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酶工程酶工程Enzyme Engineering生物工程学院生物工程学院彭钰珂彭钰珂第三章第三章 固定化酶固定化酶 概述概述 固定化酶性质及影响因素固定化酶性质及影响因素 固定化酶的制备固定化酶的制备 固定化细胞的制备固定化细胞的制备4123 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶 酶反应器和固定化酶（细胞）应用酶反应器和固定化酶（细胞）应用65一.什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。为什么固定化 解决方案游离酶工业化应用的难点：固定化酶1.溶于水，难分离2.较脆弱，对环境要求高3.底物混进杂质，纯化困难4.一次性，不经济二.固定化酶发展史 1953年，Grubhofer和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌菌体，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。三.固定化酶的优点同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；反应结束后采用过滤或离心的方式，就可将固定化酶从反应液中分离，既简化了提纯工艺，又省去了热处理使酶失活的步骤，有利于控制生产过程；酶的稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型。四.固定化酶的缺点p首次投入成本高；p不适用于难溶于水底物和大分子底物第二节 固定化酶的性质及其影响因素1固定化对酶反应体系的影响2固定化酶性质的变化3评价固定化酶的指标4固定化酶活力测定方法1.固定化对酶反应体系的影响构象改变和立体屏蔽效应构象改变指酶在固定化过程中，由于酶与载体相互作用，使酶活性中心的构象发生变化，从而导致酶活下降。常见于吸附法和共价法立体屏蔽效应指由于载体对酶的活性中心造成空间障碍，因而底物无法与酶接触，从而影响没得活性。若在酶与载体间加入臂，则可得到改善1.固定化对酶反应体系的影响微环境微环境是紧邻固定化酶的环境区域，主体溶液则被称为宏观环境。液膜层宏观体系微环境1.固定化对酶反应体系的影响分配效应由于载体的亲水/疏水性质使酶的底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，进而影响了酶反应速度a)载体与底物带相同电荷，则酶Km值增大；带相反电荷则Km值减小；b)载体带正电荷，固定化后，酶活性的pH曲线向酸性方向偏移；反之则向碱性方向偏移c)采用疏水载体时，若底物为极性物质，则Km值增大，反之降低1.固定化对酶反应体系的影响扩散效应底物或其他效应物的迁移和转运收到限制的一种效应。a)外扩散效应：底物或其他效应物从宏观体系穿过包围，在固定化酶周围近乎停滞的液膜层到固定化酶表面所受的限制。可充分搅拌或混合而减小甚至消除b)内扩散效应：底物或其他效应物从固定化颗粒表面，来到颗粒内部酶活性中心而受到的一种限制。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主要原因。2.固定化酶性质的变化酶活下降，反应速度下降酶活变化的原因：2、固定化后的空间障碍效应的影响。3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻4、包埋法时高分子物质进入半透膜较困难1、酶分子在固定化过程中，酶的空间构像可能发生了变化，有时活性中心的氨基酸也会参加反应。a)固定化提高了酶构象的牢固程度b)阻挡了不利因素（变性剂，操作）对酶的侵袭c)限制了酶分子间的相互作用d)若固定化触及酶的某些区域，也会导致酶稳定性下降2.固定化酶性质的变化酶稳定性提高稳定性变化的原因：举例：热稳定性提高链霉蛋白酶55，120min全失活；用乙烯和马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%；用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存活50%。用DEAE-纤维素通过离子结合固定化转化酶在40下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一条件下存在100%。最适pH的变化载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。固定化酶扩散层偏酸，外部溶液pH向碱偏移才能抵消 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。产物为酸性，pH向碱性方向移动；反之则向酸性方向移动。2.固定化酶性质的变化对蛋白酶抗性提高可能是因为蛋白酶分子量大，受空间位阻影响，较难进入固定化酶中。氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20%，而将其固定于DEAE-纤维素上，在同样条件下，仍有80%活力。2.固定化酶性质的变化对变性剂抗性、贮藏及操作稳定性提高底物特异性变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特异性往往会变化。对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程：2.固定化酶性质的变化Km变化由于分配效应：=Si微环境/S宏观环境 固定化酶Km的变化随载体性质的变化载体与底物带相同电荷，SiS，Km，固定化酶降低了酶的亲和力。载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，则1，KmKm2.固定化酶性质的变化Km=Km/(表观米氏常数)2.固定化后酶稳定性提高的原因a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。3.评价固定化酶的指标：酶活（IU）：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。计量单位 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min=6*107IU酶比活（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位 品质的体现固定化酶的比活：每（g）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。操作半衰期：连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）衡量稳定性的指标。3.评价固定化酶的指标：3.偶联效率4.活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力3.评价固定化酶的指标：4.固定化酶活力测定方法间歇测定振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。与游离酶同样条件；酶活稳定时测量；速度不宜过快 酶和底物混合液震荡或搅拌测定酶活酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量。测定酶活测定酶活恒恒温温反反应应柱柱4.固定化酶活力测定方法连续测定第二节 固定化酶的性质及其影响因素影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标 酶本身的变化载体的影响固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同米氏常数Km的变化评价指标活力测定方法第三节 固定化酶的制备一 固定化方法选择的原则二 酶的固定化方法一 固定化方法简介 吸附法 包埋法 共价结合法 交联法 （1）酶的性质（2）载体的性质（3）便捷经济一 固定化方法简介选择依据1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固，有利于回收 3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化方法简单安全，载体来源充分，固定化成本低一 固定化方法简介选择依据1.测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。2.考察固定化酶稳定性3.考察固定化酶最适反应条件一 固定化方法简介品质检测二 酶的固定化方法（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法（entrapping method）(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。n选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2）有一定的强度 （3）便于装柱进行连续反应。(一)、吸附法常用载体：无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/g吸附剂有机载体：淀粉、白蛋白、纤维素、胶原以及火棉胶，一般吸附量几十mg蛋白/g吸附剂(一)、吸附法研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷举例：3.0g猪胰脂酶溶于100mL pH7.5的KH2PO4-NaOH缓冲液中，加入10g的大孔吸附树脂载体后，室温搅拌4h，过滤后置于干燥器内真空干燥至水分含量约20%。影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1.pH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。2.离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。3.蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。4.温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。(一)、吸附法5.吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。6.载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。(一)、吸附法吸附法特点：1.酶活损失少2.结合力较弱，有时酶会变性 （二）结合法1 离子键结合法2 共价键结合法离子键结合法：是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用（离子键）而达到酶固定化的方法。（二）结合法离子键结合法使用注意：pH、离子强度、温度举例：处理DEAE（二乙基氨基乙基）-葡聚糖凝胶（-OH型），0.1mol/L氨基酰化酶于pH7.0磷酸缓冲液，37，搅拌5h，可得固定化酶 离子吸附法常用载体：阴离子交换剂：酶带负电荷。DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite XE-97（聚甲基丙烯酸酯为骨架的大孔中极性吸附树脂）等；阳离子交换剂：酶带正电荷。羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。（二）结合法离子键结合法离子键结合法特点：较物理吸附牢固；载体可通过酸碱处理再生；同样易受pH、温度等影响。共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。（二）结合法共价结合法共价结合（偶联）法：酶蛋白N末端的-氨基、赖氨酸残基的-氨基、C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基、谷氨酸残基的-羧基、苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环、半胱氨酸残基的巯基、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基、组氨酸残基的咪唑基、色氨酸残基的吲哚基。最普遍的是氨基、羧基和苯环酶蛋白上可供载体结合的功能基团：（二）结合法共价结合法常用载体：天然高分子：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉、壳聚糖、胶原及衍生物等人工合成的高聚物：尼龙、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺衍生物等无机载体：多孔玻璃、金属氧化物等（二）结合法共价结合法常用载体及载体上常用的基团：载体上与酶偶联的基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基载体要求：亲水；有一定的机械强度和稳定性；同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团；很少有非专一性吸附；来源容易，能反复使用反应要求：1.偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。2.所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。3.要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。（二）结合法共价结合法共价结合法特点：1.酶与载体连接牢固，不易脱落2.反应条件严格，操作条件复杂3.活性中心易遭破坏共价键结合法制备固定化酶的“通式”首先载体上引进活泼基团 关键然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键（二）结合法共价结合法载体活化方法：A重氮法B叠氮法C烷基化反应法D硅烷化法E溴化氰法（二）结合法共价结合法A重氮法带芳香氨基侧链的载体，先用亚硝酸和稀盐酸处理成重氮衍生物，再在中性偏碱（pH8-9）的条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。重氮盐通常能与酶分子上酪氨酸的酚基或组氨酸的咪唑基形成相应的偶氮衍生物，也能有-氨基或-氨基与两分子重氮盐反应的双偶氮化合物该方法需要载体具有芳香族氨基目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等A重氮法反应示意式如下 载体：-硫酸酯乙砜基苯胺（ABSE）多糖A重氮法5-磷酸二酯酶的固定化。此酶可以在温和条件下非特异性水解DNA和RNA分子上的磷酸二酯键，可分离得到四个5-单核苷酸，用于核酸鉴定和DNA测序以及5-核苷酸生产（多种药物前提）本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶 A重氮法方法如下：1.纤维素-OH的活化：0.6%NaOH调pH13,加热85，30min2.醚化：先把SESA以1：2的水浸泡，在40时用1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣，以SESA：纤维素=1：1（干重）在pH13，85，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。A重氮法3.去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无色）4.重氮化盐制备：用5%NaNO2及1MHCl在10以下反应15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即成。5.偶联：先在酶液中加入硫酸铵（1：0.007）,然后调pH值6.5，加入经重氮化的ABSE-纤维素，再调PH 值7.0，在冰浴中反应两小时，过滤，洗涤抽干即为固定化酶，A重氮法B叠氮法将带有羧基、羟基或羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理，实质酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成跌单衍生物。可在低温下与酶蛋白的羟基、酚基或巯基反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与-NH2反应。B叠氮法将带有羧基、羟基或羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理，实质酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成跌单衍生物。可在低温下与酶蛋白的羟基、酚基或巯基反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与-NH2反应。此法常用载体有羧甲基纤维素，羧甲基葡聚糖凝胶（CM-Sephadex），聚天冬氨酸等用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。B叠氮法叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2%HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3%NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5搅拌2-3小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）B叠氮法C烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物（卤代芳香环或卤代杂环高聚物）在碱性条件下进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应。烷基化反应：有机化合物分子中的C、Si、N、P、O、S原子上引入烃基（烷烃、烯烃、芳香烃等）D硅烷化法本法进行酶的固定化可分三个步骤：将载体接上一个结合剂（也即硅烷化）再接上功能基团 把酶共价结合于载体重氮法的延伸，将由硅氧组成的载体活化，再经亚硝酸盐和稀盐酸处理生成重氮盐，再与酶进行偶联D硅烷化法多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。这些多孔玻璃的孔径在2501000埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1克所拥有的表面积达100平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热处理原子重组而成，是优良载体，但必须加以改造）。D硅烷化法载体活化：硅烷化D硅烷化法载体活化：接上芳香氨基基团D硅烷化法载体活化：重氮化与酶共价偶联E 溴化氰法用溴化氰（CNBr）在碱性条件下活化多糖类物质，载体的羟基与CNBr 反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下可与酶分子的氨基偶联。常用多糖载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。溴化氰亚氨碳酸基偶联法OHOHBrCNH2OOOC=N-EO-CO-NH-EOHO-C-NH-E NHOHH2N-E（多羟基载体）O-CONH2OH（惰性）OOC=NH（活泼）OC NOH亚胺碳酸基E 溴化氰法（三）交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。（三）交联法常用试剂常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)交联法一般步骤：第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。席夫碱：是指含有亚胺或甲亚胺特性基团（RC=N）的一类有机化合物，通常席夫碱是由胺和活性羰基缩合而成 OHC(CH2)3CHO戊二醛H2N-EN-HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N-E-NCHCH（三）交联法戊二醛交联法（三）交联法的形式交联法有4种形式：酶直接交联法酶辅助蛋白交联吸附交联法（壳状固定化酶）交联包埋法1.酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。将0.2%木瓜蛋白酶和2.3%戊二醛在pH5.2-7.2，0条件下反应24h，便可完成交联反应，生成不溶性固定化酶。2.酶辅助蛋白交联为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。交联过程中因化学修饰酶失活，或酶量有限时，可用该交联方法将100mg脲酶与2.5ml含8%白蛋白，2%戊二醛0.02mol/L pH7磷酸缓冲液混合，冷却到-10，然后在冰箱中缓慢升到4，放置4小时后，将形成的泡沫状聚合物彻底洗涤，冷却后粉碎即成固定化酶。3.吸附交联法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。得到的固定化酶也可称为壳状固定化酶。载体的选择性吸附有一定的纯化作用，尤其适用于用发酵液或粗酶液直接固定。酶分子间的共价交联是其能较牢固地结合于载体上，且酶分子分布于载体表面，使酶与底物接触良好。4.交联包埋法把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。交联包埋法可以避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。（四）包埋法定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。方法：聚合物单体与酶溶液混合，再借助于聚合助剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。操作简单，条件温和，很少改变酶的结构，酶活较高，适用于大多数酶及微生物细胞。缺点是只有小分子底物和产物能透过凝胶网络，对大分子底物不适用，同时凝胶网络扩散阻力较大，可降低酶活。按类型分为网格型和微囊型将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。常用聚合物有聚丙烯酰胺、海藻酸、角叉菜胶等酶包埋在聚合物的凝胶格子中，格子的结构可以防止酶渗出于周围培养体中，但是底物仍能渗入这格子内与酶相接触，使之处在不脱离状态下，达到固定化酶的目的。可将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以将酶包埋在珠状聚合物中。1网格型包埋法聚丙烯酰胺最常用的包埋载体之一：聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺和双体交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成的。丙烯酰胺和双丙烯酰胺都是有毒的，但聚丙烯酰胺凝胶通常认为是无毒的。先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入催化剂使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。优点：聚丙烯酰胺凝胶机械强度高，有弹性，透明，化学稳定性好，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶解；可以通过改变浓度和交联度，在广泛的范围内调整孔径大小；在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以改善酶脱落的情况。1网格型包埋法常用载体酶酶1网格型包埋法常用载体海藻酸钠也是最常用的包埋载体之一，它从海藻中提取出来，完全无毒，不能被绝大多数微生物分解，或者作为底物，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，形成的凝胶机械强度中等较强，固定化方法操作简单经济。海藻酸钠易与蛋白质、明胶、淀粉等共溶，因此海藻酸钠溶液能与细胞、酶形成均匀悬浮液，使固定其中的酶或细胞分布均匀。海藻酸钙凝胶加酸则又形成海藻酸析出，酶或细胞可释放出来，便于进行其他实验1网格型包埋法常用载体K-角叉菜胶（卡拉胶）是从海藻中提取出来的一种多糖，冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好，半衰期长，固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。明胶是一种胶体，是从骨、肌腱、生皮、膜及其他动物结缔组织的生胶质（胶原）中提取出来的蛋白质，是由胶原水解而制得，没有固定的分子量和结构。将酶加到胶原或明胶悬浮液中，铺膜、干燥即得固定化酶。其他常用载体还有淀粉、天然血纤维（酶、血纤蛋白原和凝血酶混合）、大豆蛋白等2微囊型包埋法将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。（1）界面沉淀法 是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。（2）界面聚合法 是将疏水性单体和亲水性单体在界面进行聚合，将酶包埋于半透性聚合体中的方法。（3）表面活性剂乳化液膜包埋法 是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。2微囊制备方法 界面沉淀法这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。常见的高聚物有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯化橡胶等。例：含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水互不相溶、沸点比水滴的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀形成膜，最后移至水相，从而制成固定化酶 界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。所得的微囊外观好，制备所需时间短，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。制备方法一般是：将酶的水溶液与亲水单体用一种水不溶的有机溶剂制成乳化液，再将酶溶于同一有机溶剂的疏水单体溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化，这样水相中的酶便包埋在聚合体膜内 界面聚合法有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂酶酶洗去有机溶剂，洗去有机溶剂，去除未聚合单体去除未聚合单体半透膜半透膜固定化酶方法研究热点1 热处理法：通过加热处理，将酶固定在细胞内的方法。将含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60-65处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内2 结晶法：交联酶聚集体（酶结晶），载体就是酶本身。优点：酶活性、稳定性高，成本低廉，设备简单；缺点：反复使用中损耗大3 分散法：将酶分散于水不溶相中从而实现固定化。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶的干粉悬浮于溶剂中，这样不仅实现了酶的催化作用，而且可以通过过滤和离心将酶分离，进而实现酶的再利用。各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法 交联法包埋法物理吸附共价键结合离子键结合 制备难易易难易 较难较难固定化程度弱强中等 强强活力回收率较高低高 中等高载体再生可能不可能可能 不可能不可能费用低高低 中等低底物专一性不变可变不变 可变不变适用性酶源多较广广泛 较广小分子底物、药用酶Thank You!Gly 甘氨酸 亲水性 75.07 6.06 2.35 9.78-HAla 丙氨酸 疏水性 89.09 6.11 2.35 9.87-CH3Val 缬氨酸 疏水性 117.15 6.00 2.39 9.74-CH-(CH3)2Leu 亮氨酸 疏水性 131.17 6.01 2.33 9.74-CH2-CH(CH3)2Ile 异亮氨酸 疏水性 131.17 6.05 2.32 9.76-CH(CH3)-CH2-CH3Phe 苯丙氨酸 疏水性 165.19 5.49 2.20 9.31-CH2-C6H5Trp 色氨酸 疏水性 204.23 5.89 2.46 9.41-C8NH6Tyr 酪氨酸 疏水性 181.19 5.64 2.20 9.21 10.46-CH2-C6H4-OHAsp 天冬氨酸 酸性 133.10 2.85 1.99 9.90 3.90-CH2-COOHAsn 天冬酰胺 亲水性 132.12 5.41 2.14 8.72-CH2-CONH2Glu 谷氨酸 酸性 147.13 3.15 2.10 9.47 4.07-(CH2)2-COOHLys 赖氨酸 碱性 146.19 9.60 2.16 9.06 10.54-(CH2)4-NH2Gln 谷氨酰胺 亲水性 146.15 5.65 2.17 9.13-(CH2)2-CONH2Met 甲硫氨酸 疏水性 149.21 5.74 2.13 9.28-(CH2)-S-CH3Ser 丝氨酸 亲水性 105.09 5.68 2.19 9.21-CH2-OHThr 苏氨酸 亲水性 119.12 5.60 2.09 9.10-CH(CH3)-OHCys 半胱氨酸 亲水性 121.16 5.05 1.92 10.70 8.37-CH2-SHPro 脯氨酸 疏水性 115.13 6.30 1.95 10.64-C3H6His 组氨酸 碱性 155.16 7.60 1.80 9.33 6.04 Arg 精氨酸 碱性 174.20 10.76 1.82 8.99 12.48