部分；可以是一部分；可以是DNADNADNADNA本身，也可以是由之转录而本身，也可以是由之转录而本身，也可以是由之转录而本身，也可以是由之转录而来的来的来的来的RNARNARNARNA。DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。的单链。基因探针（基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无探针）与目的基因杂交，有无杂交带杂交带传统的遗传育种方法有哪些？传统的遗传育种方法能否解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程技术如何解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种二、基因工程与疾病治疗二、基因工程与疾病治疗（）基因工程药物（）基因工程药物（2 2）基因诊断）基因诊断（3 3）基因治疗）基因治疗三、三、基因工程与环境保护基因工程与环境保护基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种1.抗虫转基因植物抗虫转基因植物2.抗病转基因植物抗病转基因植物3.其他抗逆转基因植物其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）4.利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质基因工程在农业上的应用：基因工程在农业上的应用：1 1）高产、稳产和具优良品质的品种）高产、稳产和具优良品质的品种2 2）抗逆性品种）抗逆性品种基因工程在畜牧基因工程在畜牧基因工程在畜牧基因工程在畜牧养殖业上的应用养殖业上的应用养殖业上的应用养殖业上的应用:基因工程与疾病治疗基因工程与疾病治疗v 基因工程药品的生产 在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？物体的哪些结构中提取？物体的哪些结构中提取？物体的哪些结构中提取？药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。可利用什么方法来解决上述问题？可利用什么方法来解决上述问题？可利用什么方法来解决上述问题？可利用什么方法来解决上述问题？利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造“工程菌工程菌工程菌工程菌”，可高效率地生产出各，可高效率地生产出各，可高效率地生产出各，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。种高质量、低成本的药品。种高质量、低成本的药品。种高质量、低成本的药品。基因工程胰岛素基因工程胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，胰腺中提取，100Kg100Kg胰胰腺只能提取腺只能提取4-5g4-5g的胰岛的胰岛素，其产量之低和价格素，其产量之低和价格之高可想而知。之高可想而知。胰岛素分子结构胰岛素分子结构胰岛素分子结构胰岛素分子结构基因工程胰岛素基因工程胰岛素将合成的胰岛素基因导将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每入大肠杆菌，每2000L2000L培养液就能产生培养液就能产生100g100g胰胰岛素！大规模工业化生岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了还使其价格降低了30%-30%-50%!50%!胰岛素生产车间胰岛素生产车间胰岛素生产车间胰岛素生产车间基因工程干扰素基因工程干扰素干扰素治疗病毒感染简直是干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药万能灵药”！过去从人血中提取，过去从人血中提取，300L300L血才提取血才提取1mg1mg！其其“珍贵珍贵”程度自不用多说。程度自不用多说。干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素分子结构SCID的基因工程治疗的基因工程治疗重症联合免疫缺陷重症联合免疫缺陷（SCIDSCID）患者缺乏正常的）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称编码腺苷酸脱氨酶（简称ADAADA）的基因（）的基因（adaada）发）发生了突变。可以通过基因生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。工程的方法治疗。SCIDSCID患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中基因治疗SCID的过程