生物化学与分子生物学-第三章-酶.ppt

Wang-KaiFang,PhDWang-KaiFang,PhD（方王楷）（方王楷）（方王楷）（方王楷）DepartmentofbiochemistryDepartmentofbiochemistryandMolecularBiologyandMolecularBiologyShantouUniversityMedicalCollegeShantouUniversityMedicalCollege章酶Enzyme2021/5/271磨粉 去糠 打碎 酶的应用比酶的研究具有更长的历史成酒 发酵 装瓶麦芽 萌发 浸润酶参与细胞内所有的代谢途径2021/5/272v生物化学是在解决Liebig和Pasteur关于发酵本质的著名论中产生的。巴斯德（Pasteur）李比希（Leibig）“活力论”2021/5/2731897年，比希纳（Buchner)发现磨碎的酵母细菌或无细胞酵母抽提液也能和酵母细菌一样，将糖转变成酒精和二氧化碳，这样才把争论统一起来。当时认为引起发酵的是酵母细胞中一种叫酵素的物质，现在称为酶酶（Enzyme)。酶的发现酶的发现The Nobel Prizein Chemistry 19072021/5/274Sumner 对酶的发现有重大贡献温温度度时间时间进行酶进行酶反应的试管反应的试管SumnerUrease crystal(1926)Discovering Enzyme(1991)p.822021/5/275v1982年，Thomas Cech从四膜虫rRNA前体的加工研究中首先发现rRNA前体本身具有自我催化作用，提出核酶(ribozyme)的概念。v1983年S.Altman等研究RNaseP（20%蛋 白 质 和80%RNA），发现RNaseP中的RNA可催化E.coli tRNA的前体加工v1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片 段，称 为 脱 氧 核 酶(deoxyribozyme)。Thomas Cech University of Colorado,USA Sidney Altman Yale University,USA 2021/5/276酶的概念酶的概念v酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸。定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸。v酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。的生物催化剂。2021/5/277丙糖磷酸异构酶丙糖磷酸异构酶（TIM）三维结构的飘带图和半透明的蛋白表面图显示。丙糖磷酸异构酶是典型的TIM桶折叠桶折叠，图中用不同颜色来表示该酶中所含有的两个TIM桶折叠结构域。2021/5/278第一节第一节酶的分子结构与功能酶的分子结构与功能The Molecular Structure and Function of Enzyme 2021/5/279酶的分类：酶的分类：v单体酶单体酶(monomeric enzyme)(monomeric enzyme)：由由单条肽链单条肽链构成构成,仅具有三级结构的酶。仅具有三级结构的酶。v寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由由多个相同或不同亚基多个相同或不同亚基以非共价键连接组以非共价键连接组成的酶。成的酶。蛋白激酶A、磷酸果糖激酶-1 4个亚基溶溶菌菌酶酶（英文名称：Lysozyme）是一个分子量为14.4kDa的酶，它通过催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙乙酰酰氨氨基基葡葡萄萄糖糖残基间和壳壳糊糊精精中N-乙酰葡糖胺残基间的1,4-链的水解，而破坏细菌的细胞壁。2021/5/2710 (multienzyme system)(multienzyme system)：由由几种不同功能的几种不同功能的酶酶彼此聚合形成的多酶复彼此聚合形成的多酶复合物。合物。v多酶体系多酶体系丙丙酮酮酸酸脱脱氢氢酶酶复复合合体体（Pyruvate dehydrogenase complex；PDH complex）是生物体内催化丙酮酸转变成乙乙醘醘辅辅酶酶A之反应的三种酶及五种辅辅酶酶的组合。2021/5/2711v一些一些多酶体系多酶体系在进化过程中在进化过程中由于由于基因的融合基因的融合，多种不同催，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。这类酶称为多功能酶。v由由单肽链单肽链构成的，含有构成的，含有若干若干个酶活性个酶活性的结构域的结构域v多功能酶或串联酶多功能酶或串联酶(multifunctional or tandem enzyme)(multifunctional or tandem enzyme)：脂脂肪肪酸酸合合酶酶（Fatty acid synthase）是一个具有多种功能的酶系统，在哺乳动物中，其分子量高达272kDa。在脂肪酸合酶中，底物和中间产物分子在各个功能结构域（可以位于同一酶分子，也可以位于不同酶分子）中传递直到完成脂肪酸的整个合成过程。2021/5/2712一、一、酶的分子组成酶的分子组成蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)(apoenzyme)辅助因子辅助因子(cofactor)(cofactor)金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)(holoenzyme)单纯酶单纯酶 (simple enzyme)(simple enzyme)结合酶结合酶 (conjugated enzyme)(conjugated enzyme)2021/5/2713*各部分在催化反应中的作用各部分在催化反应中的作用J酶蛋白酶蛋白决定反应的决定反应的特异性特异性J辅助因子辅助因子决定反应的决定反应的种类与性质种类与性质金属酶金属酶(metalloenzyme)(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。失。金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme)(metal-activated enzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。不甚紧密。【羧基肽酶、黄嘌呤氧化酶】【己糖激酶、肌酸激酶】2021/5/2714某些金属酶和金属激活酶某些金属酶和金属激活酶 金属酶金属酶金属离子金属离子 金属激活酶金属激活酶金属离子金属离子 过氧化氢酶过氧化氢酶Fe2+丙酮酸激酶丙酮酸激酶K+、Mg2+过氧化物酶过氧化物酶Fe2+丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶Mn2+、Zn2+谷胱甘肽过氧化谷胱甘肽过氧化物酶物酶Se2+蛋白激酶蛋白激酶Mg2+、Mn2+固氮酶固氮酶Mo2+己糖激酶己糖激酶Mg2+核糖核苷酸还原核糖核苷酸还原酶酶Mn2+磷脂酶磷脂酶CCa2+羧基肽酶羧基肽酶Zn2+细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶Cu2+碳酸酐酶碳酸酐酶Zn2+脲酶脲酶Ni2+碱性磷酸酶碱性磷酸酶Mg2+柠檬酸合酶柠檬酸合酶K+2021/5/2715金属离子的作用金属离子的作用稳定酶的构象；稳定酶的构象；参与催化反应，传递电子；参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用，传递电子、在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。质子或其它基团。2021/5/2716小分子有机化合物在催化中的作用小分子有机化合物在催化中的作用 2021/5/2717NADH NADH 可耦合氧化及还原反应可耦合氧化及还原反应可耦合氧化及还原反应可耦合氧化及还原反应2021/5/2718辅助因子分类辅助因子分类（按其（按其与酶蛋白结合的紧密程度与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶辅酶 (coenzyme):(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤的透析或超滤的方法除去。方法除去。辅基辅基 (prosthetic group):(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，紧密，不不能用能用透析或超透析或超滤的方法除去滤的方法除去。2021/5/2719辅酶的作用辅酶的作用1 1参与基团的转移参与基团的转移参与基团的转移参与基团的转移:l 氨基氨基-磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛(Vit B6)(Vit B6)l 羧基羧基-生物素生物素(biotin)(biotin)、维生素、维生素K Kl 一碳单位一碳单位-四氢叶酸四氢叶酸(folic acid)(folic acid)l 甲基甲基-维生素维生素B B1212l 酰基酰基-辅酶辅酶A A、硫辛酸、硫辛酸2021/5/2720辅酶的作用辅酶的作用 2质子（氢原子质子（氢原子）转移）转移:l FAD+FADH2l NAD+NADH+H+l NADP+NADPH+H+NAD+是脱氢酶的辅酶，如乙乙醇醇脱脱氢氢酶酶（ADH），用于氧化乙醇。它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环及呼呼吸吸链链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH+H+。而NADH+H+则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。2021/5/2721或称或称活性部位活性部位(active site)(active site)，指，指必需必需基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的特定空间结构的区域区域，能，能与底物特异结合与底物特异结合并并将底物转化为产将底物转化为产物物。酶的活性中心酶的活性中心(active center)(active center)二、酶的活性中心二、酶的活性中心2021/5/2722酶酶的的活活性性中中心心2021/5/2723必需基团必需基团(essential group)(essential group)酶分子中氨基酸残基侧链的酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。密切相关的化学基团。有些必需基团虽然在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，这一区域称为酶的活性中心(active center)，对于结合酶来说，辅酶或辅基上的一部分结构往往是活性中心的组成成分。2021/5/2724活性中心内的必需基团活性中心内的必需基团结合基团结合基团(binding group)与底物相结合与底物相结合与底物相结合与底物相结合催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。的空间构象所必需。活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团2021/5/2725底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 酶的活性中心常位于酶蛋白分子表面，为含有较多疏水酶的活性中心常位于酶蛋白分子表面，为含有较多疏水氨基酸残基，形成氨基酸残基，形成疏水性疏水性“裂缝裂缝”或或“口袋口袋”，形成了，形成了利于酶促反应发生的疏水环境利于酶促反应发生的疏水环境2021/5/2726n溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心溶溶菌菌酶酶的的活活性性中中心心是是一一裂裂隙隙，可可以以容容纳纳肽肽多多糖糖的的6个个单单糖糖基基（A，B，C，D，E，F），并并与与之之形形成成氢氢键和键和van derwaals力。力。催催化化基基团团是是35位位Glu，52位位Asp；101位位Asp和和108位位Trp是结合基团。是结合基团。2021/5/2727三、同工酶催化相同的化学反应三、同工酶催化相同的化学反应 同同工工酶酶(isoenzyme)是是指指催催化化相相同同的的化化学学反反应应，但但酶酶蛋蛋白白的的分分子子结结构构、理理化化性性质质乃至免疫学性质不同的一组酶。乃至免疫学性质不同的一组酶。n定义定义大大多多数数同同工工酶酶由由于于对对底底物物亲亲和和力力不不同同和和受受不不同同因因素素的的调调节节，常常表表现现不不同同的的生生理理功功能能，例例如如动动物物肝肝脏脏的的碱碱性性磷磷酸酸酯酯酶酶和和肝肝脏脏的的排排泄泄功功能能有有关关，而而肠肠粘粘膜膜的的碱碱性性磷磷酸酸酯酯酶酶却却参参与与脂脂肪肪和和钙钙、磷磷的的吸吸收收。对对LDH催催化化的的可可逆逆反反应应，心心肌肌中中富富含含的的LDH1及及LDH2在在体体内内倾倾向向于于催催化化乳乳酸酸的的脱脱氢氢，而而骨骨骼骼肌肌中中丰丰富富的的LDH4及及LDH5则则有有利利于于丙丙酮酮酸酸还还原原而而生生成成乳乳酸酸。所所以以同同工工酶酶只只是是做做相相同同的的“工工作作”（即即催催化化同同一一个个反反应应），却却不不一一定定有有相相同同的的功功能能。2021/5/2728根据国际生化学会的建议，同工酶是由不同基因编码的根据国际生化学会的建议，同工酶是由不同基因编码的多肽链，或由同一基因转录生成的不同多肽链，或由同一基因转录生成的不同mRNAmRNA所翻译的所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。不同多肽链组成的蛋白质。同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它使不同的组织、器官和不同胞的不同亚细胞结构中，它使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征。这为同工酶用来诊的亚细胞结构具有不同的代谢特征。这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。断不同器官的疾病提供了理论依据。2021/5/2729HHHHHHH MHHMMHMMMMMMMLDH1 (H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5 (M4)乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶的同工酶n举例举例 1几乎存在于所有组织中。同功酶有五种形式，即LDH1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用电泳方法将其分离。LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。M:骨骼肌型；H:心肌型2021/5/2730LDH同工酶同工酶红细胞红细胞白细胞白细胞血清血清骨骼肌骨骼肌心肌心肌肺肺肾肾肝肝脾脾LDH1（H4）431227.10731443210LDH2（H3M）444934.70243444425LDH3（H2M2）123320.95335121110LDH4（HM3）1611.7160512720LDH5（M4）005.7790120565人体各组织器官人体各组织器官LDHLDH同工酶谱（同工酶谱（活性活性%）2021/5/2731检测血清中同工酶的变化有重要的临床意义检测血清中同工酶的变化有重要的临床意义 心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱急性肝炎酶谱急性肝炎酶谱2 23 34 45 5脏器特异性2021/5/2732n举例举例 2B BB BB BMMMM MM CK1(BB)CK2(MB)CK3(MM)脑脑 心肌心肌 骨骼肌骨骼肌肌酸激酶肌酸激酶(creatine kinase,CK)同工酶同工酶CK2常作为临床早期诊断心肌梗死的一项生化指标常作为临床早期诊断心肌梗死的一项生化指标 M:肌型；B:脑型肌酸激酶（CK），能可逆地催化肌酸和三磷酸腺苷生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷的反应。在pH中性条件下，逆反应为正反应的26倍，即以ATP生成为主，以保证组织细胞的供能。而正向反应利于线粒体内氧化磷酸化生成的ATP，以磷酸肌酸的形式进入细胞液，满足细胞生理活动之需要。2021/5/2733第二节第二节酶促反应的特点与机理酶促反应的特点与机理The Characteristic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction 2021/5/2734反应总能量改变反应总能量改变 非催化反应活化能非催化反应活化能 酶促反应酶促反应 活化能活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的活化能化反应的活化能 能能量量反反 应应 过过 程程 底物底物 产物产物 酶促反应活化能的改变酶促反应活化能的改变 活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。酶酶可降低所催化反应的活化能可降低所催化反应的活化能2021/5/2735 催化效率高，用量少（细胞中含量低)。加快反应速度但不改变化学反应平衡点（不改变平衡常数）。降低反应活化能。活化能：在一定的温度下，1mol分子全部进入其活化态所需要的自由能。反应前后自身结构不变。酶与非生物催化剂的共性酶与非生物催化剂的共性2021/5/2736（一）酶促反应具有高效性（一）酶促反应具有高效性 一、一、酶促反应的特点酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。2021/5/27371双氧水裂解FeCl3Catalase反应速率1,000,000,0001,0002 H2O2 2 H2O+O2PESJuang RH(2004)BCbasics2021/5/2738底物底物催化催化剂剂反反应应温度温度（）速率常数速率常数苯苯酰酰胺胺H+522.410-6OH-538.510-6-胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶酶2514.9尿素尿素H+627.410-7脲脲酶酶215.0106H2O2Fe2+5622某些酶与一般催化剂催化效率的比较某些酶与一般催化剂催化效率的比较 2021/5/2739分类：分类：v绝对特异性绝对特异性(absolute specificity)(absolute specificity)：只能只能作用于作用于特定结构的底物特定结构的底物，进行一种专一的反，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物应，生成一种特定结构的产物。v相对特异性相对特异性(relative specificity)(relative specificity)：作用作用于于一类化合物或一种化学键一类化合物或一种化学键。v立体结构特异性立体结构特异性(stereo specificity)stereo specificity)：作作用于用于立体异构体立体异构体中的一种。中的一种。旋光异构特异性旋光异构特异性几何异构特异性几何异构特异性2021/5/2741vv旋光异构特异性：旋光异构特异性：L-L-乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 L-L-乳酸乳酸 D-D-乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 D-D-乳酸乳酸2021/5/2742 酵母中的酶酵母中的酶酵母中的酶酵母中的酶vvD-型葡萄糖型葡萄糖 发酵发酵vv 酵母中的酶酵母中的酶酵母中的酶酵母中的酶vvL-型葡萄糖型葡萄糖 发酵发酵vv L-L-精氨酸酶精氨酸酶精氨酸酶精氨酸酶vvL-精氨酸精氨酸 L-鸟氨酸鸟氨酸+尿素尿素vvD-精氨酸精氨酸 2021/5/2743立体异构特异性立体异构特异性vv几何异构特异性几何异构特异性 延胡索酸酶延胡索酸酶 反丁烯二酸反丁烯二酸 苹果酸苹果酸 延胡索酸酶延胡索酸酶 顺丁烯二酸顺丁烯二酸 2021/5/2744（三）酶促反应的可调节性（三）酶促反应的可调节性对酶生成与降解量的调节对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等通过改变底物浓度对酶进行调节等酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。括三方面的调节。2021/5/2745（四）酶具有不稳定性（四）酶具有不稳定性酶的化学本质主要是蛋白质。在某些理化酶的化学本质主要是蛋白质。在某些理化因素（如高温、强酸、强碱等）的作用下，酶因素（如高温、强酸、强碱等）的作用下，酶会发生变性而失去催化活性。因此，酶促反应会发生变性而失去催化活性。因此，酶促反应往往都是在常温、常压和接近中性的条件下进往往都是在常温、常压和接近中性的条件下进行的。行的。2021/5/2746二、酶促反应的机理二、酶促反应的机理（一）酶（一）酶-底物复合物的形成与诱导契合假说底物复合物的形成与诱导契合假说*诱导契合假说诱导契合假说(induced-fit hypothesis)(induced-fit hypothesis)酶底物复合物酶底物复合物 E+S E+P ESES 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶程称为酶-底物结合的诱导契合假说底物结合的诱导契合假说 。酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率诱导契合作用使酶与底物密切结合诱导契合作用使酶与底物密切结合2021/5/27472021/5/2748羧羧肽肽酶酶的的诱诱导导契契合合模模式式 底物底物2021/5/2749酶与底物结合 抗体与抗原结合 酶可以催化底物转化成产物，而抗体则不具备此功能酶可以催化底物转化成产物，而抗体则不具备此功能2021/5/2750（三）与酶的高效率催化有关的机制：（三）与酶的高效率催化有关的机制：1.1.邻近效应与定向排列邻近效应与定向排列 2.2.多元催化多元催化：酸碱催化酸碱催化 3.3.表面效应表面效应：防止底物与酶之间形成水化膜：防止底物与酶之间形成水化膜 2021/5/27511.1.趋近效应和定向效应趋近效应和定向效应a 底物在活性中心聚集，局部微环境浓度底物在活性中心聚集，局部微环境浓度 a 催化基团定向催化反应催化基团定向催化反应将分子间的反应变成类似于分子内的反应，从而提高反应速率将分子间的反应变成类似于分子内的反应，从而提高反应速率2021/5/2752l 接受质子：接受质子：碱碱l 提供质子：提供质子：酸酸2.2.多元催化（多元催化（multielement catalysismultielement catalysis）1）亲核催化作用）亲核催化作用(nucleophilic catalysis)2）亲电催化（）亲电催化（electrophilic catalysis）1.酸酸-碱催化作用（碱催化作用（general acid-base catalysis）2.亲核催化和亲电子催化作用亲核催化和亲电子催化作用 酶活性中心的某些基团可作为质子的供体酶活性中心的某些基团可作为质子的供体或受体，从而对底物进行酸碱催化或受体，从而对底物进行酸碱催化酶活性中心亲核基团释出的电子攻击过渡态底物上具有部分正电性的原酶活性中心亲核基团释出的电子攻击过渡态底物上具有部分正电性的原子或基团，形成瞬间共价键；随后，底物进一步水解形成产物和酶。子或基团，形成瞬间共价键；随后，底物进一步水解形成产物和酶。酶活性中心内的亲电子基团与富含电子的底物形成共价键。酶活性中心内的亲电子基团与富含电子的底物形成共价键。2021/5/2753胰凝乳蛋白酶的共价催化和酸胰凝乳蛋白酶的共价催化和酸-碱催化机制碱催化机制 2021/5/2754l 酶活性中心酶活性中心疏水性疏水性“口袋口袋”l 防止底物与酶之间形成水化膜防止底物与酶之间形成水化膜l 有利底物与酶密切接触有利底物与酶密切接触3.3.表面效应表面效应 (surface effect)(surface effect)2021/5/2755第三节第三节 酶促反应动力学酶促反应动力学Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 2021/5/2756q概念概念研究各种因素对研究各种因素对酶促反应速度酶促反应速度的影响，并的影响，并加以定量的阐述。加以定量的阐述。q影响因素包括有影响因素包括有酶浓度、底物浓度、酶浓度、底物浓度、pHpH、温度、温度、抑制剂、激活剂等。抑制剂、激活剂等。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。2021/5/2757一、底物浓度对反应速度的影响一、底物浓度对反应速度的影响I.I.单底物、单产物反应单底物、单产物反应II.II.酶酶促促反反应应速速度度一一般般在在规规定定的的反反应应条条件件下下，用用单单位位时间时间内内底物的消耗量底物的消耗量和和产物的生成量产物的生成量来表示来表示III.III.反反应应速速度度取取其其初初速速度度，即即底底物物的的消消耗耗量量很很小小（一一般在般在55以内）时的反应速度以内）时的反应速度IV.IV.底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度研究前提研究前提E+SE+S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE+PE+P2021/5/2758v 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈应速度的影响呈矩形双曲线关系矩形双曲线关系。2021/5/2759当底物浓度较低时：当底物浓度较低时：反应速率与底物浓度成正比；反应为反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。一级反应。SSV VV Vmaxmax2021/5/2760随着底物浓度的增高：随着底物浓度的增高：反应速率不再成正比例加速；反应为反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。混合级反应。SSV VV Vmaxmax2021/5/2761当底物浓度高达一定程度：当底物浓度高达一定程度：反应速率不再增加，达最大速率；反反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应应为零级反应SSV VV Vmaxmax酶酶 被被 底底 物物 饱饱 和和2021/5/2762底物对酶促反应的饱和现象：底物对酶促反应的饱和现象：2021/5/2763（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式中间产物中间产物 酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+SE+S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE+PE+P揭示单底物反应的动力学特性揭示单底物反应的动力学特性揭示单底物反应的动力学特性揭示单底物反应的动力学特性1913年2021/5/27641913191319131913年年年年MichaelisMichaelisMichaelisMichaelis和和和和MentenMentenMentenMenten提提提提出出出出反反反反应应应应速速速速度度度度与与与与底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度关关关关系系系系的的的的数数数数学学学学方方方方程程程程式式式式，即即即即米米米米曼曼曼曼氏氏氏氏方方方方程程程程式，简称式，简称式，简称式，简称米氏方程式米氏方程式米氏方程式米氏方程式(Michaelis equation)(Michaelis equation)(Michaelis equation)(Michaelis equation)。SS：底物浓度底物浓度V V：不同不同SS时的反应速度时的反应速度VmaxVmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)(maximum velocity)m m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)(Michaelis constant)V VmaxmaxS S K Km m+S +S 2021/5/27651.E与与S形形成成ES复复合合物物的的反反应应是是快快速速平平衡衡反反应应，而而ES分分解解为为E及及P的的反反应应为为慢慢反反应应，反反应应速速率率取决于慢反应即取决于慢反应即 V=k3ES。(1)2.S的的总总浓浓度度远远远远大大于于E的的总总浓浓度度，因因此此在在反反应应的初始阶段，的初始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即S=St。米曼氏方程式推导基于两个假设：米曼氏方程式推导基于两个假设：当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即Et=ES，反应达最大反应达最大速率速率 Vmax=k3ES=k3Et (5)2021/5/2766n米曼氏方程式推导过程：米曼氏方程式推导过程：ES的生成速率的生成速率=ES的分解速率的分解速率k2+k3=Km（米氏常数）（米氏常数）k1令：令：则则(2)(2)变为变为:(EtES)S=Km ES(2)=(EtES)Sk2+k3ES k1整理得：整理得：k1(EtES)S=k2 ES+k3 ES当反应处于稳态时：当反应处于稳态时：E+SE+S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE+PE+P2021/5/2767当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即即Et=ES，反应达最大速率反应达最大速率Vmax=k3ES=k3Et (5)ES=EtSKm+S(3)整理得整理得:将将(5)(5)代入代入(4)(4)得米氏方程式：得米氏方程式：Vmax S Km+S V=将将(3)(3)代入代入(1)(1)得得k3EtS Km+S(4)V=2021/5/2768当当当当 V=VV=VV=VV=Vmax max max max/2 2 2 2 时时时时,v K Km m值的推导值的推导K Km mSS K Km m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/Lmol/L。2 2K Km m+S+S V Vmaxmax V VmaxmaxSSV V V VmaxmaxmaxmaxV V V VSSSSK K K Km m m mV V V Vmaxmaxmaxmax/2 /2 /2 /2 V VmaxmaxS S K Km m+S +S 2021/5/2769（二）（二）K Km m与与V Vmaxmax的意义的意义 K Km m值值 K Km m等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。度。意义：意义：a)a)K Km m是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一；Km Km 只与酶的性质有关只与酶的性质有关,与酶的浓度无关与酶的浓度无关b)b)K Km m可近似表示酶对底物的亲和力可近似表示酶对底物的亲和力（反比）（反比）c)c)同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的KmKm值。值。确定最合适底物或天然底物确定最合适底物或天然底物2021/5/2770 酶酶 底物底物 Km（mol/L）己糖激酶（脑）己糖激酶（脑）ATP4 10 4D-葡萄糖葡萄糖5 10 5D-果糖果糖1.5 10 3碳酸酐酶碳酸酐酶HCO3 2.6 10 2胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸1.08 10 1N-苯甲酰酪氨酰胺苯甲酰酪氨酰胺2.5 10 3-半乳糖苷酶半乳糖苷酶D-乳糖乳糖4.0 10 3过氧化氢酶过氧化氢酶H2O22.5 10 2溶菌酶溶菌酶己己-N-乙酰氨基葡糖乙酰氨基葡糖6.0 10 3某些酶对其底物的某些酶对其底物的Km 2021/5/2771vKmKm最小的底物大多数是此酶的天然底物最小的底物大多数是此酶的天然底物 如：己糖激酶对葡萄糖的如：己糖激酶对葡萄糖的Km 1.5mmol/LKm 1.5mmol/L 对果糖的对果糖的Km 28mmol/LKm 28mmol/L 所以葡萄糖为最适底物所以葡萄糖为最适底物v一种酶对每一种底物都各有一个特定的一种酶对每一种底物都各有一个特定的KmKm2021/5/2772 V Vmaxmax定义：定义：V Vm m是酶完全被底物饱和时的反应速度，与是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。酶浓度成正比。意义：意义：V Vmaxmax=K=K3 3 EE如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从V Vmaxmax计算计算 酶的酶的转换数转换数(turnover number)(turnover number)，即动力学常数，即动力学常数K K3 3。2021/5/2773酶的转换数酶的转换数当酶被底物完全饱和时（当酶被底物完全饱和时（Vmax），单位），单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物的分子数称为酶的转换数（变成产物的分子数称为酶的转换数（turnover number），单位是），单位是s-1。酶的转换数酶的转换数可用来表示酶的催化效率可用来表示酶的催化效率2021/5/2774（三）（三）m m值与值与maxmax值的测定值的测定1.双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为，又称为 林林-贝氏贝氏(Lineweaver-Burk)作图法作图法 V VmaxmaxS S K Kmm+S+SV=V=（林贝氏方程）（林贝氏方程）+1/V=1/V=K KmmV Vmax max 1/V1/Vmax max 1/S 1/S 两边同取倒数两边同取倒数两边同取倒数两边同取倒数-1/Km 1/V 1/Vmax max 1/S1/S1/V1/V2021/5/27752.Hanes2.Hanes作图法作图法在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘SSS/V=S/V=K Kmm/V/Vmax max+S/V+S/Vmax max S S S/V S/V -Km K Kmm/V/Vm m 1/V1/Vmax max 2021/5/2776二、酶浓度对反应速度的影响二、酶浓度对反应速度的影响当当SSEE，酶酶可可被被底底物物饱饱和和的的情情况况下下，反反应速度与酶浓度应速度与酶浓度成正比成正比。关系式为：关系式为：V=KV=K3 3 E E0 V V EE 当当SESE时，时，V Vmax max=k=k3 3 E E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 2021/5/2777q 双重影响双重影响温温度度升升高高，酶酶促促反反应应速速度度升升高高；温温度度升升高高1010o oC,C,反反应应速速度增加一倍度增加一倍由由于于酶酶的的本本质质是是蛋蛋白白质质，温温度度升升高高，可可引引起起酶酶的的变变性性，从而反应速度从而反应速度降低降低 。三、温度对反应速度的影响三、温度对反应速度的影响酶酶活活性性0.50.51.01.02.02.01.51.50 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 温度温度 C C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 2021/5/2778q 最适温度最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。酶促反应速度最快时的环境温度。温血动物：温血动物：35354040Taq DNATaq DNA聚合酶：聚合酶：707075 75 可耐受可耐受100100高温高温此酶是从水生栖热菌此酶是从水生栖热菌 Thermus Thermus AquaticusAquaticus（TaqTaq）中分离出的热稳定性）中分离出的热稳定性DNADNA聚合酶，聚合酶，用于用于PCRPCR反应。反应。2021/5/2779低温的作用低温的作用 :贮存生物制品、菌种等贮存生物制品、菌种等 v低低温温时时由由于于活活化化分分子子数数目目减减少少，反反应应速速度度降降低低，但温度升高后，但温度升高后，酶活性又可恢复酶活性又可恢复。临床上的低温麻醉临床上的低温麻醉v减减少少组组织织细细胞胞的的代代谢谢程程