贵州六盘水地区大叶黄杨叶枯病病原菌鉴定.pdf

37农业灾害研究 2023,13(8)贵州六盘水地区大叶黄杨叶枯病病原菌鉴定王瑞仙1，田 霜1，鲁武锋1，方英艺1，张孝敬1，安传相1，谭 莉1，杨友联2*1.凤冈县农业农村局，贵州凤冈 564200；2.六盘水师范学院 生物科学与技术学院，贵州六盘水 553004摘要 对贵州省六盘水市采集到疑似叶枯病的大叶黄杨病叶进行病原菌鉴定，采用孢子稀释法共分离到2类纯化菌株。对2类纯化菌株进行科赫氏验证，确定其为大叶黄杨叶枯病致病菌。通过形态学结合多基因（ITS、-tubulin、tef-1）分子系统学鉴定，表明2类纯化菌株均为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis），其中菌株LPSU2015001鉴定结果为Pestalotiopsis intermedia，菌株LPSU2015002暂定为Pestalotiopsis sp.，这在大叶黄杨叶枯病防治及植物育种方面具有重要的实践意义，且丰富了真菌资源。关键词 大叶黄杨；叶枯病；拟盘多毛孢属；多基因分子系统学中图分类号：S763.7 文献标识码：B 文章编号：20953305(2023)080037-04大叶黄杨（Euonymus japonicus Thumb）具有一定的观赏价值和生态价值，是园林绿化中的常见植物。由于其叶部病虫害发生普遍，常造成植株死亡，影响了其在园林绿化中的应用价值。目前，对大叶黄杨白粉病、大叶黄杨褐斑病（叶斑病）和大叶黄杨炭疽病的研究较为深入，病原菌分别为正木粉孢霉（Oidium euonymi-japonicae Sacc）、坏损尾孢（Cer-cospora destructive Rav）、胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）1-2。但还没有对大叶黄杨叶枯病病害系统、全面的研究报道。李庚花等3研究发现大叶黄杨叶枯病的病原菌为半知菌亚门盘多毛孢属，而贲海燕4发现引起大叶黄杨叶枯病的病原菌为黄杨叶点霉，但该病原菌的形态结构与李庚花等报道的差别较大。上述研究均只采用了形态学鉴定的方法，且研究结果存在争议。因此，采用新技术手段进一步探索大叶黄杨叶枯病的病原菌，明确大叶黄杨叶部病害种类及其防控策略尤为 重要。研究发现，应用分子生物学技术可更加准确地鉴定病原菌种类，其中因核糖体转录间隔区序列（ITS）在众多基因序列中最容易被扩增及测序，已广泛应用于病原真菌检测5。但ITS序列拷贝引物位点高度保守，许多复合种不能单一地依靠ITS序列进行区分，且基因片段较短，在真菌系统学研究中存在不足6。除ITS外，甘油醛三磷酸脱氢酶基因（GPDH），、-微管蛋白基因，钙调蛋白基因（CAL）等也被广泛应用于真菌系统学研究7。应用多基因分析结合形态学特征可提高真菌的准确识别率，使依靠形态学及单基因分析极难识别的复合种的鉴定成为可能。近年来，在贵州省六盘水地区发现疑似大叶黄杨叶枯病的症状，发病后其叶片病斑呈圆形、多角形或不规则形，后期病斑上有丝状斑纹，叶面着生黑色分生孢子盘。该病害多危害叶片、嫩梢和幼茎，最终可致使叶片枯死掉落，严重时导致全株枯死。该病害存在大范围流行的趋势，严重影响了大叶黄杨的观Pathogenic Identification of Leaf Blight on Euonymus japonicus in Guizhou ProvinceWang Rui-xian et al(Fenggang Agriculture and Rural Bureau,Fenggang,Guizhou 564200)Abstract The diseased leaves of Euonymus japonicus collected from Liupanshui District,Guizhou Province were collected,and in order to identify the species,2 purified class were obtained by spore dilution method.2 representative strains were selected for pathogenicity test and identified as pathogenic fungi of leaf blight on Euonymus japonicus by Kochs law.Based on the morphological characters and polygene molecular systematics(ITS、-tubulin、tef-1),three strains belong to Pestalotiopsis.Strain LPSU2015001 represent Pestalotiopsis intermedia,Strain LPSU2015002 was identified as Pestalotiopsis sp.The outcome will have important practical implications for prevent the pathogenic fungi of leaf blight and enrich the fungal resource.Key words Euonymus japonicus;Leaf blight;Pestalotiopsis;Polygene molecular systematics基金项目 贵州省教育厅基金项目（黔教合KY字2015503号）。作者简介 王瑞仙（1993），女，云南宣威人，助理农艺师，主要从事主要农作物病虫绿色防控技术研究及基层农业技术推广等工作。*通信作者：杨友联（1975），男，贵州六盘水人，教授，主要从事微生物学研究和教学，E-mail：。收稿日期 2023-05-2138Journal of Agricultural Catastrophology 2023,Vol.13 No.8赏及生态价值。为明确引起该病害的病原菌，采用形态学与多基因系统学相结合的方法，对贵州省六盘水地区疑似大叶黄杨叶枯病的病原菌开展研究，旨在确定其分类地位，为该病原真菌的防治奠定理论基础。1 材料与方法1.1 材料在贵州省六盘水市市区及水城县森林公园采集具典型特征的大叶黄杨叶枯病病害样品，对病斑进行拍照，装入牛皮纸信封中。将标本带回实验室进行分离纯化。1.2 方法1.2.1 病原菌分离纯化采用稀释涂布法分离病原菌，将采集病叶样品进行纯化培养后置于4 冰箱保存备用。1.2.2 病原菌形态学鉴定将分离得到的2个菌株分别接种在PDA平板上，25 恒温培养倒置培养7 d左右，采用十字交叉法测量菌落直径，观察菌落特征。分别刮取病害标本、PDA培养基上的分生孢子堆制成临时装片，采用奥林巴斯BX51显微摄像系统观察并拍摄分生孢子形态特征，并采用Spot32 v4.0.8软件测量其大小。1.2.3 分离菌株的致病性鉴定参照牛小瑞8和杨友联9等的方法，以浓度为3.0106个孢子/mL的孢子悬浮液为接种体，分别对供试的2个菌株设室内创伤（针刺法）接种和无创伤接种2个处理，用无菌水接种作空白对照。于26 恒温培养箱中保湿（70%以上）培养。每天观察记录发病情况。叶片发病后，从病健交界处分离菌株，完成柯赫氏法则验证。1.2.4多基因联合鉴定分别将2个菌株接种于PDA平板上，25 恒温培养7 d后刮取菌丝，采用改良的CTAB法提取菌株DNA10。选择核糖体转录间 隔 区 序 列（ITS）、-微 管 蛋 白（-tubulin）和翻译延长因子1亚基基因（tef-1）3个基因片段作为目标基因进行扩增与测序（表1）。ITS序列引物为ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），-tubulin序列引物为BT2ATCTT），每 个反应体系包括12.5 L 2Taq PCR Master Mix酶，上、下游引物各1 L，1.5 L DNA模板和9 L水，总体积为25 L。按表2的扩增程序对3个基因片段进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，交由成都栢辉生物科技有限公司进行测序。将测序结果在GenBank比对并参考序列相偶联的文献，同时下载相似度较高的序列用于序列分析11-13（表2）。采用Clustal 1.83对测序的各个基因序列以及在GenBank下载的序列进行比对，比对后各个基因分别首尾相连，采用Paup 4.0 beta 10软件，最大简约法（Maximum parsimony，MP）进行分析，以启发式搜索法（Heuristic Search）构建多基因系统树，以确定菌株的分类地位。2 结果与分析2.1 供试大叶黄杨病叶的病害症状及病原菌初步鉴定结果病斑多在新生枝叶及顶部叶片处发生，病健交界明显，病斑呈圆形、多角形或不规则形向外扩展。感病叶片先是变枯黄，后产生黑色小粒点，着生于叶表皮下，后期突破表皮外露，为分生孢子盘和分生孢子，严重时整个叶片枯萎（图1）。分离的菌株纯化后得到2个菌株，编 号LPSU2015001、LPSU2015002，经镜检初步鉴定引起当地大叶黄杨叶枯表2 参与分子系统学分析的序列种名菌株号基因库序列编号ITS-tubulintef-1P.trachicarpicolaOP068*JQ845947JQ845945JQ845946P.clavataMFLUCC 12-0268*JX398990JX399025JX399056P.inflexaMFLUCC 12-0270*JX399008JX399039JX399072P.roseaMFLUCC 12-0258*JX399005JX399036JX399069P.adustaICMP6088*JX399006JX399037JX399070P.linearisMFLUCC 12-0271*JX398992JX398027JX399058P.ntermediaMFLUCC 12-0259*JX398993JX399028JX399059P.camelliaeMFLUCC 12-0277*JX399010JX399041JX399074P.furcataMFLUCC 12-0054*JQ683724JQ683708JQ683740P.diversisetaMFLUCC 12-0287*JX3990091JX399040JX399073P.saprophytaMFLUCC 12-0282*JX398982JX399017JX399048P.foedansCGMCC 3.9123*JX398987JX399022JX399053P.clavisporaMFLUCC 12-0281*JX398979JX399014JX399045P.samarangensisMFLUCC 12-0233*JQ968609JQ968610JQ968611P.chryseaMFLUCC 12-0261*JX398985JX399020JX399051P.umberporaMFLUCC 12-0285*JX398984JX399019JX399050P.asiaticaMFLUCC 12-0286*JX398983JX399018JX399049P.theaeMFLUCC 12-0055*JQ683727JQ683711JQ683743Seiridium spSD096JQ683725JQ683709JQ683741P.adustaMFLUCC 10-0146JX399007JX399038JX399071 注：标示*的为模式菌株。表1 基因扩增参数基因预变性变性退火延伸最后延伸温度/时间/min温度/时间/min温度/时间/min温度/时间/min温度/时间/minITS943950.5550.5721725-tubulin954940.8550.8721727tef-1954940.8550.8721727 注：PCR扩增过程中，预变性1次循环，变性退火延伸整个过程进行35次循环，最后延伸1次循环。39农业灾害研究 2023,13(8)病的病原菌为拟盘多毛孢属真菌。2.2 大叶黄杨病原菌致病性检测结果室内接种结果表明，绝大部分健壮的大叶黄杨叶片在刺伤接种后均能被病原菌侵染，且病斑症状与供试大叶黄杨病叶相似，而无刺伤接种叶片均未发病，表明该病原菌只能从伤口侵染叶片。2个菌株刺伤接种后发病率均为60%。分离纯化后所得菌株菌落及分生孢子形态与原供试菌株一致。2.3 大叶黄杨病原菌的形态学鉴定经分离纯化，菌株LPSU2015001在PDA培养基上的菌丝呈白色絮状，生 长 速 度11.111.4 mm/d，菌 落 边 缘不整齐，背面浅黄色，菌丝致密，有同心环状纹饰（图3A）；分生孢子堆黑色，分 生 孢 子5细 胞，（23.930.3）m （4.47.40）m，中间3个色胞几乎同 色，上2色胞深褐色，第3色胞颜色稍淡，分割处颜色特深，稍缢缩，顶胞无色，梯形或圆锥形，有23根附属丝，长14.529.8 m，尾孢无色，圆锥形，具中生式柄12根，多1根，长6.312.8 m（图3B、图3C）。寄主上，分生孢子45细胞，4细胞分生孢子无顶端透明孢，多5细胞，直或稍弯曲，（16.927.5）m （5.99.8）m（图3D、图3E）；产 孢细胞生于分生孢子梗顶端，棍棒形，无色，末端产分生孢子（图3F、图3G）。菌株LPSU2015002在PDA培养基 上菌丝洁白，呈棉絮状，分布均匀，菌落边缘不整齐，气生菌丝少，有同心轮纹，接种点周围菌丝稍稀疏，生长速率9.79.9 mm/d（图4A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5细胞，（20.427.6）m（4.37.8）m，中间3个色胞几乎 同色，上2色胞深褐色，第3色胞颜色稍淡，分割处颜色特深，稍缢缩，顶胞无色，梯形或圆锥形，有12根附属丝，长9.421.4 m，尾孢无色，圆锥形，具中生式柄1根，长4.87.7 m（图4B、图4C）。寄主上，分生孢子45细胞，4细胞分生孢子无顶端透明孢，（16.536.7）m（4.89.9）m，整体较小，具小瘤（图4D、图4E）；产孢细胞生于分生孢子梗顶端，棍棒形，无色，末端产分生孢子（图4F）。2.4 大叶黄杨病原菌的分子生物学鉴定将 分 离 得 到 的2个 菌 株 的ITS、-tubulin、tef-1序 列 与 从GenBank下载的同源性较高的序列（表2），以最大 简约法，以Seiridium sp.SD096作为外类群，基于ITS、-tubulin、tef-1序列构建多基因系统树（图5）。结果表明，图1 大叶黄杨叶枯病病症A、B分别为菌株LPSU2015001、LPSU2015002刺伤接种；C、D分别为无菌水刺伤与无刺伤接种。图2 接种供试菌株后大叶黄杨叶片症状A为PDA菌落（7 d）；B、C为PDA上分生孢子；D、E为寄主上分生孢子；F、G为寄主产孢细胞、分生孢子梗及未成熟的分生孢子；标尺=10 m。图3 LPSU2015001纯培养及显微特征A为PDA菌落（7 d）；B、C为PDA上分生孢子；D、E为寄主上分生孢子；F为寄主产孢细胞、分生孢子梗及未成熟的分生孢子；标尺=10.0 m。图4 LPSU2015002纯培养及显微特征40Journal of Agricultural Catastrophology 2023,Vol.13 No.8LPSU-2015001与P.intermedia M亲 缘关系较近，处于同一进化分支上，支持率为93%；LPSU2015002与P.trachicarpicola亲缘关系较近，处于同一进化分支上，支持率为79%，但两者支长差异较大。以Seiridiumsp.SD096作为外类群，标注的为模式菌株或诠释模式菌株。图5 基于ITS、-tubulin、tef-1部分序列构建的拟盘多毛孢属系统发育树3 讨论与结论大叶黄杨叶枯病是一种常见的植物真菌性病害，早在2006年，李庚花 等3在对江西省大叶黄杨病害调查中，通过描述病原菌分生孢子大小，分生孢子器着生位置，鉴定该病的病原菌为半知菌亚门盘多毛孢属，并未对分生孢子及产孢细胞等形态特征作具体描述。贲海燕等在对北方花卉新病害的鉴定中，采用形态学鉴定的方法，描述了大叶黄杨叶枯病病原菌的分生孢子器以及PDA纯培养特征与显微特征，鉴定该病原菌为黄杨叶点霉，但其形态结构与李庚花等报道的差别很大。通过形态学鉴定，2个菌株的形态学特征均与前两者不同，观察纯培养特征及显微特征，初步判定2个菌株（LPSU2015001、LPSU2015002）均属于拟盘多毛孢属。有关拟盘多毛孢属的分类，Steyaert14 根据分生孢子的形态特征作为界定拟盘多毛孢的依据；Cuba15则设5细胞组以界定拟盘多毛孢属，两者均根据形态特征来划分种。但对于形态特征的测量及描述，各学者的研究结果均存在参差，且许多种的形态特征几乎相似，不同的人可能会将不同的种鉴定成同一个种，甚至会出现形态学与基因分析结果不相吻合的情况16。参照Maharachchikumbura等17-18的 研究，将分离到的2株菌与其在分子系统发育树中近缘种的形态特征相 比，发现LPSU2015001的形态学特征与Maharachchikumbura等对P.intermedia的描述稍有差异，如寄主上，LPSU2015001 分生孢子大小为（16.927.5）m（5.9 9.8）m，而Maharachchikumbura等描述的 是（24.028.0）m（5.56.5）m，结合多基因系统发育树的结果，两者处于同一进化分支上，支持率为93%，因此可将LPSU2015001鉴定为P.intermedia。基于 LPSU2015002多基因系统发育树的结果，其 与P.trachicarpicola亲 缘 关 系 较近，但两者的支长相差大，且支持率仅有79%，在形态方面，LPSU2015002寄主上分生孢子较P.trachicarpicola长，顶端附属丝数量、长度、分生孢子细胞数量等差异较大，故不能将其分类单元定位到种，暂定为Pestalotiopsis sp.。因此，此次在六盘水地区采样分离得到的疑似大叶黄杨叶枯病的病原菌为拟盘多毛孢菌株，其中菌株LPSU2015001为P.intermedia，菌株LPSU2015002暂定为Pestalotiopsis sp.。参考文献1 刘兴元,徐有明,王长辉.大叶黄杨病害的研究现状分析与建议J.湖北林业科技,2006,35(6):42-45.2 桂炳中,王学军,刘雪云.大叶黄杨病害防治J.中国花卉园艺,2011,11(22):42-43.3 李庚花,陈玉兰,张超群.江西省大叶黄杨病害调查J.安徽农业科学,2006,46(21):5591-5592.4 贲海燕.我国北方主要花卉新病害及病原鉴定D.哈尔滨:东北农业大学,2008.5 刘春来,文景芝,杨明秀,等.rDNA-ITS在植物病原真菌分子检测中的应用J.东北农业大学学报,2007,51(1):101-106.6 孙微.中国古田山自然保护区炭疽菌属的种类鉴定及分子系统发育研究D.齐齐哈尔:齐齐哈尔大学,2012.7 谢淑娜.利用多基因聚合分析进行平脐蠕孢属及其近似属的分子系统学研究D.郑州:河南农业大学,2012.8 牛小瑞.山茱萸3种新病害的病原学研究D.南宁:广西大学,2013.9 杨友联.中国贵州、云南、广西炭疽菌属真菌多基因分子系统学研究D.武汉:华中农业大学,2010.10 Chen J,Xu L L,Liu B,et al.Taxonomy of Dactylella complex and Vermispora.I Generic concepts based on morphology and ITS sequences dataJ.Fungal Diversity,2006(26):73-83.11 James T Y,Kauff F,Schoch C L.A multilocus phylogeny for the Kingdom Fungi:Deep Hypha issue J.Mycologia,2006,98(6):829-1105.12 杨友联,李树江,胡海雪,等.灰毡毛忍冬顶枯病病原菌的分子鉴定J.西南农业学报,2015,28(5):2107-2111.13 Lin X,Lu C H,Huang Y J,et al.Endophytic fungi from a pharmaceutical plant,Camptotheca acuminata:Isolation,identification and bioactivityJ.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2007(23):1037-1040.14 Steyeart R L.Contribution a l etude （下转第64页）64Journal of Agricultural Catastrophology 2023,Vol.13 No.8繁殖。此外，病毒类微生物农药还可能通过影响害虫的食欲和行为，降低害虫对农作物的损害。田间应用实例显示，病毒农药成功地减少了蚜虫的种群数量，并降低了病害传播的风险，从而维护了农作物的健康生长3。4 关于微生物农药的未来展望4.1 基因编辑与微生物共生应用未来微生物农药的发展将聚焦于创新研究方向，其中基因编辑和微生物共生应用将成为重要的探索领域。基因编辑技术如CRISPRCas9已经在许多领域取得突破，将被用于改造微生物农药。通过基因编辑，科研人员可以调整微生物农药的特性，如提高其抗逆性、适应性和杀虫能力，进一步提高其在防治病虫害中的效果。微生物共生应用也备受瞩目。将多种微生物组合应用于同一农田，通过它们之间的相互作用，取得更加综合的病虫害防治效果。例如：某些细菌可以促进植物生长，同时抑制病原微生物的生长，从而实现促进植物生长和防治的双重效果。4.2 保护机制的改进，提升微生物农药效力和稳定性尽管微生物农药在环境友好性和生物特异性方面具有优势，但其效力和稳定性仍是一个挑战。在未来，科研人员将致力于克服这些技术难题，如保护机制的改进，以进一步提高微生物农药的效果。微生物农药在外界环境中容易受到温度、湿度等因素的影响，从而影响其存活和生物活性4-6。因此，开发更加稳定的保护机制，如微胶囊化技术，可以提高微生物农药在不利环境下的存活率，延长其防治效果。4.3 微生物农药与化学农药的协同应用策略微生物农药与化学农药的协同应用策略也将成为未来的重要发展方向。微生物农药和化学农药各自具有不同的作用机制和特点，在害虫防治中具有互补性。将两者结合，既可以降低化学农药的使用量，减少环境风险，又可以克服微生物农药在特定情况下的限制，提高防治效果7-9。科研人员可以通过优化施用剂型、时间和剂量等因素，实现微生物农药与化学农药的最佳协同效果。微生物农药的未来展望充满着创新和挑战。通过基因编辑、微生物共生应用等创新研究方向，微生物农药的效力和稳定性将得到提高。同时，克服技术难题，改进保护机制，以及微生物农药与化学农药的协同应用策略，将为农业生产提供更加可持续、环保的病虫害防治解决方案。5 结论微生物农药作为一种绿色、环保的植物病虫害防治手段，在农业可持续发展和食品安全保障方面具有巨大潜力。通过探讨微生物农药的种类、作用机制、优势和挑战，以及未来的创新方向和协同应用策略，充分展示了微生物农药在农业领域中的重要作用，强调了微生物农药在植物病虫害防治中的前景，并呼吁进一步深入研究与应用，以推动农业向更加可持续、生态友好的方向发展。随着基因编辑和微生物共生应用等领域的不断创新，微生物农药的效力和稳定性将得到进一步提升。通过基因编辑技术，可以更精准地调控微生物农药的特性，使其适应不同环境和害虫的需求。微生物共生应用也为病虫害的防治提供了更加多样化的防治策略，通过不同微生物的协同作用，实现更广泛、更强效的病虫害防治效果。这些创新方向不仅为农业生产带来新的希望，还为科研人员和农业专家提供了广阔的研究和应用空间。然而，在追求微生物农药前景的同时，抗药性问题、技术难题和稳定性改进仍需要不断努力和创新，并寻求解决方案，以确保微生物农药能够持续有效地应对植物病 虫害。作为生物防治手段的代表，微生物农药已经在植物病虫害防治领域取得了显著的成就。随着科技的进步和创新的推动，微生物农药的前景更加广阔。科研界、农业界和政府部门应继续加大对微生物农药研究的支持力度，进一步推动其应用，为农业生产的绿色、可持续发展注入新的活力。参考文献1 王宇,金剑雪,李凤良.微生物农药在植物病虫害防治中的应用策略J.现代农机,2022,40(5):107-109.2 袁瑞.微生物农药在植物病虫害防治中的应用策略探讨J.农业与技术,2017,37(10):17.3 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