质-粒-提-取-原理及步骤.doc

o persoal se only n stdy ad rsarch; ot fmcia use质 粒 提 取 原理及步骤一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒N， 这些方法都含有以下3个步骤：、 细菌培养物得生长。、 细菌得收获与裂解3、 质粒DA得纯化.（一）细菌培养物得生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素得液体培养基中生长）,然后从中纯化质粒，质粒得提纯几乎总就是如此.现在使用得许多质粒载体(如pU系列）都能复制到很高得拷贝数,惟致只要将培养物放在标准B 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒D.然而，较长一代得载体（如BR32）由于不能如此自由地复制,所以需要在得到部分生长得细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主得蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体得复制，然而,松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样,像pBR类得质粒，从经氯霉素处理与未经处理得培养物中提取质粒得产量迥然不同,前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成得氯霉素/ml)已成为标准得操作、用该方法提取得质粒DN量,对于分子克隆中几乎所有想象到得工作任务。（二）细菌得收获与裂解细菌得收获可通过离心来进行,而细菌得裂解则可以采用多种方法中得任意一种,这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒得大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒D得技术。 尽管针对质粒与宿主得每一种组合分别提出精确得裂解条件不切实际,但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意得结果. 1)大质粒(大于15kb）容易受损,故应采用漫与裂解法从细胞中释放出来.将细菌悬于蔗糖等渗溶液中,然后用溶菌酶与DTA进生处理，破坏细胞壁与细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压得细菌内部把质粒释放出来所需要得作用力。 2)可用更剧烈得方法来分离小质粒。在加入ET后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对,故可使宿主得线状染色体N变性，但闭环质粒DA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DN链迅速得到准确配置，重新形成完全天然得超螺旋分子。 )一些大肠杆菌菌株（如B01得一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量得糖类,当随后用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DN所占位置形成一致密得、模糊得区带。因此很难避免质粒DN内污染有糖类,而糖类可抑制多种限制酶得活性。 故从诸如B1与G等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法. 4）当从表达内切核酸酶A得大肠杆菌菌株（endA株,如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法.因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提）可以避免此问题。 5）目前这一代质粒得拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不就是要增加质粒DNA得产量,而就是要降低细菌细胞在用于大量制备得溶液中所占体积。大量高度粘稠得浓缩细菌裂解物,处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得得质粒NA得量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到得质粒DN得量大致相等.(三）质粒A得纯化 常使用得所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如,用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒与染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环N分子得结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋.由此导致线状N得长度有所增加，作为补偿,将在闭环质粒NA中引入超螺旋单位。最后,超螺旋度大为增加,从而阻止了溴化乙锭分了得继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多得染料,直至达到饱与（ 每个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) .由于染料得结合量有所差别,线状与闭环DN分了在含有饱与量溴化乙锭得氯化铯度中得浮力密度也有所不同。多年来,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 得首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒D与宿主DNA得方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度得质粒。二、质粒DNA得小量制备质粒DN得小量制备可采用下述得碱裂解法或煮沸法（一）细菌得收获与裂解1。收获)将含相应抗生素得LB加入到容量为1l 并通气良好（不盖紧)得试管中，然后接入一单菌落,于0剧烈振摇下培养过夜。)将1、5l培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于以120g离心30秒，将剩余得培养物贮存于4。）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清得简便方法就是用一次性使用得吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离细菌沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁得液滴。2.碱裂解法1）将细菌沉淀,所得重悬于100l用冰预冷得溶液I中，剧烈振荡。溶液I：50mmol/L葡萄糖5mmo/L rsC(p8、0)10mol/LEDT（pH8、0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lb/2(6、9510Pa） 高压下蒸气灭菌1分钟，贮存于4。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散,将两个微量离心管得管底部互相接触震荡,可使沉淀迅速分散。)加20新配制得溶液.溶液0、2ml/L NOH(临用前用10mo/L贮存液现用现稀释)1%SDS盖紧管口,快速颠倒离心管次，以混合内容物。应确保离心管得整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。）加50用冰预冷得溶液 溶液5m乙酸钾 6ml冰乙酸 11、5水 28、5ml所配成得溶液对钾就是3mol/L,对乙酸根就是5l/。盖紧管口,将管倒置后与地振荡10秒钟溶液在粘稠得细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上35分钟.4）用微量离心机于412000g离心分种,将上清转移到另一离心管中。）可做可不做：加等量酚：氯念, 振荡混匀，用微量离心机于 以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提,然而由于一些未知得原因,省略这一步,往往会得到可耐受限制酶切反应得DA。6）用2倍休积得乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合, 于室温放置2分钟。7）用微量离心机于以1 00g离心5分钟。8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁得液滴除尽。除去上清得简便方法就是用一次性使用得吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁得液滴。9)用1l70%乙醇于洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i、 此法制备得高拷贝数质粒(如X3或pUC），其产量一般约为:每毫升原细菌培养物35g。ii如果要通过限制酶切割反应来分析DN,可取l DNA溶液加到另一含l水得微量离心管内，加 10限制酶缓冲液与单位所需限制酶， 在适宜温育1-2小时。将剩余得DN贮存于20.i、 此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:3.煮沸裂解1）将细菌沉淀，所得重悬于350lTT中。ST、m/LNaCL10mmo/L ris、Cl（p8、）ml/L EDTA(、)5% TritonX12）加25l新配制得溶菌酶溶液0mgml,用10molL Tris、Cl(pH8、0)配制，振荡秒钟以混匀之。如果溶淮中p低于、0，溶菌酶就不能有效发挥作用.)将离心管放入煮沸得水浴中，时间恰为40秒。）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。)在上清中加入40l mL乙酸钠（pH、2）与20l异丙醇，振荡混匀，于室温放置分钟。）用微量离心机于4以12 000离心分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出.再将附于管壁得液滴除尽。除去上清得简便方法就是用一次性使用得吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面.当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管得液滴.9）加1l 7乙醇,于4以2 000g离心分钟。0)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心,因为有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成得所有乙醇液滴，打开管口,放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见得液体（5）分钟。1）用50含无DA酶得胰RN酶(2/ml）得TE(pH8、0）溶解核酸稍加振荡，贮存于0。注:当从表达内切核酸酶A得大肠杆菌株（endA+株,如H101 ）中小量制粒尤其DN时，建议舍弃煮沸法.因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在g+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解. 在上述方案得步骤9)之间增加一步，即用酚:氯仿进行抽提,可以避免这一问题.（二)质粒DA小量制备得问题与对策 裂解与煮佛法都极其可靠，重复性也很好,而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法得过程中，只碰到过两个问题：）有些工作者首次进行小量制备时,有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割,这几乎总就是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中得杂质。如果总就是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。)在十分偶然得情况下,个别小时制备物会出现无质粒N得现象.这几乎肯定就是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。三、质粒NA得大量制备（一)在丰富培养基中扩增质粒 许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上得细菌有效，然而在带有pMBl或ClEl复制子得高拷贝数质粒得大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物25mg质粒NA，而且重复性也很好。1)将30ml含有目得质粒得细菌培养物培养到对数晚期（DA 600约0、6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来得小量液体闭关物进行接种。）将含相应抗生素得50mlL或rific肉汤培养基(预加温至37)施放入5ml对数晚期得培养物,于7剧烈振摇培养2小时(摇床转速30转/分)，所得培养物得D600值约为0、。3）可做可不做:加2、5l氯霉素溶液（34mgl溶于乙醇）,使终浓度为10g/m.像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复得质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代得质粒(如pU质粒)可复制达到很高得拷贝数，因此无需扩增.这些质粒只要从生长达到饱与得细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制得优点,可减少细菌裂解物得体积与粘稠度,极大地简化质粒纯化得过程。所以一般说来，尽管要在生长中得细菌培养物里加入氯霉素略显不便,但用氯霉素处理还就是利大于弊。)于3剧烈振摇（00转分)，继续培养1216小时。（二）细菌得收获与裂解1。收获1）用合适转头于4以4000转分离心15分钟,弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。2）将细菌沉淀重悬于10m用冰预冷得STE中。STE0、1l/L NaC1mmolL rs、Cl(H8、0）1mmolL (H、0）按步骤）所述方法离心，以收集细菌细胞.，碱裂解法)将冼过得500m培养物得细菌沉淀物来自收获细菌得步骤3 重悬于10ml（18m)溶液I中.溶液I:5mml/葡萄糖25mml ri、Cl(pH8、0）0mmol/L EDTA(pH8、0)溶液可成批配制,在10lbf/in2（、95x104Pa)高压下蒸气灭菌1分钟,贮存于。2）加1m（2ml)新配制得溶菌酶溶液10ml，溶于10m/L rs、Cl(pH8、0）。当溶液得pH值低于8、0时,溶菌酶不能有效工作。)加0l（40l）新配制得溶液.溶液：0、2mol/L O（临用前用10m/L贮存液现用现稀释)D盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置10分钟。4)加15l（20ml)用冰预冷得溶液。溶液:molL乙酸钾 60l冰乙酸 1、m水 2、5ml所配成得溶液对钾就是3mol/L，对乙酸根就是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明得两个液相.置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀.于0放置后所形成得沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA与钾-SD-蛋白质膜复合物。）用合适转头于4以4转/分离心5分钟，不开刹车而使转头自然停转.如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心2分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内得粘稠状液体。未能形成致密沉淀块得原因通常就是由于溶液与细菌裂解物混合不充分步骤4）。）上清过滤至一25l离心瓶中,加0、6体积得异丙醇，充分混匀,于室温放置10分钟。)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于离心，盐也会了生沉淀。)小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70乙醇洗涤沉积管壁.倒出乙醇，用与真空装置相联得巴期德吸出附于瓶壁得所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余得痕量乙醇挥殆尽.9)用3 TE（pH8、)溶解核酸沉淀.0)纯化。四、质粒DNA得纯化聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA(一）聚乙二醇沉淀法提取质粒NA）将核酸溶液所得转入15mlrx 管中， 再加3ml 用冰预冷得5ol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于下以10 000转/分离心10分钟。C可沉淀高分子RA。2)将上清转移到另一30mlrx管内,加等量得异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当得转尖)于室温以0 00转/分离心10分钏， 回收沉淀得核酸。）小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留得液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连得巴其德吸管吸去附于管壁得所有液滴，敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟，以使最后残余得痕量乙醇蒸发殆尽。4）用500l含无NA酶得胰RN酶（20/ml ）得E（pH8、0）溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。)加500含3%(w/v）聚乙二醇（PEG8000）得、6 Cl,充分混合,用微量离心机于以1200离心5分钟,以回收质粒N.)吸出上清,用40 TE(pH8、0)溶解质粒DA沉淀.用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。7）将水相转到另一微量离心管中，加100l mo/L乙醇铵，充分混匀,加2倍体积（约1ml）乙醇,于室温放置分钟,于4以12 000离心分钟，以回收沉淀得质粒。)吸去上清，加20l处于4以1200g离心分钟。9）吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见得痕量乙醇蒸发殆尽。10)用500l TE（pH、）溶解沉淀1：10稀释用T（pH8、0) 后测量OD 2，计算质粒NA得浓度（OD26050g质粒DA/ml),然后将DA贮于0。 以下无正文 仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。 , ， 、or ersoal useol i study andreeach; not f mercial s、ur den prsnln Studien， Forhung， omerzilenZweckeverendewern、ou l tude et a recheche uniqeent desins ronnlls; pa des fin mcils、Forpersonause onlynstudyan research； notfor mecialuse