生化仪器中的空白定标和质控.ppt

生化中的定标和空白生化中的定标和空白n n定标的意义：定标的意义：定标就是要找出一个参考点，就是一个定标就是要找出一个参考点，就是一个K K值值（或（或F F值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们测值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们测定一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪，定一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪，测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没有什么意测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没有什么意义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性。那义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性。那就要乘上一个就要乘上一个K K值，计算并打印出来的结果对我们就有意义值，计算并打印出来的结果对我们就有意义了。了。K K值就是我们通过定标找出来的。一般上最低要求是由值就是我们通过定标找出来的。一般上最低要求是由试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个吸光度。试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个吸光度。K=K=标准标准浓度浓度/(A/(A标准标准A A试剂空白试剂空白)标准液的浓度我们是知道的，这标准液的浓度我们是知道的，这两个吸光度可以由仪器测出，这样就得出一个两个吸光度可以由仪器测出，这样就得出一个K K值。无论什值。无论什么样的标本，用其吸光度乘以么样的标本，用其吸光度乘以K K值我们就得到了答案。因此，值我们就得到了答案。因此，K K值具有非常决定性的意义，可以决定标本的准确性。值具有非常决定性的意义，可以决定标本的准确性。K K值值的决定因素：的决定因素：我们看看我们看看K K值会受到什么影响呢？值会受到什么影响呢？第一，标第一，标准液的浓度一定要准确（标准液最好与标本一样是以血清为准液的浓度一定要准确（标准液最好与标本一样是以血清为基质的）。基质的）。第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您的仪器相当稳定，试剂是影响的仪器相当稳定，试剂是影响K K值的一个主要因素。值的一个主要因素。如何确定如何确定K K值是正确的？值是正确的？一般我们用质控血清来检一般我们用质控血清来检查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结果查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结果很好，可以说很好，可以说K K值是准确的，用这个值是准确的，用这个K K值计算出来病值计算出来病人的结果也是准确的，所以人的结果也是准确的，所以K K值非常关键。值非常关键。K K值的真值的真面目：面目：K K值实际上代表了斜率，截距代表试剂空白，值实际上代表了斜率，截距代表试剂空白，试剂空白每天都在变化，所以试剂空白每天都在变化，所以K K值的稳定性决定您的值的稳定性决定您的仪器与试剂，如果仪器与试剂都十分稳定，那仪器与试剂，如果仪器与试剂都十分稳定，那K K值也值也很稳定。很稳定。多长时间定一次标合适？多长时间定一次标合适？这要看您试剂这要看您试剂的稳定性，质控结果不好，有些项目做试剂空白可的稳定性，质控结果不好，有些项目做试剂空白可以解决，有些项目要做两点定标。以解决，有些项目要做两点定标。酶的项目如何确酶的项目如何确定定K K值：值：一是计算出来的理论一是计算出来的理论K K值；值；K=(TV K=(TV 1000)/(SV L )1000)/(SV L )二是用有酶项目的定标液得出二是用有酶项目的定标液得出K K值：目前各公司可以提供多项目的定标液，不仅有值：目前各公司可以提供多项目的定标液，不仅有底物类的项目，也有酶类的项目。底物类的项目，也有酶类的项目。生化检验中的各种空白概念生化检验中的各种空白概念n n1、试剂空白：由于生化测试测量的吸光度为相对吸光度，所以从理论上说，所有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光度扣除。试剂本身的吸光度就是 试剂空白。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量n n把样本换成蒸馏水来测量。把样本换成蒸馏水来测量。在传统手工方法在传统手工方法中中,每次测定都要做至少三个管每次测定都要做至少三个管:测定管、标准管、测定管、标准管、空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出来也空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出来也就是试剂空白。因为就是试剂空白。因为 操作环境、仪器状态、试剂操作环境、仪器状态、试剂稳定性等变异，所以要求每次都要测定试剂空白，稳定性等变异，所以要求每次都要测定试剂空白，称为实时试剂空白。称为实时试剂空白。在全自动分析仪上，大在全自动分析仪上，大体上是模拟手工操作。但许多全自动分析仪为追体上是模拟手工操作。但许多全自动分析仪为追求速度，在设计上采用一些折中方法来测定试剂求速度，在设计上采用一些折中方法来测定试剂空白。以日立全系空白。以日立全系 列生化仪为例。该系列分析仪列生化仪为例。该系列分析仪是做不了实时试剂空白，因为它们全是先加入样是做不了实时试剂空白，因为它们全是先加入样本后加试剂，为了折中，只好在定标时做一个试本后加试剂，为了折中，只好在定标时做一个试剂空白，保剂空白，保 存起来，需要扣除试剂空白时再减这存起来，需要扣除试剂空白时再减这个预先保存的值。这种做法，对于比较稳定的试个预先保存的值。这种做法，对于比较稳定的试剂来讲，对结剂来讲，对结n n果影响不大。果影响不大。通俗的讲，日立的仪器工作流通俗的讲，日立的仪器工作流程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加入入R1R1试剂、试剂、R2R2试剂，所以试剂空白在每个测定项试剂，所以试剂空白在每个测定项目曲线目曲线 中是无法看到的。但是中是无法看到的。但是76007600从从CALIBRATIONCALIBRATION中是可以看到的，中是可以看到的，S1ABSS1ABS就是代表就是代表试剂空白吸光度，在试剂空白吸光度，在CALIBRAT IONCALIBRAT ION画面里的下画面里的下方找到方找到Reaction MonitorReaction Monitor（反应监察），其中（反应监察），其中STD(1)STD(1)就是代表试剂空白反应曲线就是代表试剂空白反应曲线.为了减小误差，为了减小误差，日立仪器会连续做两次测定，所以你看到日立仪器会连续做两次测定，所以你看到 FIRSTFIRST和和SECONDSECOND两条，计算时是取他们的平均值。做两条，计算时是取他们的平均值。做试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳定，积极试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳定，积极采取措施纠正。对于日立采取措施纠正。对于日立 的这种试剂空白测定很的这种试剂空白测定很多仪器都采用这种方法，也叫做试剂空白校准。多仪器都采用这种方法，也叫做试剂空白校准。总的说来，自动生化仪上的试剂空白一般表现为总的说来，自动生化仪上的试剂空白一般表现为零点吸光度，该吸光度是通过校准确立的。零点吸光度，该吸光度是通过校准确立的。n n2 2、样本空白：、样本空白：由于溶血、脂血、黄疸等情况，由于溶血、脂血、黄疸等情况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可以去除这以去除这 方面的影响。测量方法是按照正常测试方面的影响。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐水的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐水来进行测量。自动生化仪上，很难界定样本空白。来进行测量。自动生化仪上，很难界定样本空白。与消除样本空白有关的大约有如下几点与消除样本空白有关的大约有如下几点:a).:a).在在双试剂测定时，加入试剂双试剂测定时，加入试剂1 1和样品后的吸光度可一和样品后的吸光度可一定程度上扣除样本空白，所以有单定程度上扣除样本空白，所以有单 试剂不能扣除试剂不能扣除样本空白的说法。样本空白的说法。b).b).现在优质的试剂的抗干扰现在优质的试剂的抗干扰能力都比较强，比如有些双试剂，能力都比较强，比如有些双试剂，R1R1加入后先和加入后先和样本孵育一段时间，将血红蛋白、脂肪样本孵育一段时间，将血红蛋白、脂肪n n胆红素等反应胆红素等反应 掉，再加入掉，再加入R2R2开始测定反应。在一开始测定反应。在一定范围内都可以消除样本空白。定范围内都可以消除样本空白。c).c).现代全自动现代全自动生化仪大多采用双波长测定生化仪大多采用双波长测定.双波长测定的原则是双波长测定的原则是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征，根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征，选择两个波长和选择两个波长和 ，使干扰组分在这两个波长处的，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光系数有显著差别。以两波长分别测定分析溶液的系数有显著差别。以两波长分别测定分析溶液的吸光度，吸光度，以两个吸光度值之差以两个吸光度值之差(A)A)计算。这也计算。这也可以扣除一部分样本空白可以扣除一部分样本空白.d).d).有些仪器有些仪器,例如日例如日立系列立系列,有专门的有专门的“血清信息血清信息”功能的设置。做法功能的设置。做法都是单都是单 独占用一个空白通道来计算，这也叫做样独占用一个空白通道来计算，这也叫做样品空白校准。品空白校准。3 3、水空白：、水空白：比色杯在加入水以比色杯在加入水以后的吸光度。水空白的意义主要是对光路系统进后的吸光度。水空白的意义主要是对光路系统进行检查和校正，如光源，比色杯等，同时在计算行检查和校正，如光源，比色杯等，同时在计算中起到消除中起到消除“杯差杯差”的的 作用。日立作用。日立70607060中的中的Cell Cell BlankBlank（杯空白）测定的就是水空白。（杯空白）测定的就是水空白。全面质量控制的内容n n全面质量控制的内容主要包括分析前、分析中、分析后这三个主要过程的质控。n n只有认真的检测和控制这三个过程中各个环节可能出现的误差，才能保证最后检测结果的准确性，才能达到我们的质量要求。（一）分析前质控n n人员培训人员培训n n实验室的设置实验室的设置（水、电、相关设备、用具等）（水、电、相关设备、用具等）n n实验仪器的质量保证实验仪器的质量保证 (仪器的精度、波长的准确度仪器的精度、波长的准确度)n n检测方法的选择和评价检测方法的选择和评价 （重复实验、回收实验、干扰实验、方法比较实验）（重复实验、回收实验、干扰实验、方法比较实验）n n试剂和标准品的选择和评价试剂和标准品的选择和评价 （线性范围测定、反应曲线的观察、稳定性实验）（线性范围测定、反应曲线的观察、稳定性实验）n n标本准备标本准备 （血清、血浆、胸腹水等（血清、血浆、胸腹水等)（二）分析中质控n n建立项目操作程序 标准化的操作规程（SOP文件）。n n室内质控和结果分析 对各个项目进行室内质量控制，并对质控结果进行分析与处理。（三）分析后质控n n审核实验结果n n室内质控的数据管理n n参加室间质量评价n n建立投诉调查与反馈机制二、临床生化检验室内质量控制n n（一）、概念与意义（一）、概念与意义n n室内质量控制：室内质量控制：指各实验室为了监测和评价本实验室工作质量，以决定常规检验报告能否发出，而采取的一系列检查，控制手段，包括实验室工作的全过程。n n意义：是检测常规工作中的精密度，并观察准确度的改变，提高本实验室常规工作中天内与天间标本检测的一致性。n n要进行室内质量控制就必须要有指示物对各项目的质量进行指示和判断，来说明质量好坏的情况，指示物就是我们需要的控制物（也称质控物）。n n控制物定义（也称质控物）：控制物定义（也称质控物）：含有被检测的化学成份，用于监测实验室的精密度和准确度的一种指示血清（溶液）称之为控制物。n n 标准品定义（参考物）：标准品定义（参考物）：是指它的一种或几种物理或化学性质已经充分被确定，被用于校准仪器或证实一种测定方法的物质。2 2 质控品应具备的特性质控品应具备的特性n n人血清基质，因它的基质效应小人血清基质，因它的基质效应小.n n无传染性无传染性.n n添加剂和调制物的数量尽可能少添加剂和调制物的数量尽可能少.n n瓶间变异小，瓶间变异小，（1 1）酶类项目瓶酶类项目瓶CVCV应小于应小于2 2，其它分析物其它分析物CVCV应小于应小于l l （2 2）某某些些不不稳稳定定成成分分(如如胆胆红红素素、ALPALP等等)在在复复溶溶后后前前4 4小小时时的变异应小于的变异应小于2 2.（3 3）冻干品其复溶后，冻干品其复溶后，2 28 8环境中环境中稳定不少于稳定不少于24h24h，2020环境中环境中稳定不少于稳定不少于2020天，天，n n到实验室后的有效期应在到实验室后的有效期应在1 1年以上年以上.室内质控血清浓度水平要求n n、三级以上医院的临床实验室，定量测定每批(不超过24小时)至少使用两个浓度水平的质控血清。n n、二级、一级医院临床实验室，至少使用一个浓度水平(医学决定水平)的质控血清。n n、医学决定水平：是指某项待测物的含量，围绕该浓度的升高或降低，对确定疾病的诊断或治疗起帮助甚至关键的作用。统计学的基本概念、精精密密度度：测定值与均值之间的差值情况称为精密度，差值越大精密度越差，反之越好。、准确度：、准确度：测定值与真实值之间的差值情况称为准确度，越接近真值准确度也好，反之就越差。室内质量控制的主要方法1.1.常规质控图（S）法2.2.Westgard多规测质控法3.3.6西格玛质控图法4 4.日常标本测定结果均值图法 常规质控图（S）法n n这种方法操作简单，直观，易懂，它具有成熟的理论和实际经验，它只需要单一浓度的质控血清就可实现对临床进行室内质量控制，是目前国内外采用最广泛的一种常规室内质量控制的方法。n n也称为均值-标准差质控图法，也称levey-Jenning质控图法。在纵坐标上标出X、X2SD、X3SD的标志，横纵标上标出日期或次数。用红笔划出X2SD作为警告线；用蓝笔划出X3SD作为出控线。这样称为一张空OCV或RCV图。质控图上所包括的内容常规靶值、控制限的确定：n n一个月结束后,将该月的在控结果与前20个质控测定结果汇集在一起，计算累积X、S、CV,再作为第二个月的IQC的暂定靶值和控制限，观测第二个月的IQC。n n以此重复个月建立常规的靶值、控制限。n n在计算累积值的时候需去掉超过3SD的数据n n室内质控的结果分析n n（1）测定值的分布规律n n95%的测定结果应落在X2SD范围内。n n不能有连续5次结果逐渐上升或下降。n n不能有连续5次结果在均值的同一侧。n n不能有连续2次结果在X2SD 以外。n n不能有数据落在X3SD 外。如违反上述规律时，称为失控。n n（）质质控控图图的的几几种种失控表现失控表现 曲曲线线漂漂移移：是是由由于于系系统统误误差差造造成成，准准确确度度发发生生了了一一次次性性的的向向上上或或向向下下的的改改变变，这这种种往往往往是是由由于于一一个个突突然然出出现现的的新新的的情情况况引引起起。如如更更换换质质控控血血清清、试剂及操作人员。试剂及操作人员。n n趋势性变化趋势性变化：质控：质控图趋势性向下或向上图趋势性向下或向上变化。表明检测的准变化。表明检测的准确度发生逐渐的变化，确度发生逐渐的变化，这种变化多发生是由这种变化多发生是由于一个逐渐改变的因于一个逐渐改变的因素造成的。如试剂的素造成的。如试剂的挥发、吸水、沉淀等。挥发、吸水、沉淀等。n n精密度变化：仪器、试剂或方法学不稳定n n8 8、失控后处理失控后处理n n迅迅速速回回顾顾，检检查查整整个个操操作作过过程程。是是否否有有发发生生错错误误的的环环节节，包包括括试试剂剂、方方法法、波波长长，以以及及程程序序等等出现差错。出现差错。n n如如操操作作步步骤骤均均无无问问题题，可可重重复复试试验验一一次次，如如有有改改进进，说说明明误误差差很很可可能能操操作作错错误误所所致致，标标本本量量，试剂量的错误，或波长选择错误所致。试剂量的错误，或波长选择错误所致。n n如仍不能更正，可取一份如仍不能更正，可取一份新鲜新鲜的控制血清重作。的控制血清重作。n n仍不能解决问题，取一份仍不能解决问题，取一份定值血清重做定值血清重做。n n仍不能解决，应仍不能解决，应仔细检测仪器仔细检测仪器。n n仍未得到纠正，仍未得到纠正，试剂、质控血清重新配制和溶试剂、质控血清重新配制和溶解解，仪器保养检修，全部重新查找原因直到问题仪器保养检修，全部重新查找原因直到问题解决解决。n n1、方法：n n要求在常规条件，同时测定2份不同浓度的定值质控血清，所含测定物浓度最好分别为医学决定水平的上限或下限。Westgard多规则法2 2 常用的质控规则常用的质控规则n n质控规则以符号AL表示：(1)A是指超过质控限(L)的质控测定值的个数(2)L是质控界限。(3)1 2s2s质控规则,A=1,L=2sn n当质控测定值超过了规定某规则要求时，应判该批分析违背此规则。n n1 2s：有1个质控测定值超过X2s，该规则称为“警告规则”。n n13s规则：1个质控测定值超过X3s质控限。此规则多由随机误差造成n n22s规则:2个连续的质控测定值同时超过X X2s2s或X X2s2s质控限。此规则主要由系统误差造成n nR4s规则：在同一批内进行两种不同浓度质控品监测时,高浓度测定值与低浓度测定值之间的差值超过4s。此规则多由随机误差造成。n n41s1s规则：4个连续的质控测定值同时超过X1s或X1s。此规则主要由系统误差造成。n n10 x规则：10个连续的质控测定值同时落在均值（X）的同一侧。此规则主要由系统误差造成。n nWestgard多规则的主要特点是：是在Levey-Jennings方法基础上发展起来的，因此,它很容易与常用的Levey-Jennings质控图进行比较并涵括后者的结果；通过单值质控图进行简单的数据分析和显示 具有低的假失控或假报警概率；当失控时，能确定产生失控的分析误差的类型，由此可帮助确定失控的原因以寻找解决问题的办法。n n最初的Westgard多规则通常有六个质控规则，即12s、13s、22s、R4s、41s、10 x。n n其中12s规则是是一种警告规则也是Westgard法的启动规则，它有助于对质控数据的快速判断。n n为了表达的方便，通常以“”符号将各项质控规则联接起来，如13s/22s/R4s41s10 x。n n在实践中13s或R4s规则常检出随机误差，n n而22s、41s、10 x质控规则检出系统误差。IQC中需要注意存在的问题n n注意的问题注意的问题：n n（1）质控血清必须完全溶解和融化后才能使用，同时，n n（2）必须有准确的加样器，而且水的质量一定要得到保证。n n（3）质控血清必须与常规标本同等对待，不得特殊处理，只有这样才能真正反映常规工作的质量。n n（4）质控血清测得值应及时在质控图上。确认没有失控后，再填发当天的检验报告。n n（5）通过质控图寻找出现误差规律。在失控时查找原因，均需要各方面详细记录，才能进行正常分析，因此必须养成良好的实验记录习惯。n n（6）单纯依靠质量控制制图监测工作质量是不够的。特别是对于过失误差，是无法用统计学方法去发现的。n n存在的问题n n（）质控标本对质控过程的监控不够，一般只在早晨调机时做一次质控标本。n n（）将质控血清反复测定多次，取其结果均值作为当天质控血清的检测值。因在取均值过程中抵消了大部分随机误差，使结果反映出的精密度比实际情况好得多，起不到控制常规工作质量的作用。n n（）每天常规工作结束后，不是由操作者本人把当天质控血清测定结果及时记录并画在图上，而是在月底一次性将所有结果面在图上。n n（4）直接采用厂家提供的质控血清的定值和允许误差范围做为IQC的靶值和控制限，而不是通过自己实验室测定而得出靶值和允许误差范围。n n（5）室内质控中如出现有1个数据超过2s，就认为是失控，马上重新测定质控物。n n（6）只记录在控的质控结果。不记录失控结果，使质控图失去了其真实性。n n（7）将测定时所得X、S、CV和每个月常规工作质量控制血清测定所得X、S、CV相混淆。临床生化检验室间质量评价n n（一）、概念与目的：（一）、概念与目的：n n室间质量评价：室间质量评价：是指实验室以外的某机构对各实验室常规工作质量进行监测和评定。该机构对各实验室发放同一批号质控血清，在规定的时间内测定，而且在规定的时间内收集测定结果作出统计学分析。n n目的目的：是通过实验室间的比对，观察各实验室的准确性、一致性并采取一定措施，使各实验室结果逐渐的趋于一致。室间质量评价（EQA）的组织方法n n1、方法：（1）组织参加EQA的实验室（2）为参与实验室进行编号，并发放质控物。（3）按规定日期收集各实验室对发放质控物的测定结果，并对返回的测定结果作统计分析，并按规定评出成绩。EQA的统计方法是以各实验室的测得值与靶值之间的离散程度为评价依据。