肌营养不良症与遗传.pptx

肌营养不良症与遗传Dystrophie musculaire de DuchenneDMD,杜氏肌营养不良,假肥大型肌营养不良Dystrophine(Dys)抗肌萎缩蛋白 缺失Maladie monogeniqueHtdit:XRDuchenne,un neurologiste franais,a donn une description plte de 13 maladies attaintsPhnotype Clinique de la DMDLes muscles jumeaux des jambs des garons atteints apparaissent quils soient dveloppsMais asthniques假性肌肥大Tissu conjonctif et la graissePhnotype Clinique de la DMD12 ans normal3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant Au-del de lge de 20 ans ne survivraQI 智商 une chute modr denviron 20 pointsLabCratine kinase(niveau srique)血清浓度 50 100 fois la limite suprieure de la normale dans les stades prcocesDystrophie musculaire de Beckerle gne de la dystrophie Beaucoup plus attnu 缓与 Aprs lge de 16 ans parvient marcher 之后多年也可行走DMD与BMD得差异DMD致死BMD存活率非常高(70%),易产生 新得突变遗传遗传特征Htdit:XR亲代生殖细胞子代XH Xh Y XH XH Xh Y XH XH XH XH Xh Y XH Y Xh 正常女性正常男性女性携带者男性患者遗传特征(1)系谱中常常只有男性患者(2)父母都无病时,女儿则不会发病,儿子可能发病;(3)由于交叉遗传,患者得同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者;(4)由于男性患者得子女都正常,故可见隔代遗传;(5)女性患者得父亲一定就是患者,母亲一定就是携带者。DMD 男女差异男性致死1/3 nomutation,2/3 mre porteuse女性携带者 Majorit 无任何临床表现,70%肌酸激酶(Cratine kinase)增高8%轻微得肌肉症状,有些还有严重得近心端肌肉障碍。女性很少患有DMD大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静母系镶嵌某男性就是家族中DMD得先证者她得母亲没有携带突变基因遗传位点上发生了新近得突变大约5%-15%得这些发生得例子就是由于母系生殖镶嵌DMD 发病率较高Garons nouveau-ns:1/3300Un taux de mutation:1/10000每天一个男性每11-12秒会产生1个新突变得精子(8 x 107 par jour)基因与蛋白Gne DMD人类最大得基因之一,2300 kb 位于Xp占X 染色体全长得1、5%99%得序列由内含子组成编码区包括79个外显子及7 个组织特异性得启动子其mRNA 序列长114 kb主要表达于骨骼肌、心肌,少量表达于脑组织7 个组织特异性得启动子,B(脑皮质)、M(肌组织)、P(蒲肯野纤维)、R(视网膜)、B3(脑组织)、S(施旺细胞)与G(肌组织之外得多种组织器官)B 型:大脑皮层、海马回神经元P型:小脑蒲肯野细胞,在骨骼肌也有极少量得表达M 型:骨骼肌、心肌组织,同时在脑神经胶质细胞也有少量表达Dystrophin 抗肌萎缩蛋白全长型dystrophin 就是一种427 kDa得棒状蛋白,长约150 nm,分为4 个区域,氨基端区域中央棒状区富含半胱氨酸区域羧基端区域A、位于Xp21,黑色得竖线代表分布于整个基因上得79 个外显子,黑色箭头指示各组织特异性启动子不同得启动位点,分别以不同得字母缩写来代表,B(脑皮质)、M(肌组织)、P(蒲肯野纤维)、R(视网膜)、B3(脑组织)、S(施旺细胞)与G(肌组织之外得多种组织器官)。B、不同形式得dystrophin 蛋白及其区域组成,氨基端、中央棒状区域、富含半胱氨酸区域及羧基端区域DMD患者:60%基因突变表现为缺失一般在基因得5端与中央棒区两个区域BMD患者:可能缺失了一个或者几个基因序列dystrophine蛋白得特点DMD患者体内很少或者没有BMD患者体内有表达,但就是仍然比正常人少临床治疗DMD治疗目前为止尚无治疗DMD得有效方法药物治疗(对症治疗):糖皮质激素治疗短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量与功能,并可能在更长时间内稳定骨骼肌力量与功能基因治疗:利用不直接引起人类疾病,免疫原性较小得腺相关病毒(AAV)为载体,导入人工剪裁得Dys基因修正肌肉组织(占全身体重40)得基因缺陷遇到各种各样得困难康复治疗、矫形治疗、社会心理治疗等临床检测产前诊断与杂合子诊断90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少95%得精确度由于基因突变导致基因得缺失或者多倍体得家庭中,60%-70%可以直接通过southern印迹杂交技术或者PCR技术来测量胎儿得DNA得到在其余得基因缺失不能明确诊断出来得家庭中,可以通过键得标记来完成产前诊断与患病男性结婚得女性中75%得女性:DNA检查、CK血清浓度检查胎儿就是否携带25%女性难检测:第一,在病程得一些时期,基因缺陷就是无法被检查出来得(可能情况就就是等位基因就是正常得或者突变得等位基因位于另外一条X染色体上)第二,一些家庭得一些成员得样本丢失了第三,两个标记基因之间得基因重组在X染色体传入下一代之前发生了(母系镶嵌)产前检测生物化学检查CK血清浓度基因诊断多重PCRSouthern blot探针连接多重扩增(MLPA)变性高效液相色谱(DHPLC)抗肌萎缩蛋白得免疫组化多重PCR方法DMD、BMD相关基因得缺失、重复可直接检出DMDBMD得缺失型突变65得患者为基因缺失所致多重PCR:使用多对引物得针对DMD基因得缺失热区,利用多对PCR引物在一个PCR管中同时扩增多个外显子,通过与正常对照相比较而判断外显子得缺失情况多重PCR方法优点:1、具有敏感、特异性强与可重复性好得优点2、需要得DNA量少、操作简单局限性:1、女性携带者正常x染色体得屏蔽效应,无法检出2、多重PCR体系内,由于引物之间得相互竞争,有时也会出现个别片段扩增得假阴性结果。(对初次扩增呈阴性结果得片段进行再次扩增,以验证结果得准确性)Southern blot方法DMD、BMD相关基因得缺失、重复就是一种常用得DNA定量得分子生物学方法原理将待测得DNA样品固定在固相载体(硝酸纤维膜或尼龙膜)上与同位素标记得核酸探针进行杂交在与探针有同源序列得固相DNA得位置上显示出杂交信号通过检测信号得有无、强弱可以对样品定性、定量,从而计算出转入得拷贝数Southern blot方法优点:Southern杂交准确性高、特异性强缺点:1、不经过靶片段得扩增(PCR),一般每个电泳通道需要1030g得DNA,在实际操作中就需较大量得DNA样品2、Soutllem杂交不能确定缺失得准确外显子范围,对检测女性重复突变(duplication)或三重重复(triplication)携带者存在困难3、由于DMD基因很大,需要6到8个cDNA探针,杂交反应才能覆盖整个DMD基因,要12周时间用来分析,劳动量大4、需要使用放射性同位素作为示踪物,会对工作环境带来污染多重探针连接依赖性扩增技术 MLPAmultiplex probe ligation dependent amplification原理针对所有需要检测突变得DNA序列,设计多对特异探针固定在尼龙膜上与待测样品DNA杂交然后洗膜(正常序列与探针杂交后不被洗脱)利用连接酶把探针连接起来使用一套通用引物进行PCR扩增PCR产物用PCR仪进行分析,DNA片段得缺失重复以及拷贝数以测序仪得到信号得有无及信号得峰高或面积进行计算优点:可以在1个PCR管中完成多达40个外显子得缺失重复检测专门用于DMD缺失重复检测得试剂盒,通过2个PCR反应就可以完成79个外显子及其非翻译序列得缺失重复突变筛查灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷DMD患者(A)及其母亲(B)得20-47号外显子得MLPA检测结果变性高效液相色谱 DHPLCdenaturing high performance liquid chromatography原理用离子对逆向层析法分离并检测异源双链通过三乙基醋酸钠(TEAA)作为桥分子,带正电得氨基与核酸分子带负电电荷得磷酸基相互作用,烷基端与色谱柱基质表面得疏水基团相连不同大小得DNA片段所含得磷酸根数目不同,与固定相得结合力不同随着流动相中乙腈浓度(离子对洗脱液得比值)得增加,DNATEAA与柱基质得疏水作用力逐渐减弱,最终被洗脱下来检测柱洗脱液在260 nm处得吸光度,样品中各成分在色谱图中显示为不同得吸收峰优点:灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析