流式细胞术原理及应用.ppt
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1、流式细胞检测技术n n流式细胞检测技术的原理和方法n n流式细胞检测技术的应用n n流式细胞相关技术流式细胞检测技术的发展n n从本世纪初开始,科学家们就在不断探索细胞从本世纪初开始,科学家们就在不断探索细胞测量技术,测量技术,19681968年斯坦福大学的年斯坦福大学的BillBonnerBillBonner等等研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪(Fluorescence-activatedcellsorter,FACS)Fluorescence-activatedcellsorter,FACS)。19731973年年BDBD公司以公司以FACSFACS的商
2、品名称出品了第一的商品名称出品了第一台商业化的流式细胞仪台商业化的流式细胞仪(FlowFlowCytometerCytometer,FCM),FCM)。随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域,免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域,对各个学科的发展发挥着重要作用。对各个学科的发展发挥着重要作用。流式细胞术及其应用n n流式细胞术的原理和方法n n流式细胞
3、术在生物学和医学研究中的应用n n流式细胞相关技术流式细胞仪工作原理图流式细胞仪的工作原理n n流式细胞仪包括液流系统、光学系统、分选系流式细胞仪包括液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统。待测样本中的细胞或其它统和数据处理系统。待测样本中的细胞或其它生物学颗粒性物质经液流系统单个地流过流式生物学颗粒性物质经液流系统单个地流过流式细胞仪中激光照射的区域,细胞受激光的激发细胞仪中激光照射的区域,细胞受激光的激发产生信号,被仪器中的信号接收器接受并放大,产生信号,被仪器中的信号接收器接受并放大,这些放大了的信号经计算机分析处理,并以图这些放大了的信号经计算机分析处理,并以图表的形式直观地显示出
4、来;通过分选系统还可表的形式直观地显示出来;通过分选系统还可以将某些类型的细胞群体筛选出来。以将某些类型的细胞群体筛选出来。信号分析n n流式细胞仪产生并分析的信号主要有光散射信号和荧光信号。光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。依荧光素的不同,用不同波长的光激发,发射出不同波长的荧光,可显示不同的颜色,在不同的实验体系中,这些荧光信号就可以反映不同的细胞生物学特性荧光信号分析n n如用荧光染料如用荧光染料(FITCFITC或或PEPE等等)标记的单克隆标记的单克隆抗体抗体 特异性地与细胞表面的抗原、受体或膜糖特异性地与细胞表面的抗原、受体或膜糖蛋白结合,在激光的激发之
5、下,发出一定波长蛋白结合,在激光的激发之下,发出一定波长的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体或糖蛋白的相对数量,对荧光信号进行收集分或糖蛋白的相对数量,对荧光信号进行收集分析,就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。析,就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。用用DNADNA染料对染料对DNADNA进行染色,染料通过一定方进行染色,染料通过一定方式与式与DNADNA链结合,在激光的激发下,染料发出链结合,在激光的激发下,染料发出荧光,测定荧光的强度,就可得出相对荧光,测定荧光的强度,就可得出相对DNADNA的的含量,进而可对细胞周期时相进行分析。用特含量,进
6、而可对细胞周期时相进行分析。用特定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内pHpH值以及细胞膜电位等进行测定。值以及细胞膜电位等进行测定。FCM在细胞生物学中的应用n n11细胞周期分析细胞周期分析 在细胞周期内,在细胞周期内,DNADNA含量随时相发生周期性含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNADNA含量含量测定,可分析细胞周期各时相的百分比,周期动测定,可分析细胞周期各时相的百分比,周期动力学参数以及力学参数以及DNADNA异倍体。异倍体。DNADNA和和RNARNA特异性特异性染料有染料有PIP
7、I、EBMIEBMI、CA3CA3、HO.33258HO.33258、HO.33342HO.33342、DAPIDAPI、7-AAD7-AAD、AOAO和和PYPY等。通过抗溴脱氧脲嘧等。通过抗溴脱氧脲嘧啶核苷啶核苷(BrdUrdBrdUrd)的单克隆抗体也可对的单克隆抗体也可对DNADNA进行染进行染色。色。2细胞内钙离子浓度测定荧光染料(如Quin-2、Indo-1、Fura-2、Fluo-3和Rhod-2等)通过乙酰甲酯(AE)导入细胞后,与钙离子特异性结合。染料的激活或发射特性与钙离子浓度有关,故可用比例法测得或直接测得的荧光强度得到钙离子浓度的相对值,实际浓度需经校对后获得3细胞内p
8、H值测定荧光染料(BCECF、COFDA、DCH和SNARF等)激发光谱或发射光谱是pH值依赖的。在生理pH值范围内,比例荧光与pH值有很好的线性关系,故可用比例荧光测pH值,实际pH值经校正后获得。FCM在肿瘤学中的应用1肿瘤诊断DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志,细胞的增殖能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此,临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析,辅助肿瘤诊断,包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。2肿瘤预后估计n n通常,异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移通常,异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道
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