单基因遗传性疾病的分子诊断.pptx

单基因遗传性疾病的分子诊断School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University2单基因遗传病就是指受一对等位基因控制得遗传病,有6600多种,并且每年在以10-50种得速度递增,单基因遗传病已经对人类健康构成了较大得威胁。较常见得有红绿色盲、血友病、白化病等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University3单基因遗传病单基因遗传病常染色体常染色体显性性遗传病病常染色体常染色体隐性性遗传病病X连锁显性性遗传病病X连锁隐性性遗传病病Y连锁遗传病病School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University4常染色体显性遗传病常染色体显性遗传病位于常染色体上得两个等位基因中,如有一个突变,这个突变基因得异常效应就能显示发病。特点:遗传与性别无关,男女发病机会均等;患者双亲往往有一方为患者。家族性多发性结肠息肉、多指、并指等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University5常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病致病基因为位于常染色体上得隐性基因,当隐性基因纯合时才能发病。即隐性遗传病 单基因遗传病患者,大多就是由两个携带者所生得后代。特点:男女发病机会均等,发病与性别无关;双亲为无病携带者,子女发病概率为25%;常就是越代遗传;近亲婚配时,子女中隐性遗传病患病率大为增高。先天性聋哑、白化病、苯丙酮尿症等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University6X连锁显性遗传病连锁显性遗传病特点:女性发病率高,这就是由于女性有两条X染色体,获得这一显性致病基因得概率高之故,但病情较男性轻。男性患者病情重,她得全部女儿都将患病。抗维生素D佝偻病、家族性遗传性肾炎等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University7X连锁隐性遗传病 特点:女性携带,男性患病。男性得致病基因只能随着X染色体传给女儿,不能传给儿子,称为交叉遗传。血友病A。病因:血浆中抗血友病球蛋白减少,AHG即第因子凝血时间延长。临床表现:轻微创伤即出血不止,不出血时与常人无异。血友病B。病因:血浆中缺乏凝血酶成份PTC,即第因子。临床表现同血友病A。色盲。临床表现:全色盲对所有颜色瞧成无色,红绿色盲为不能区别红色与绿色。进行性肌营养不良。病因:为原发性横纹肌变性并进行性发展。临床表现:初为行走笨拙,易跌到,登梯及起立时有困难,从仰卧到起立必须先俯卧,双手撑地,再用两手扶小腿、大腿才能站起。进行性肌肉萎缩,但一般不累及面部及手部肌肉。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University8Y连锁遗传病 Y连锁遗传病得特点就是男性传递给儿子,女性不发病。因Y染色体上主要有男性决定因子方面得基因,其她基因很少,故Y连锁遗传病极少见。目前已经知道得Y伴性遗传得性状或遗传病比较少,肯定得有HY抗原基因、外耳道多毛基因与睾丸决定因子基因等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University9 遗传病得病得诊断方法可以断方法可以简单得分得分为以下得四以下得四类:1 1、分分子子水水平平得得诊断断:包包括括限限制制性性片片段段长度度多多态性性得得酶切切分分析析、基因型与基因型与单体型得体型得连锁与关与关联分析、基因得序列分析。分析、基因得序列分析。2 2、细胞胞水水平平得得诊断断:采采用用细胞胞遗传学学技技术进行行染染色色体体核核型型分分析析,比如比如荧光原位光原位杂交法。交法。3 3、蛋蛋白白质水水平平得得诊断断:采采用用生生物物化化学学方方法法分分析析异异常常表表达达得得蛋蛋白白质或代或代谢产物。物。4 4、疾疾病病动物物模模型型得得辅助助诊断断:建建立立相相应得得转基基因因疾疾病病动物物模模型型,辅助助诊断或判定人断或判定人类疾病得致病基因。疾病得致病基因。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University10所有所有遗传性疾病都与某种或多种基因得突性疾病都与某种或多种基因得突变有关有关,对这类疾病疾病进行分子行分子诊断有两种策断有两种策略可供略可供选择:1 1、直接直接诊断策略断策略;2 2、间接接诊断策略断策略School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University11遗传性性疾疾病病分分子子诊断断得得直直接接策策略略就就就就是是通通过各各种种分分子子生生物物学学技技术直直接接检测导致致遗传性性疾疾病病得得各各种种基基因因突突变,如如基基因因得得缺缺失失、插插入入、倍倍增增或或者者就就是是点点突突变等等遗传缺缺陷陷。因因此此直直接接诊断断得得前前提提就就是是被被测基基因因已已经克克隆隆,其核酸序列与其核酸序列与结构已被构已被阐明。明。大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University131 1、点突、点突变得得诊断断 直接诊断策略与方法直接诊断策略与方法:直直接接检检测测基基因因点点突突变变:等等位位基基因因特特异异性性寡寡核核苷苷酸酸杂杂交交(ASOASO)、PCRPCRELISAELISA、等等位位基基因因特特异异性性扩扩增增(ASAASA)、PCRPCRRFLPRFLP、基基因芯片技术等因芯片技术等;基基因因背背景景未未知知得得点点突突变变:单单链链构构象象多多态态性性(SSCPSSCP)、变变性性梯梯度度凝凝胶胶电电泳泳(DEEGDEEG)、异异源源双双链链分分析析(HAHA)、DNADNA序序列列测测定定、蛋白截短测试等。蛋白截短测试等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University142 2、片段性突变得检测、片段性突变得检测片片段段性性突突变就就是是指指DNADNA分分子子中中较大大范范围得得碱碱基基发生生突突变,如如碱碱基基得得缺缺失失、插插入入、扩增增与与重重组。对于于少少数数核核苷苷酸酸缺缺失失或或插插入入,可可以以采采用用检测点点突突变得得方方法法,而而对于于大大得得片片段段突突变,则使使用用SouthernSouthern印印迹迹技技术与与多重多重PCRPCR技技术。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University15间接诊断策略与方法间接诊断策略与方法:采采用用多多态性性连锁分分析析得得方方法法,寻找找具具有有基基因因缺缺陷陷得得染染色色体体、相相关关基基因因得得等等位位基基因因型型与与单倍倍体体型型等等,并并判判定定被被检者者就就是是否否有有这条条存存在在基基因因缺缺陷陷得得染染色色体体、相相关关基基因因得得等等位位基基因型与因型与单倍体型等。倍体型等。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University16医疗机构临床检验项目目录(2013年版)检验项目目1462项:一、一、临床体液、血液床体液、血液专业(360项)二、二、临床化学床化学检验专业(347项)三、三、临床免疫、血清学床免疫、血清学专业(458项)四、四、临床微生物学床微生物学专业(152项)五、五、临床分子生物学及床分子生物学及细胞胞遗传学学检验(145项)School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University17五、临床分子生物学及细胞遗传学检验1、感染性疾病分子生物学、感染性疾病分子生物学检验(89项)2、疾病相关分子生物学及、疾病相关分子生物学及细胞胞遗传学学检验(25项)3、肿瘤分子生物学瘤分子生物学检验(17项)4、用、用药指指导得分子生物学得分子生物学检验(10项)5、其它、其它(4项)School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University182、疾病相关分子生物学及细胞遗传学检验染色体核型分析染色体荧光原位杂交分析脆性X染色体核型分析羊水细胞染色体分析高分辨染色体核型分析绒毛组织染色体分析姐妹染色体互换分析染色体分析21三体与性染色体多倍体检测单基因遗传病基因突变检测遗传性肌营养不良基因分析地中海贫血基因突变检测肝豆状核变性基因分析地中海贫血基因突变检测血友病基因分析苯丙酮尿症得基因突变检测脆性X综合症基因分析遗传性耳聋基因检测Y染色体性别基因分析HLA低分辨基因分型检测脱氧核糖核酸倍体分析HLA中分辨基因分型检测血细胞荧光原位杂交分析HLA高分辨基因分型检测未经处理得羊水细胞荧光原位杂交分析School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University19主要内容主要内容1.血血红蛋白病蛋白病 2.杜氏肌杜氏肌营养不良症养不良症 3.血友病血友病 4.苯丙苯丙酮酸尿症酸尿症 5.成年型多囊成年型多囊肾School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University20导致单基因病产生得基因突变类型基因突变基因突变点突变点突变密码子插入或缺失密码子插入或缺失移码突变移码突变外显子缺失或重复外显子缺失或重复基因倒位基因倒位基因融合基因融合动态突变动态突变School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University21针对单基因病基因突变得分子诊断技术针对单基因病基因突变得分子诊断技术DNADNA杂交杂交基因酶谱基因酶谱连锁分析连锁分析寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交PCRPCR基因芯片基因芯片DNADNA测序测序School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University22分子诊断得时机症状前诊断症状前诊断产前诊断产前诊断着床前诊断着床前诊断症状后诊断症状后诊断School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University23 一、血红蛋白病 血血红蛋白得构成蛋白得构成:2条条珠蛋白珠蛋白(141aa)与与2条条珠蛋白珠蛋白(146aa)School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University24(一)珠蛋白基因簇得结构珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇:16Pter-p13、3 School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University25珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇:11p15、5 School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University26(二)镰状细胞贫血症得分子诊断镰状细胞贫血就是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病。临床表现为慢性溶血性贫血、易感染与再发性疼痛危象以致慢性局部缺血导致器官组织损害。也就是严重危害母子健康得疾病,可使胎儿死亡率达5%,孕妇死亡率达4、62%。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University27因-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替,构成镰状血红蛋白(HbS),取代了正常Hb(HbA)。在氧分压下降时HbS分子间相互作用,成为溶解度很低得螺旋形多聚体,使红细胞扭曲成镰状细胞(镰变)。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University28纯合子型:SS,完全没有正常得HbA,预后严重,只有14%活到成年,而多死亡于30岁前。杂合子型:AS,即正常HbA与异常HbS相混。在非洲有35%得病人就是AS型基因;其变化悬殊,轻者可活至成年,重者可反复出现危象发作。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University29病因病因:珠蛋白基因点突珠蛋白基因点突变ACCTGAGGAGSCCTGTGGAG School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University30镰状状细胞胞贫血得分子血得分子诊断方法断方法 Mst IICCTGAGGCCTGTGG突变型突变型野生型野生型1.15kb0.2kb1.35kbSchool of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University31限制酶切片段电泳后限制酶切片段电泳后,经经Southern BlotSouthern Blot检测检测1.35 kb1.15 kb0.2 kbSchool of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University32(三)地中海贫血得分子诊断地中海贫血又称海洋性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血,就是一组遗传性溶血性贫血疾病。由于遗传得基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致得贫血或病理状态。本病广泛分布于世界许多地区,东南亚即为高发区之一。我国广东、广西、四川多见,长江以南各省区有散发病例,北方则少见。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University33根据所缺乏得珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名与分类。分为型、型、型与型4种,其中以与地中海贫血较为常见。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University34 地中海贫血地中海贫血:大多数就是由于珠蛋白基因得缺失所致,少数由基因点突变造成。各种表型得各种表型得地中海贫血得基因型地中海贫血得基因型表型表型基因型基因型正常人正常人/静止型静止型地中海贫血地中海贫血/标准型标准型地中海贫血地中海贫血/Hb H病病(4)/Hb Barts(胎胎儿儿水水肿综合症合症,4 4)/21211School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University35基因突基因突变:缺失缺失为主主遗传方式方式:不完全不完全显性性遗传？-/-/-/-School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University36 地中海地中海贫血得基因血得基因诊断断BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe基因簇限制性酶切片段与分子杂交探针基因簇限制性酶切片段与分子杂交探针School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University37限制限制酶切片段切片段电泳后泳后,经Southern Blot检测14kb10kbaa/aaaa/aaaa/a-aa/a-aa/-aa/-a-/-a-/-/-/-School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University38地中海地中海贫血血:主要就是由于基因得点突变,少数为基因缺失。LCRGA1IVS-IIVS-II基因簇与基因簇与基因得结构基因得结构School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University39基因缺失与有些点突变可致链得生成完全受抑制,称为0地贫;有些点突变使链得生成部分受抑制,则称为+地贫。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University40地贫基因突变较多,迄今已发现得突变点达100多种,国内已发现28种。其中常见得突变有6种:41-42(-TCTT),约占45%;IVS-654(C T),约占24%;17(A T);约占14%;TATA盒-28(A T),约占9%;71-72(+A),约占2%;26(G A),即HbE26,约占2%。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University41 突突变类型型 分子缺陷 人群1、核苷酸取代(1)-28核苷酸ACTATA区转录信号突变,+中国人(2)IVS-1第1核苷酸GA拼接接头突变,导致RNA加工缺陷,0地中海地区人(3)IVS-1第5核苷酸GC共有顺序突变导致RNA加工缺陷,+印第安人(4)IVS-2第654核苷酸CT内含子变化导致RNA加工缺陷,0中国人(5)第17密码子AT无义突变导致无功能RNA,0中国人(6)Hb Knossos(27丙丝)编码区突变导致RNA加工缺陷,+地中海地区人2、核苷酸插入 密码子71-72间插入1bp移码突变导致无功能mRNA,0中国人3、核苷酸缺失密码子密码子414142(-4)42(-4)缺失缺失移码突变导致无功能mRNA,0中国人School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University42遗传方式方式:不完全不完全显性性遗传/0/00/0School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University43在在b b珠蛋白基因第珠蛋白基因第2内含子第内含子第654位核苷酸位核苷酸CTCT突突变(IVS-II-654 CT,简称称b b654654),),就是中国人所特有得就是中国人所特有得,而且就是最常而且就是最常见得得b b地地贫基因突基因突变之一。之一。654*ABCmRNA(N)mRNA(M)IVS IIVS IIVS II57973bpIVS IIVS IIVS IIb b-globin geneb b654 654 mRNA得剪接模式得剪接模式School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University44654基因突基因突变得分子得分子诊断断RT-PCR法法诊断剪切异常断剪切异常Normal Patient 254bp181bp轻型重型轻型重型School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University45654基因突基因突变得分子得分子诊断断PCR-ASO方法方法杂交不杂交杂交不杂交不杂交杂交不杂交杂交正常杂合子轻型重型正常杂合子轻型重型School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University46反向点反向点杂交同交同时诊断断基因多个点突基因多个点突变M1 M2 M3 M4 M5 M6正常探针正常探针突变探针突变探针l 基因芯片技术基因芯片技术现在已经开发了多种诊断现在已经开发了多种诊断地贫得芯片检测阅读系统地贫得芯片检测阅读系统,系统系统多采用国际先进得多采用国际先进得PCR体外扩增结合体外扩增结合DNA芯片反向点杂交芯片反向点杂交检测技术检测技术,可快速准确检测全血样本中可快速准确检测全血样本中珠蛋白基因上多个珠蛋白基因上多个基因位点得突变基因位点得突变School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University47二、杜氏肌营养不良症(DMD)肌营养不良症由于遗传方式得不同大致可分为以下几类:1.X染色体隐性遗传得Duchenne型与良性得Becker型2.常染色体显性遗传得面-肩-肱型3.常染色体隐性遗传得肢带型在各型肌营养不良症中,Duchenne型发病率最高,病情也严重,常早年致残并导致死亡,就是遗传性肌萎缩症中最有代表性得疾病。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University48杜氏肌营养不良就是一种X染色体隐性遗传疾病,主要发生于男孩。据统计,全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩,导致不便行走。大概在7岁到12岁时,会彻底丧失行走能力,通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。针对该病,医学界尚无有效疗法。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University49(一)遗传方式与DMD基因突变 遗传方式方式:XRDMD基因定位于基因定位于Xp21、2,就是目前已知人就是目前已知人类最大得基因最大得基因,包括包括79个外个外显子子 基因缺失就是基因缺失就是DMD发生得主要原因生得主要原因(约占占60%70%)Xp21、2-p21、1School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University51(二)杜氏肌营养不良症得分子诊断 多重多重PCR技技术诊断断DMD基因缺失基因缺失Chamberlain设计了了9对引物引物,可同可同时扩增第增第4、8、12、17、19、44、45、48与与51号外号外显子子Beggs设计了了9对引物引物,可同可同时扩增启增启动子、第子、第3、6、13、43、47、50、52与与60号外号外显子子18对引物得多重引物得多重PCR扩增可以增可以检测出出DMD基因得基因得98%缺缺失患者失患者 53PatientsSt(-)(+)12345DMD GENEagfbhcdea b c d e f g h School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University54多重多重PCR诊断断DMD基因外基因外显子缺失子缺失I:外显子外显子45缺失缺失 II:外显子外显子48缺失缺失 III:正常对照正常对照 多重探针连接扩增Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)测序序:1.Sanger双脱氧双脱氧链末端末端终止法止法2.二代基因二代基因测序技序技术,如如杂交交测序法序法(SBH)School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University56血友病血友病为一一组遗传性凝血功能障碍得出血性凝血功能障碍得出血性疾病性疾病,其共同得特征就是活性凝血活其共同得特征就是活性凝血活酶生生成障碍成障碍,凝血凝血时间延延长,终身具有身具有轻微微创伤后出血后出血倾向向,重症患者没有明重症患者没有明显外外伤也可也可发生生“自自发性性”出血。出血。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University57三、型血友病 1、血友病血友病A(血友病甲血友病甲),即因子即因子促凝成分促凝成分(:C)缺乏症缺乏症,也称也称AGH缺乏症缺乏症,就是就是X染色体染色体隐性性遗传疾病。疾病。2、血友病血友病B(血友病乙血友病乙),即因子即因子缺乏症缺乏症,又称又称PTC缺乏症、缺乏症、凝血活凝血活酶成分缺乏症成分缺乏症,亦亦为X染色体染色体隐性性遗传。3、血友病血友病C(血友病丙血友病丙),即因子即因子(F)缺乏症缺乏症,又称又称PTA缺缺乏症、凝血活乏症、凝血活酶前前质缺乏症。缺乏症。为常染色体不完全常染色体不完全隐性性遗传。1520/10万男孩中有万男孩中有发病病,此此发病率在所病率在所调查得不同得种得不同得种族与地域之族与地域之间没有差异。没有差异。发病率以血友病病率以血友病A最多占最多占85%,血血友病友病B占占15%,血友病血友病C罕罕见。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University58(一)F得基因结构 F基因位于基因位于X染色体染色体长臂末端臂末端(Xq28),包括包括26个外个外显子与子与25个内含子个内含子,全全长186kb。包括包括26个外个外显子与子与25个内含子个内含子,其其mRNA全全长约为9kb,cDNA为9009bp。其翻。其翻译产物物为 2351个个aa残残基得多基得多肽链。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University59(二)型血友病 得遗传方式与基因突变遗传方式遗传方式:XR已已报道道F基因点突基因点突变174种种,缺失缺失117种种,插入插入10种。由于种。由于导致致HA F基因得点突基因得点突变多多,故在故在实际工作中不可能工作中不可能对每一病人作每一病人作点突点突变得得检测,所以所以DNA多多态性得性得连锁分析分析仍然就是仍然就是型血友病型血友病基因基因诊断得常用手段。断得常用手段。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University60A型血友病得分子诊断PCR-RFLP连锁分析法School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University61血友病A(Hemophilia A,HA)99bp43bp142bpBclIBclI142bpSchool of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University63Amp-FLP在FV区内尚有两个VNTP区,一个位于DXS52,另一个位于DX102内,它 仍均具有复杂得多态性,亦可用于连锁分析。School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University64其她诊断方法PCR-SSCPPCR-DGGESchool of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University65School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University66四、苯丙酮酸尿症(PKU)(一一)苯丙氨酸苯丙氨酸羟化化酶(PAH)基因突基因突变 编码PAH得基因得基因发生突生突变,致使致使PAH活性降低或活性降低或丧失失 PAH突突变种种类达达440余种余种,涉及涉及13个外个外显子子,突突变得得80%发生在外生在外显子子512编码区区 中国人得中国人得PAH基因突基因突变类型型30余种余种,已确定已确定20多种多种,大大约占占所有基因突所有基因突变类型得型得80%School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University67苯丙苯丙酮酸尿症得酸尿症得遗传方式方式:ARaaAaAaSchool of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University68(二二)苯丙苯丙酮酸尿症得分子酸尿症得分子诊断断 PCR-STR法法 我国人群中我国人群中检测到到9种种STR(短串短串联重复序列重复序列)等位基因等位基因,扩增片段增片段长度度224256pb,具有具有长度多度多态性性 据此多据此多态性性,通通过连锁分析可分析可对PHA 进行行诊断断,该方法得方法得诊断率达到断率达到66、2%School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University69PCR-ASO法法外外显子子3:111位密位密码子由子由CGA突突变为TGA(终止密止密码),此此种突种突变导致合成无致合成无功能得功能得PHA