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40-免疫分型教程(1)正常骨髓免疫分型 上图是正常骨髓经CD45、CD71、CD33染色后组成的CD45/SSC、CD71/CD33双参数散点图；通过这两个组合，能够分辨骨髓的正常细胞、检查是否有异常细胞存在、评估细胞的成熟情况。CD45/SSC图中可见：1，CD45强阳性SSC低信号的细胞群为淋巴细胞（褐色细胞群体）；2，中等强度的CD45表达，SSC信号最强的细胞群体为粒细胞（蓝色及红色细胞群体）；3，CD45表达与SSC信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体（绿色细胞群体）；4，CD45阴性，SSC信号最低的有核红细胞和细胞碎片；CD33/CD71图中可见：1，CD33表达最强的单核细胞群体（绿色）；2，粒细胞CD33表达较单核弱，不成熟粒表达CD71，成熟后不表达。3，淋巴细胞、有核细胞和细胞碎片不表达CD33、CD71。CD11B/CD15图可用来评估髓系细胞向单核、粒分化的程度（随着髓细胞成熟，细胞逐步获得CD11B，粒细胞高表达CD15）：1，单核细胞（绿色）高表达CD11B，CD15中等到表达；2，粒细胞（蓝色及橘红色）高表达CD15，蓝色成熟粒CD11B表达较橘红色不成熟粒细胞强，幼稚髓细胞仅表达CD15而无CD11B。3，T、B淋巴细胞不表达CD15、CD11B，NK细胞表达CD11B而无CD15（红色细胞）。4，有核红细胞及碎片不表达CD15和CD11B。 根据骨髓细胞CD45/SSC图中分布情况设门圈定各类细胞：R1门为成熟淋巴细胞；R2门为正常单核细胞位置；R3门正常粒细胞位置；R4门为幼稚淋巴细胞出现位置；R5门为有核红细胞或细胞碎片位置；R6门为幼稚髓细胞出现位置；白血病细胞通常会在R4、R6两门位置处出现。M0免疫分型M0:急性髓细胞白血病微分化型 原始细胞在光镜下类似L2型细胞,核仁明显,胞浆透明,嗜碱性,无嗜天青颗粒及Auer小体,髓过氧化酶(MPO)及苏丹黑B阳性细胞3%的幼稚细胞表达MPO，较M0多。不表达CD11B，CD15，CD16等。M1:CD11B-/+,HLA-DR+,CD13+,CD33+,CD34+,CD14+,MPO+,TdT-/+to+/-M2免疫分型CD45/RALS图中细胞分布广泛与M1不同，这是因为M2细胞已进一 步分化幼稚细胞减少，粒细胞增多并与BLAST WINDOWS区域内细 胞相连。因细胞没有明显分群，很难将异常细胞与正常相区分， 故设立多个门进行分析检测其成熟度抗原的表达情况。M2免疫表型与M1类似，HLA-DR，CD33，CD13阳性。上图中可见 幼稚细胞CD33与CD71表达均比成熟粒细胞强。CD13表达强于CD33。M2肿瘤细胞弱表达CD15与CD11B,说明细胞已分化。 CD34表达显著降低。M2肿瘤细胞不表达CD5,CD7和TdT等抗原，如病例伴t(8;21),则 经常表达CD19偶表达CD56。一般肿瘤细胞MPO强阳性。偶见形 态为M2并伴t(8;21)，但CD13-，CD33-，CD14-，而MPO+。细胞分布广泛，幼稚细胞较M1少。CD13和CD33阳性，且CD13表达高于CD33。HLA-DR阳性，CD15弱阳性。M2肿瘤细胞伴t（8，21）CD19阳性。M3免疫分型上图为M3V，少颗粒型早幼粒白血病细胞，细胞中颗粒少RALS信号 低而集中，SS座标上出现大量肿瘤细胞。肿瘤细胞大，FS信号强。 通过CD45/RALS双参图可辨别出M3与M3V。下为经典M3多颗粒细胞的 CD45/RALS和SS/FS图。M3与M3V在免疫表型上无区别。M3肿瘤细胞特征性地不表达髓系早期标志物CD34和HLA-DR；部分病例中CD9特征性地阳性，但不是完全特异。CD2在M3与M3V中会出阳性表达，在HLA-DR阴性的病例中，与染色体t(15,17)异常相关。肿瘤细胞CD33表达比正常粒细 胞强与正常单核细胞相似， CD13表达多样。肿瘤细胞不表 达晚期髓细胞分化抗原CD15， CD16和CD11B。肿瘤细胞完全不表达CD15，与正常早幼粒细胞表达CD15相区别；正常早幼粒细胞细胞周期中含高比例S期细胞，而肿瘤细胞中几乎不见细胞周期。肿瘤细胞MPO阳性，上图中MPO与LACTOFERIN双染来区分成熟粒 细胞。肿瘤细胞除表达CD2外，很少表达T或B系抗原。M3肿瘤细胞因其胞浆内多颗粒，细胞具有很强的自发荧光。M3:CD33+,CD13+,MPO+,CD34-,HLA-DR-,CD11b-,CD14-,CD15-,TdT-M4免疫分型典型的M4病例CD45/RALS图中会出现一群异常的单核细胞和一群骨髓幼稚细胞，肿瘤细胞较M0，M1细胞的FS和SS信号增强。有时这两群细胞会相互叠加占据BLAST WINDOWS和成熟单核细胞位置，故难圈出独立成群的肿瘤细胞。对于M4病例一般都设多个门对异常细胞进行分析，且每个异常细胞群根据其成熟度的不同，表型也可能互不相同。本例为M4EO，增多的嗜酸细胞RALS信号与早幼粒相似CD45信号与单核细胞相似，本例中为R4门中紫色细胞。幼稚细胞群表达CD34，HLA-DR，而异常单核细胞则CD34阴性，HLA-DR阳性。幼稚细胞CD33阳性，CD14阴性，而异常单核细胞则为CD33阳性，CD14，CD64阳性。CD64表达如象本图中强阳性表达则为单核细胞特异性标志。M4肿瘤细胞在CD11B/CD15图中会特征性分布如上，存在幼稚细胞及各期的粒细胞及单核细胞。CD2表达与M4EO有很大相关性，可能与16号染色体异常有关。M4/blast population: CD13+,CD33+,CD34+,HLADR+,CD11b-,CD14-M4/abnomal monocytic cell:CD13+,CD33+,CD34-,HLA-DR+,CD11b+,CD14+/-,CD4+/-M5免疫分型M5肿瘤细胞从细胞大小、颗粒度和CD45表达都向成熟单核细胞过渡，形成一大细胞群体。M5分为二个亚型M5a和M5b，前者细胞稍大，与成熟单相比CD45表达弱但不独立成群。髓系细胞的分化情况可从CD15/CD11B双参数图中观察,本例中肿瘤细胞CD15较平常高,但低于右上角黑色的粒细胞.不成熟的单核细胞CD11B表达弱.如出现CD33阳性，CD13，CD34阴性。M5肿瘤细胞通常高表达CD33，CD13表达多样。CD4是髓系幼稚细胞向单核系分化的敏感指标。CD14一般表达在成熟单核细胞上，本例中肿瘤细胞CD14阴性，CD64阳性。AMML病例中，CD64在单核细胞上表达特别强。本例中CD61弱阳性,这种情况是由于幼稚细胞与血小板粘附造成的。M5a: HLA-DR+,CD11b+/-,CD34+,CD33+,CD13+,CD14-/+,CD4+/-M5b: HLA-DR+,CD11b+,CD34-,CD13+,CD16+/-,CD14+,CD4+/-M6免疫分型本例中可见两群幼稚细胞，M6的定义是红系祖细胞占骨髓幼稚细胞群体的50%强，而其他系别的幼稚细胞可占30%以上。固诊断M6时要依据形态学红系细胞的数量来确定，如仅根据免疫分型很难得出正确诊断，必须结合形态计数幼稚细胞数量来确定。以上是典型的M6免疫分型图，出现两群幼稚细胞。肿瘤细胞可通过CD71强阳性表达加以确认，在一些红细胞稍成熟病例中血型糖白A阳性。HLA-DR，CD34和CD33或CD13通常阳性。很多M6病例中会出现一群髓系幼稚细胞，如本例中的红色细胞群体。M6;CD71+,GP-A+,CD34+/-,HLA-DR+/-,CD13+/-,CD33+/-,CD34+/-,CD14-,CD11b-M7免疫分型本例中幼稚细胞CD45/RALS信号都不强。与B-ALL，M6的肿瘤细胞相似。M7肿瘤细胞表达CD61和CD41，髓系抗原表达多样。成熟血小板粘附地白细胞也会表达CD41和CD61，这时会对诊断产生影响，此时要加做CD62来确认是否为成熟血小板粘附造成CD41或CD61阳性。本例CD34阳性，CD71弱阳，其他系别抗原不表达。其他系别抗原均为阴性，与M0、M1相似。M7:HLA-DR+,CD34+,CD33+/-,CD14-,MPO-,TdT-TALL 免疫分型T-ALL的肿瘤细胞CD45表达较B-ALL细胞强，肿瘤细胞在CD45/SSC图中可能会出现在BLAST WINDOWS或单核细胞区或 与正常淋巴细场胞相混。本例中肿瘤细胞CD10阳性，约三分之一的T-ALL会出现该 现象，但CD19绝对阴性。本例CD34阳性，约40%的T-ALL的肿瘤细胞CD34阳性，与细胞是否表达原始或成熟表型无关。T-ALL肿瘤细胞表面CD3经常阴性,但如用PE标记的CD3抗体则经常能检测到弱阳性。CD3/CD5双参数图中，肿瘤细胞总出现在正常T细胞以外的位置上,上图中黑色阳性颗粒为正常T细胞.肿瘤细胞CD4/CD8表达多样化,但是总与正常T细胞的表达不两只,如发现CD4/CD8双阳性则提示为T-ALL。T-ALL最敏感的指标是CD7,但其特异不强有近30%的AML同样阳性。当CD7与HLA-DR联用时其特异性增强，许多T-ALL，特别是在儿童，CD7强阳性而不表达HLA-DR，而在AML中CD7弱表达并伴HLA-DR阳性。T-ALL因与T细胞的成熟度相关，可被分为三期：pre-thymic：CD7+，CD1a-，CD4/8-，CD3-；thymic:CD7+，CD4/8+，CD3-；matrue:CD3+,CD1a-;原始T细胞ALL与AML很难区分，要加测胞浆内CD3。T-ALL最常见的表型是：CD2，CD5，CD7，CD1，CD4/8双阳性，CD3弱阳性，TdT强阳性。次其次为：CD2，CD5，CD7 和TdT强阳性。再次为：CD2，CD5，CD7伴CD4或CD8部分表达，CD3表达少并少量表达TdT。T-ALL的共同特征是：下调表达T系抗原或出现异常抗原的联合表达。B ALL免疫分型急性B淋巴细胞性白血病可大致分为早前B-ALL，前B-ALL和成熟B-ALL，区分他们的依据是免疫球蛋白的表达及其表达位置。 具体情况如下：1,成熟B细胞ALL表达表面免疫球蛋白（sIg）2,前B细胞ALL细胞胞浆内表达免疫球蛋白重键(cu)而不表达轻链3,早前B-ALL则两者都阴性然而上述情况在用于诊断B淋巴细胞性白血病时常出现混淆。因为胞浆内免疫球蛋白重链cu在诊断过程中很少被检测，从而那些表面Ig阴性的病例全都被归于前B-ALL。早前B细胞型（B-precursor or early pre-B）占儿童急淋的65%左右，占成人的50%左右。 白血病细胞，根据形态对应FAB的L1或L2型，处于B细胞成长的最原始阶断。 细胞小而无颗粒，流式细胞分析期细胞的前向和侧向光信号很弱；特异性地，其细胞表面或胞浆内不表达免疫球蛋白。 白血病细胞通常至少部分地表达干祖细胞抗原CD34和不成熟淋巴细胞抗原HLA-DR或TdT。 另外，少数罕见病例会同时表达CD10和B细胞相关抗原CD19。其他在早前B细胞型白血病细胞上表达的 B细胞抗原有CD9，CD22和CD24；这些抗原通常在B细胞成熟的中晚期才表达。 CD20也是一具有广泛意义的抗原，但它的表达变异很大，会经常出现CD20阴性的细胞；这种混合型表达CD20与以CD20集中地、高表达的成熟B细胞有很大的区别。早前B白血病细胞的免疫表型与正常原B细胞很相似，但白血病细胞抗原的异常表达常会出现：同时异常地表达早期和成熟抗原，异常地抗原交叉表达（特别为髓系抗原），或最常见的为抗原表达的强度变化。在儿童ALL中，早前B细胞白血病的免疫分型与疾病预后有很大的相关性，除CD10阴性的肿瘤特别是婴儿，其预后一般较好。 婴儿CD10阴性的白血病事实上经常会出现染色体11q23异常,从而导致MLL基因重排，预后差。其他11q23异常的白血病可出现的免疫表型包括表达髓系抗原CD15并失去抗原CD24。 白血病细胞通常会表达CD34和其他一些髓系抗原，但表达情况多变。 除表达髓系抗原外，细胞还会强表达B系抗原CD19。 其他一些预后比较差的如t(9;22)并由此而形成BCR-ABL融合基因病例，这种情况多见于成人ALL，而儿童相对少见，由引可解释为什么成人ALL的预后较儿童的差。 Ph1染色体阳性的病例经常会表达髓系抗原，这与CD34、CD10、CD19和CD25表达有重要关系，但目前尚无相关性的统计数据来定义此亚型。 一些儿童早前B细胞白血病预后特别好，除上述病例中超二倍体肿瘤以外，那些伴t(12;21)(p21;q22)的病例预后也较好。这些易位产生了融合基因TEL/AML1，并主要见于种早前B细胞白血病，并且好发于1-10岁的儿童。流式免疫分型发现，这些病例特异地强表达CD19，CD10和HLA-DR，并会出现双峰表达CD34，部分细胞表达或失去CD9，部分细胞弱表达CD20。CD66c（KORSA-3544）一致地不表达。CD10高表达伴CD9和CD20弱表达与TEL/AML1融合基因的产生有紧密关系。B-precursor-ALL的肿瘤细胞FS/SS信号弱，CD45表达也不强，有些病例的肿瘤细胞在CD45/SSC图中与有核红细胞位置相当。B-precursor-ALL对应于FAB分型的L1和L2型。B-precursor-ALL的肿瘤细胞CD10/CD19强阳性，CD33弱阳性如使用PE标记的CD33抗体检测阳性增强但不可据此判定为混合型白血病。通常根据CD10表达与否可将B-precursor-ALL分为两亚型：CD10+和CD10-，CD10+的病人预后较好B-precursor-ALL与B-cell-ALL的区别在于肿瘤细胞表面是否表达免疫球蛋白轻链。PRE-B-ALL胞浆重链阳性而表面免疫球蛋白轻链阴性。如同CD19，HLA-DR在B-ALL中也广泛表达，但它没有特异性。其他有用的指标有CD22和CD20，前者几乎与CD19有相同的特异性而后者弱。CD24在许多B-ALL中表达，但它在一些AML也表达。在B-ALL中常见表达但没有系别特异的抗原有CD10和CD34。CD34阳性在B-precursor-ALL中常见，而在Pre-B或B-ALL则 通常为阴性。前B细胞性ALL，被定义为胞浆内u重链阳性，细胞处于B细胞成熟的后期阶段。 前B细胞ALL大概占儿童ALL的25%，在成人ALL中的比例很低。与这一亚型相关的是t(1;19)并产生E2A/PBX1融合基因，并因此而发生耐药，预后较差。 前B 细胞白血病大概有25%的病例有t(1;19)异位，但在原B细胞白血病中少见。 ALL伴t(1;19)强表达CD19，CD10和CD9并CD34阴性，而CD20经常缺失或弱表达，这样就形成了一个很特异的免疫表型。大概60%表现以上表型的病例经分子生物学检查发现E2A/PBX1融合产物。而在其他免疫表型中未见此基因重排。流式细胞分析可成为分子生物学分析的重要初筛工具。成熟B细胞性白血病占全部ALL的2%-5%并包含Burkitts淋巴瘤性白血病。在形态学上其对应FAB的L3型，具有比幼稚的B系原始细胞高的光散射信号。 它们同时具有较强的CD45表达，从而这些细胞在CD45 vs RALS双参数图中位置接近于更成熟的淋巴细胞和单核细胞。 成熟B白血病细胞其胞浆膜上强表达Ig。并表现为一致的CD19，CD20，CD22和CD24高表达，但CD34和TdT为阴性。许多病例CD10可阳性，但因其同时表达成熟抗原和sIg可用来把成熟B细胞ALL与其他不成熟B细胞ALL区分开来。