细胞培养基质量标准及检验方法.doc

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细胞培养基质量标准及检验方法

中国医药生物技术协会
二0一一年四月

编写说明

一、 根据中国医药生物技术协会2010年9月20日 组织召开的《动物细胞培养基生产管理及质量控制学术研讨会》纪要，结合我国的实际情况制定本标准。
二、 本标准以《中国药典》2010版和《哺乳类动物细胞培养基》（HG/T 3935-2007）行业标准为依据，结合生物制品对细胞培养基原材料的特殊要求制定，增加了牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量等检测项目。
三、 本标准分为细胞培养基检验项目和每个项目的检验方法两部分，为评判细胞培养基产品质量提供了依据和方法，从而规范我国细胞培养基行业健康发展。
四、 结果评定
依据本标准和方法对细胞培养基样品进行全项检验，所有项目均符合标准要求，判定该样品为合格；若有一项不符合标准要求，则判定样品为不合格。

细胞培养基质量标准及检验方法
一、 细胞培养基质量标准
细胞培养基质量应符合表1所示的技术要求。
表1 技术要求
检验项目
限度要求
检验方法
澄清度
澄清
中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ B进行。
pH值（每升标示量/L）
pH允许偏差范围为±0.30
中华人民共和国药典2010年版附录Ⅵ H进行。
渗透压（mOsm/kgH2O）
渗透压允许偏差范围为±5％
中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法进行。
干燥减量的质量分数（%）
≤5.0
按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进行。
细菌内毒素（EU/ml）
≤10
按中华人民共和国药典2010年版附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。
微生物限度
细菌数（CFU/g）
≤200
按中华人民共和国药典2010年版附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。
霉菌数（CFU/g）
≤50
细胞生长试验（vero细胞）
细胞形态
成纤维样贴壁生长，形态正常无变异
按中华人民共和国化工行业标准《哺乳类动物细胞培养基》HG/T 3935-2007第7.7条进行。
细胞数量
培养72h细胞数量不低于1×105cells/ml；继续维持48h细胞数量不低于1×105cells/ml
牛血清白蛋白
不得检出
依据中华人民共和国药典2010年三部附录Ⅷ I牛血清白蛋白残留量测定法进行，不得检出牛血清白蛋白。
抗生素
不得检出
依据中华人民共和国药典2010年三部附录Ⅸ A抗生素残留量测定法进行，不得检出青霉素、链霉素及庆大霉素。

二、 检验方法
除非另有说明，检验中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2010年版中规定的纯化水。
2.1 澄清度的测定
称取每升标示量的实验室样品，置于1 000ml烧杯中，加水950ml，搅拌至溶解，补加水至1000ml, 搅拌均匀。按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ B进行。
2.2 pH值的测定
称取每升标示量的实验室样品，置于1 000ml烧杯中，加水950ml，搅拌至溶解，补加水至1000ml, 搅拌均匀。按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤA进行。
2.3 干燥减量的测定
按中华人民共和国药典2010年版三部附录Ⅶ L 干燥失重测定法进行。
2.4 渗透压的测定
称取每升标示量的实验室样品，置于1 000ml烧杯中，加水950ml，搅拌至溶解，补加水至1000ml, 搅拌均匀。按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤH渗透压摩尔浓度测定法进行。
取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。
2.5 细菌内毒素的测定
按中华人民共和国药典2010年版三部附录Ⅻ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。
2.6 微生物限度的测定
按中华人民共和国药典2010年三部附录Ⅻ G微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。
2.7 细胞生长试验
2.7.1 贴壁型细胞生长试验
2.7.1.1 方法提要
1)本试验所用容器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。
2)细胞在37℃恒温条件下，在含体积分数3%或10%的小牛血清的细胞培养液中生长72h，观察细胞形态并进行细胞计数；细胞生长72h后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养48h，观察细胞形态并进行细胞计数。
2.7.1.2 试剂和材料
1)牛血清：符合中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅩⅢ D。
2)平衡盐溶液：称取氯化钾0.2g，精确至0.01g；无水磷酸二氢钾0.2g，精确至0.01g；氯化钠8.0g，精确至0.01g；无水磷酸氢二钠1.15g，精确至0.001g；加纯化水1 000ml，混匀，测pH值，pH值应在7.5±0.3，过滤除菌即得。
3)细胞：vero细胞（或根据不同的细胞培养基种类选择适应的细胞):细胞代次不超过150代。
4)细胞培养液：按产品使用说明书要求配制；
3)胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶（1:250）2.5g，精确至0.01g，加1 000ml平衡盐溶液，混匀、测pH值，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl 调pH值7.6～7.8，过滤除菌即得。
2.7.1.3 仪器
1）医用净化工作台：洁净级别为百级.
2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）％，能在（37±1）℃恒温。
3）细胞培养瓶：T25型、无菌。
4）显微镜：倒置、相差。
5）血球计数板。
6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。
2.7.1.4 试验步骤
1）制备细胞悬液
A取长成致密单层的细胞种子，将原细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用适量平衡盐溶液洗细胞一次，弃洗液（去除死细胞）。
B向细胞培养瓶内加入胰蛋白酶溶液1ml，消化一定时间，在显微镜下观察,当细胞变圆接近脱壁时，将胰蛋白酶溶液倒掉。
C根据细胞数量加入一定量细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱壁制成细胞悬液A。
2) 细胞培养
A 吸取一定量的细胞悬液A，加到细胞培养瓶内。
B 向细胞培养瓶内加至10ml含体积分数为3%或10%的小牛血清的细胞培养液，使细胞接种数量为5×104细胞/ml。
C 将细胞培养瓶送入培养箱，在（37±1）℃温度条件及（5±0.1）％二氧化碳条件下进行培养。
D 培养72h，观察细胞形态，按照2.7.1.4步骤1）方法制备细胞悬液，进行活细胞计数。
E 培养72h后，更换不含牛血清的细胞培养液10ml，继续培养48h，观察细胞形态，按照2.7.1.4 试验步骤1）方法制备细胞悬液，进行活细胞计数。
3) 细胞计数
A 将需要计数的细胞按按照2.7.1.4步骤1）方法制备细胞悬液B。
B 吸取细胞悬液B100μl转移至离心管中，视细胞量确定是否稀释及稀释倍数。
C 将盖玻片盖于计数板中心的计数室上方。调整计数板中的细胞数量在（100～300）个。沿盖玻片边缘点加细胞悬液使其通过毛细作用自然渗入，不要留有气泡，不要外溢，显微镜下计数。
D 观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，一般遵循“计左不计右，计上不计下”的原则。将计数板观察细胞数代入下列公式：
计数板观察细胞数×104 ×稀释倍数/4＝细胞数/ml
2.7.1.5分析结果的表述
培养72h的细胞，细胞形态应正常，活细胞数量应达到1×105个/ml以上。继续维持培养48h的细胞形态应正常，活细胞数量应不小于1×105个/ml以上。
2.7.2 悬浮型细胞生长试验
2.7.2.1 方法提要
本试验所用容器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。
细胞在37℃恒温条件下，在细胞培养液中悬浮生长72h，观察细胞形态，进行72h细胞计数。
2.7.2.2 试剂和材料
1）细胞：已适应待检细胞培养基的悬浮细胞株。
2）细胞培养液：按产品使用说明书要求配制；
2.7.2.3仪器
1） 医用净化工作台：洁净级别为百级；
2） 恒温震荡培养箱：能在（37±1）℃恒温；
3） 细胞培养瓶：250ml 摇瓶，应无菌；
4） 显微镜：倒置、相差；
2.7.2.4 细胞培养
1）用方瓶或摇瓶扩增细胞；
2）离心细胞，用待测细胞培养液重悬细胞，计数，计算出所需要的细胞数；
3）将细胞转至摇瓶中，细胞数量接种数量为2.5×105个/ml，加液量20ml左右；
4）将摇瓶细胞移至恒温培养箱中培养，转速90～100rpm，温度37℃；
5）培养72h，记录细胞数量和活率（采用0.4%的台盼蓝染色法计数及计算活率）。
2.7.2.5 细胞活率计算
1） 细胞染色：取吸管1支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液1份，再滴入台盼蓝染液1份，混匀，置2～3分钟。
2） 计数：按2.7.1.4步骤 1）进行。镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为死细胞。记录活细胞数及细胞总数。
3）活率计算 细胞活率% =（活细胞数量/细胞总数）×100%
2.7.2.6 分析结果的表述
悬浮培养72h的细胞形态应正常，培养72h细胞数量应达到1.0×106个/ml以上,活率应达到90%以上。
2.8 牛血清白蛋白残留量
依据中华人民共和国药典2010年三部附录Ⅷ I牛血清白蛋白残留量测定法进行，不得检出牛血清白蛋白。
2.9 抗生素残留量
依据中华人民共和国药典2010年三部附录Ⅸ A抗生素残留量测定法进行，不得检出青霉素、链霉素及庆大霉素。

整理文本