免疫实验结果分析.ppt

免疫组化结果的分析和免疫组化结果的分析和判断判断第一节第一节 免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则 免疫组化结果的判断原则概括起来有免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：以下几点：必必须须同同时时设设对对照照染染色色。没没有有对对照照染染色的免疫组化染色结果是不可信的。色的免疫组化染色结果是不可信的。抗抗原原表表达达必必须须在在特特定定部部位位。如如LCALCA应应定位在细胞膜上；定位在细胞膜上；CKCK应定位在细胞浆内；应定位在细胞浆内；PCNAPCNA及及p53p53蛋蛋白白应应定定位位在在细细胞胞核核内内；EMAEMA应应定定位位在在细细胞胞膜膜上上，等等等等。不不在在抗抗原原所所在在部部位的阳性着色，一概不能视为阳性。位的阳性着色，一概不能视为阳性。阴阴性性结结果果不不能能视视为为抗抗原原不不表表达达。由由于于检检测测方方法法灵灵敏敏度度有有高高低低之之分分，有有时时可可因因染染色色方方法法灵灵敏敏度度不不够够，而而导导致致阴阴性性反反应应，判断时应注意。判断时应注意。尽尽量量避避开开出出血血、坏坏死死及及切切片片刀刀痕痕和和界界面面边边缘缘细细胞胞的的阳阳性性表表达达，特特别别是是酶酶免免疫疫标标记记。因因为为这这类类阳阳性性着着色色多多系系内内源源干扰，或系人为因素所致。干扰，或系人为因素所致。对对免免疫疫组组化化标标记记结结果果的的意意义义不不能能绝绝对对化化，应应结结合合临临床床资资料料、X X线线等等影影像像学学及实验结果综合分析。及实验结果综合分析。*第二节第二节 对照染色设计对照染色设计 (一）对照染色的目的一）对照染色的目的 设设对对照照的的目目的的是是为为了了排排除除假假阴阴性性和和假假阳阳性性。假假阴阴性性的的原原因因主主要要有有三三：组组织织处处理理不不当当，抗抗原原丢丢失失过过多多或或被被遮遮蔽蔽；抗抗体体失失活活、效效价价过过低低或或稀稀释释度度不不合合适适（主主要要指指一一抗抗，即即特特异异性性抗抗体体）；染染色色步步骤骤遗遗漏漏及及差差错错，或或显显色色剂剂的的选选择择、缓缓冲冲液液的的pHpH和离子强度不当等。和离子强度不当等。假阳性均系由多种因素造成的非特异假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：着色所致，原因主要有：自发荧光或内自发荧光或内源酶等干扰；源酶等干扰；抗体试剂不纯抗体试剂不纯(特别是一特别是一抗）；抗）；操作失误，如污染、切片干枯或操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；显色剂操作不当等；Fc受体的干扰，等受体的干扰，等等。等。（二）对照的种类及其选用目的（二）对照的种类及其选用目的 对对照照染染色色大大致致可可分分为为：阳阳性性组组织织对对照照、阴阴性性组组织织对对照照及及阴阴性性试试剂剂对对照照和和自身对照自身对照四大类四大类：阳阳性性组组织织对对照照 指指用用已已证证实实含含有有靶靶抗抗原原的的同同源源及及不不同同源源组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片与与待待检检实实验验切切片片同同时时作作同同样样处处理理和和免免疫疫染染色色的的组组织织对对照照。正正确确的的结结果果应应呈呈现现阳阳性性，目目的的是是为为了了证证实实所所用用免免疫疫组组化化染染色色流流程程的有效性，排除假阴性的可能。的有效性，排除假阴性的可能。阴阴性性组组织织对对照照 指指用用已已证证实实不不含含靶靶抗抗原原的的同同步步处处理理和和免免疫疫标标记记染染色色的的组组织织对对照照。正正确确的的结结果果应应为为阴阴性，目的是除外假阳性。性，目的是除外假阳性。阴阴性性试试剂剂对对照照 是是指指用用于于证证实实在在免免疫疫组组化化染染色色中中所所用用试试剂剂，尤尤其其是是特特异异性性抗抗体体试试剂剂的的有有效效性性和和可可靠靠性性而而所所设设立立的的同同步步免免疫疫染染色色对对照照，包包括括有有：空空白白对对照照；替替代代对对照照；吸吸收收试试验验和和抑抑制制试试验验等等。目目的的在在于于除除外外假假阳阳性性和和证证实实所所用用免免疫疫组组化化试试剂剂及及其其技技术术方方法法的的有有效效性性和和待待检检实实验验切片免疫标记阳性结果的可靠性。切片免疫标记阳性结果的可靠性。空空白白对对照照 指指以以缓缓冲冲液液（PBS、TBS等等）取取代代第第一一抗抗体体（主主要要的的，必必要要时时还还可可做做第第二二抗抗体体及及桥桥联联抗抗体体的的空空白白取取代代），其其他他各各步步不不变变的的试试剂剂对对照照染染色色，结结果果应应为阴性。为阴性。取取代代对对照照 指指以以所所用用方方法法第第一一抗抗体体同同源源动动物物的的正正常常血血清清，或或与与本本实实验验无无关关的的抗抗体体(靶靶生生物物缺缺如如的的)取取代代第第一一抗抗体体，其其他他步步骤骤不不变变的试剂对照染色，结果应为阴性。的试剂对照染色，结果应为阴性。吸吸收收试试验验 是是指指用用事事先先经经过过量量抗抗原原吸吸收收的的第第一一抗抗体体上上清清液液取取代代第第一一抗抗体体，其其他他步步骤骤不不变变的的免免疫疫染染色色试试剂剂对对照照。结结果果应应是是阴阴性性或或阳阳性着色明显减弱（吸收不全时）。性着色明显减弱（吸收不全时）。抑抑制制试试验验 是是指指用用标标记记抗抗体体和和未未标标记记抗抗体体（可可以以是是一一抗抗，也也可可以以是是二二抗抗或或桥桥抗抗体体）两两者者的的混混合合物物作作试试剂剂，其其他他步步骤骤不不变变的的免免疫疫组组化化染染色色试试剂剂对对照照，结结果果其其阳阳性性着着色色应应成成比比例例的的减减弱弱（等等量量或或1：9）。此试剂对照多用于直接法。此试剂对照多用于直接法。这这类类阴阴性性试试剂剂对对照照的的选选用用原原则则是是：空空白白对对照照不不能能省省，其其他他对对照照在在预预实实验验中中应应尽尽量量多多做做，尤尤其其是是应应用用新新抗抗体体试试剂剂；对对照照必必需需与与实实验验片片同同步步进进行行染染色色；对照的结果应附合要求。对照的结果应附合要求。自自身身对对照照 是是指指在在同同一一标标记记切切片片上上的的自自身身组组织织成成分分的的阴阴性性背背景景对对照照。即即与与靶靶抗抗原原阳阳性性反反应应细细胞胞或或成成分分相相邻邻的的阴阴性性背背景景结结构构的的显显色色，结结果果应应为为阴阴性性或或着着色色较较浅浅，需需与与阳阳性性着着色色成成分分呈呈鲜鲜明明对对比比。目目的的在在于于排排除除内内源源性性干干扰扰产产生生的的假假阳阳性性和和因因抗抗原原弥弥散散移移位造成的错误结果。位造成的错误结果。*第三节第三节 非特异染色非特异染色 非特异染色非特异染色是指免疫组化染色过程是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：各个环节，可来自：内内源源性性干干扰扰(自自发发荧荧光光、内内源源酶酶、内内源源性生物素等性生物素等)；试试剂剂污污染染(质质量量差差，交交叉叉反反应应，Fc受受体体干扰等干扰等)；组组织织处处理理不不当当(组组织织固固定定不不及及时时或或固固定定不不良良所所导导致致的的抗抗原原弥弥散散移移位位、洗洗涤涤不不充充分所导致的游离试剂残留等分所导致的游离试剂残留等)。纠纠正正的的方方法法视视原原因因而而异异，可可在在预预实实验验基基础础上上，采采用用有有针针对对性性的的纠纠正正对对策策，即即对对症症下下药药(具具体体纠纠正正方方法法不不展展开开讲讲了了，同学们可以自己阅读讲义同学们可以自己阅读讲义p123-126)。*第四节第四节 阳性标记的形态特征和判断阳性标记的形态特征和判断 免免疫疫组组化化标标记记具具有有一一定定形形态态特特点点，若若能能熟熟练练掌掌握握则则有有助助于于对对免免疫疫组组化化标标记记结结果果的的正正确确判判断断。内内容容包包括括定定性性、定定位位和定量三方面。和定量三方面。免免疫疫显显色色强强度度和和阳阳性性细细胞胞密密度度是是定定性性定定量量指指标标，实实际际工工作作中中常常采采用用强强度度和和密密度度结结合合的的方方法法综综合合计计量量，与与抗抗原原含含量量有有关关；阳阳性性细细胞胞的的着着色色形形态态及及组组织织分分布布特点主要是定位指标，与功能有关。特点主要是定位指标，与功能有关。一一、阳阳性性标标记记免免疫疫特特征征：分分 弱弱(+)(+)、中中(+)(+)、强强(+)(+)三三级级。免免疫疫荧荧光光法法（FITC为为例例）则则表表现现为为浅浅绿绿色色荧荧光光、明明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；免免疫疫酶酶标标记记（HRP-DAB/H2O2）则则表表现现为为淡淡黄黄色色细细颗颗粒粒、棕棕黄黄色色颗颗粒粒和和褐褐黄黄色色粗粗颗颗粒粒，后后者者耀耀眼眼易易见见。图图像像摄摄影影，原则上多取强阳性区域。原则上多取强阳性区域。二二、阳阳 性性 标标 记记 细细 胞胞 学学 特特 征征（以以 HRP-DAB/H2O2为为例例）可可分分为为胞胞膜膜型型；胞胞核核型型；胞胞质质(浆浆)型型；微微绒绒毛毛型型和和复复合合型型（胞胞膜膜-胞胞质质兼兼有有，胞胞核核-胞胞质质兼兼有有，或或微微绒绒毛毛-胞胞质质兼兼有有）等等五五种种阳阳性性细细胞胞类类型型。这这与与抗抗原原所所在在部部位位相相关关联联，但但应应注注意意排排除除因因组组织织固固定定不不好好引引起起的的抗抗原原弥弥散散假假象象，尤尤其其是是复复合合型图像。型图像。三三、阳阳 性性 标标 记记 组组 织织 学学 特特 征征（以以 HRP-DAB/H2O2为为例例）免免疫疫组组化化染染色色阳阳性性细细胞胞在在组组织织中中的的分分布布排排列列形形式式可可以以有有如如下下7种种：局局灶灶型型；弥弥漫漫型型；片片块块型型；网网状状型型；腺腺管管型型；腔腔缘缘型型和和菊菊团团型型，等等。这这主主要要取取决决于于抗抗原原抗抗体体复复合合物物在在细细胞胞内内的的分分布布和和阳性细胞在组织内的群体分布特点。阳性细胞在组织内的群体分布特点。四四、阳阳性性标标记记强强度度特特征征 依依照照细细胞胞阳阳性性着着色色程程度度（抗抗原原含含量量），可可分分为为弱弱阳阳性性（+）1分分；中中等等阳阳性性（+）2分分；强强阳阳性性（+）3分分。依依照照阳阳性性细细胞胞数数量量，可可分分为为：弱弱阳阳性性（+，指指阳阳性性细细胞胞数数在在25%以下）以下）1分；分；中中等等阳阳性性（+,指指阳阳性性细细胞胞数数在在25%49%)2分分；强强阳阳性性（+，指指阳阳性性细细胞胞数数在在50%以以上上)3分分。目目前前多多采采用用积积分分综综合合计计量量。计计算算公公式式：两两者者相相乘乘（或或相相加加）。大大多多主主张张4者者为为阳阳性性，6者者为为强强阳阳性性，至至少少随随机机观观察察5-10个个HPF,取其均值取其均值。第五节第五节 染色失败的可能原因染色失败的可能原因 免免疫疫组组化化染染色色的的基基本本要要求求有有二二：实实验验切切片片的的阳阳性性抗抗原原定定位位准准确确，呈呈色色鲜鲜明明，背背景景着着色色浅浅或或无无，二二者者的的比比值值应应大大于于1（阳阳性性/背背景景）；对对照照染染色色的的结结果果应应附附合合要要求求。否否则则，所所得得实实验验结结果果都都是是错误的，或为假阳性或为假阴性。错误的，或为假阳性或为假阴性。假阳性是指实验切片呈阳性，阴性假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等有关。试剂不纯，交叉反应等有关。假假阴阴性性是是指指实实验验切切片片呈呈阴阴性性，阳阳性性组组织织对对照照及及阴阴性性试试剂剂对对照照也也均均呈呈阴阴性性的的结结果果，谓谓之之假假阴阴性性。其其原原因因与与组组织织处处理理不不当当，组组织织细细胞胞抗抗原原丢丢失失或或试试剂剂错错误误(如如漏漏加加、错错加、失效、变质等加、失效、变质等),操作失误等有关。操作失误等有关。对照结果判断：表中表中表中表中1 1 1 15 5 5 5结果无效，结果无效，结果无效，结果无效，6 6 6 6、7 7 7 7结果可靠结果可靠结果可靠结果可靠（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）检测标本含抗体，结果可靠检测标本含抗体，结果可靠检测标本含抗体，结果可靠检测标本含抗体，结果可靠（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）7 7 7 7检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）6 6 6 6非特异染色非特异染色非特异染色非特异染色（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）5 5 5 5阳性对照不含定位抗原阳性对照不含定位抗原阳性对照不含定位抗原阳性对照不含定位抗原（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）4 4 4 4阴性对照内含定位抗原阴性对照内含定位抗原阴性对照内含定位抗原阴性对照内含定位抗原()()()()()（）（）（）（）（）（）（）（）3 3 3 3非特异性染色非特异性染色非特异性染色非特异性染色（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）2 2 2 2抗体失活，操作有误抗体失活，操作有误抗体失活，操作有误抗体失活，操作有误（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）1 1 1 1结果判断结果判断结果判断结果判断检测结果检测结果检测结果检测结果替代对照替代对照替代对照替代对照阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照染色失败原因：均为阴性均为阴性均为弱阳性（除阴性对照）均为弱阳性（除阴性对照）背景染色过深背景染色过深阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照无背景，待检标本背景深阳性对照无背景，待检标本背景深判断原则：实验设计实验设计抗体选择抗体选择抗原定位性抗原定位性抗原分布不均一性抗原分布不均一性假阴性常见原因：抗原丢失或减弱抗原丢失或减弱 抗体失效或稀释度不当抗体失效或稀释度不当 操作失误操作失误假阳性常见原因：抗原弥散抗原弥散 抗原异位表达抗原异位表达 瘤细胞吞噬瘤细胞吞噬 病变中正常组织残留病变中正常组织残留 抗体交叉反应抗体交叉反应 内源性物质着色内源性物质着色 边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据，应用不作为判断依据，应用“正反法正反法”原则。原则。免疫组化标准化：抗原特异性抗原特异性抗体交叉反应和标记谱系抗体交叉反应和标记谱系方法规范化方法规范化结果综合分析和判断结果综合分析和判断