稀碱法提取RNA.ppt

实验十 酵母酵母RNA的提取与组分鉴定的提取与组分鉴定演讲：刘长伟材料收集：刘亮亮2021/10/101实验目的实验目的1.学习稀碱法提取学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法的原理和操作方法2.2.掌握掌握RNARNA组分的鉴定方法组分的鉴定方法2021/10/102原原 理理v 酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的2.67%10%），是工业上大规模制备核酸和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的RNA提取方法之一，其原理是用稀碱溶液裂解细胞，使RNA释放到碱液中，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH至2.5利用等电点沉淀RNA.2021/10/103v RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸戊糖和碱基，以下列反应鉴定各种成分。磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化生成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物钼蓝；核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，在 或 催化下后者与苔黑酚反应，生成鲜绿色复合物；嘌呤碱：嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化物沉淀。2021/10/104器材和试剂器材和试剂v1.器材：沸水浴，量筒，刻度移液管，吸管及滴管，布氏漏斗和抽滤装置，试管，试管架和试管夹，离心机，滤纸，pH试纸，烧杯，天平，酵母粉。2021/10/105v2.试剂v0.2%（m/V）NaOH溶液v95%（V/V）乙醇v冰乙酸v无水乙醚v1.5mol/L H2SO4 溶液v浓氨水v5%（m/V）AgNO3 溶液v苔黑酚乙醇溶液v称取苔黑酚6g，溶解于95%乙醇100mL(冰箱中可保存一个月）v 的浓盐酸溶液v取10%（m/V）溶液2mL，与浓盐酸400mL混合。v 2021/10/106v定磷试剂v1）17%（m/V）H2SO4 溶液v2）2.5%（m/V）钼酸铵溶液v3）10%（m/V）抗坏血酸溶液（贮藏于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1个月。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则已失效。）v临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合（限当天使用）v17%H2SO4：2.5%钼酸铵：水：10%抗坏血酸=1:1:2:1(V/V)2021/10/107实验步骤实验步骤v1.RNA的粗提取v取酵母粉1g，放入一大试管中，加入0.2%NaOHNaOH溶液10mL，摇匀成悬浮液。v将悬浮液在沸水浴中加热20分钟，冷却至室温，倾入离心管中，3000r/min离心10分钟。v将上清液缓缓倾入含3mL95%乙醇的试管中，注意要一边搅拌一边倾入，用冰乙酸调pH至2.5。静置，待RNA完全沉淀后，3000r/min离心5分钟。2021/10/108v弃去上清液，向离心管中加入95%乙醇5mL，振荡摇匀以洗涤沉淀，3000r/min离心3分钟，再弃去上清液，管底部的沉淀即为RNA粗制品。v2.水解RNAv 向上述含有RNA沉淀的离心管中加入 1.5mol/LH H2 2SOSO4 4 溶液10mL，振荡摇匀后转入到一大试管中，沸水浴中加热10min，使RNA水解，过滤水解液，滤液用于RNA组分的定性鉴别。v3.RNA组分鉴定v嘌呤碱v 取一支试管，加入水解液1mL，浓氨水2mL，混匀后沿管壁慢慢加入5%的AgNOAgNO3 3 溶液1mL，勿振荡，静置5min，观察是否产生白色絮状嘌呤银化物沉淀。2021/10/109v核糖v 取试管一支，加入水解液1mL，再加入 的浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液5滴，在通风橱中沸水浴加热5分钟，观察试管中颜色变化。v磷酸v 取试管一支，加入水解液1mL和定磷试剂1mL，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。2021/10/1010要点提示v 1.用苔黑酚（又名地衣酚 3,5-二羟基甲苯）鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。甚至木某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与苔黑酚反应，产生显色复合物。微量DNA无影响，在试剂中加入适量 可减少DNA的干扰。v 2.用乙醇沉淀RNA时，须用酸中和稀碱，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐酸1mL加入乙醇100mL中）至溶液pH为2.5。v 3.用AgNOAgNO3 3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解度很低，加入浓氨水可消除 的干扰。2021/10/1011