生物化学-第10章-DNA的生物合成-2012.ppt

目录目录第10章DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis(Replication)王丽影王丽影王丽影王丽影目录目录中心法则中心法则（central dogmacentral dogma）遗传信息传递方向的规律遗传信息传递方向的规律基因表达：基因表达：是指将遗传信息由是指将遗传信息由DNA转录转录为为RNA、再再翻译翻译成蛋白质的过程成蛋白质的过程目录目录n本章主要内容：本章主要内容：第一节第一节 复制的基本规律复制的基本规律 0.50.5学时学时 第二节第二节 DNADNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 1 1学时学时 第三节第三节 DNADNA生物合成过程生物合成过程 1 1学时学时 第四节第四节 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 0.50.5学时学时 第五节第五节 DNADNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复 1 1学时学时复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节目录目录复制的方式复制的方式 半保留复制半保留复制(semi-conservative(semi-conservative replication)replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous(semi-discontinuous replication)replication)n复制的基本规律复制的基本规律 目录目录概念概念 以以亲代亲代DNADNA双链为双链为模板模板(template)以碱以碱基互补方式合基互补方式合成子代成子代DNADNA，这样这样新形成的新形成的子代子代DNADNA中，一条链中，一条链来自亲代来自亲代DNADNA，而另而另一条链则是新合成的一条链则是新合成的，这种复制方式叫半，这种复制方式叫半保留复制保留复制。一、半保留复制是一、半保留复制是DNA复制的基本特征复制的基本特征AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA目录目录密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制方式方式含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代DNA半保留复制的实验半保留复制的实验目录目录密度梯度密度梯度实验实验目录目录按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。n半保留复制的意义半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。目录目录原原核核生生物物复复制制时时，DNA从从起起始始点点(origin)向向两两个个方方向向解解链链，形形成成两两个个延延伸伸方方向向相相反反的的复复制制叉叉，称为称为双向复制双向复制。二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制复制中的放射自显影图复制中的放射自显影图像像A.环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B.复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C.复制接近终止点复制接近终止点(termination,ter)oriterA B C目录目录真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子的的复复制制。习习惯惯上上把把两两个个相相邻邻起起始始点点之之间间的的距距离离定定为为一一个个复复制制子子(replicon)。复复制制子子是是独独立完成复制的功能单位。立完成复制的功能单位。53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制3目录目录三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)目录目录顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，复复制制是是连连续续进进行行的的，这股链称为这股链称为领头链领头链(leading strand)。另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为随随从从链链(lagging strand)。复复制制中中的的不不连连续续片段称为片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制的半不连续性。制的半不连续性。目录目录DNADNADNADNA的的的的半不连续复制半不连续复制复制过程复制过程复制过程复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解解链酶链酶RNA引物引物引发体引发体DNA聚聚合酶合酶ISSB335前导链前导链随后链随后链35复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5RNA引物引物33复制特点目录目录目录目录DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA Replication目录目录一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应是复制的基本化学反应(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi目录目录n参与参与DNA复制的物质复制的物质:底物底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚聚合合酶酶(polymerase):依依赖赖DNA的的DNA聚聚合合酶酶，简简写为写为 DNA-pol；模板模板(template):解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链；引引物物(primer):提提供供3-OH末末端端使使dNTP可可以以依依次次聚合；聚合；其他的酶和蛋白质因子。其他的酶和蛋白质因子。目录目录n聚合反应的特点聚合反应的特点:DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板；新新链链的的延延长长只只可可沿沿5 3 方方向向进行。进行。目录目录二、二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合聚合酶催化核苷酸之间聚合全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1.53 的聚合活性的聚合活性2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5 外切酶活性外切酶活性:5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性:目录目录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶目录目录n功能：功能：DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow fragment604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。目录目录DNA-pol（120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。目录目录 DNA-pol III(250kD)n n由由10种亚基组成的不对称聚合体种亚基组成的不对称聚合体n n催化效率最高催化效率最高功能：功能：是是原核生物原核生物复制延长复制延长中真正起中真正起催化作用催化作用的酶的酶目录目录个核心酶个核心酶1个个-复合物（复合物（、6种亚种亚基）基）可滑动的可滑动的DNA夹子夹子（含（含1对对-亚基）亚基）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构包括：全酶结构包括：目录目录 亚基亚基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亚基亚基具有具有35 外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用核心酶由核心酶由、和和 亚基组成：亚基组成：目录目录2个个-亚亚基基分分别别和和1个个核核心心酶酶相相互互作作用用，其其柔柔性性连连接接区区可可以以确确保保在在复复制制叉叉1个个全全酶酶分分子子的的2个个核核心心酶酶能能够够相相对对独独立立运运动动，分分别别负负责责合合成成前导链和后随链。前导链和后随链。功功能能：-复复合合物物是是DNA夹夹子子加加载载蛋蛋白白，负负责责将将可可沿沿DNA链链滑滑动动的的一一对对-亚亚基基（DNA夹夹子子）加加载载于于DNA，使使DNA聚聚合合酶酶具具有有持续合成能力。持续合成能力。-复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成：、目录目录大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 -复合物复合物DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对,5 核酸外核酸外切酶活性切酶活性夹稳模板链促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化53 的聚合活性的聚合活性目录目录三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录目录（一）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核核核核酸酸酸酸外外外外切切切切酶酶酶酶(exonucleaseexonuclease)是是是是指指指指能能能能从从从从核核核核酸酸酸酸链链链链的的的的末末末末端端端端把把把把核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸依依依依次次次次水水水水解解解解出出出出来来来来的的的的酶酶酶酶，外外外外切切切切酶酶酶酶是是是是有有有有方向性的。方向性的。方向性的。方向性的。目录目录A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能目录目录（二）复制的保真性依赖正确的碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。DNA-DNA-polpol III:III:对核苷酸的参入有选择功能对核苷酸的参入有选择功能对核苷酸的参入有选择功能对核苷酸的参入有选择功能,酶通过对不同酶通过对不同酶通过对不同酶通过对不同碱基构型亲和力的不同来实现其选择功能的碱基构型亲和力的不同来实现其选择功能的碱基构型亲和力的不同来实现其选择功能的碱基构型亲和力的不同来实现其选择功能的.目录目录遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：目录目录四、复制中的分子解链伴有四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态目录目录 复制相关蛋白的复制相关蛋白的基因基因：dna A、dna B、dna C dna X相应的表达产物相应的表达产物蛋白质蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C Dna X Dna A：辨认复制起始位点辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上辅助解螺旋酶使其在起始点上结结 合并打开双链。合并打开双链。目录目录E.Coli 基因图基因图目录目录解螺旋酶解螺旋酶(helicase)(复制蛋白复制蛋白rep)利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单双链解开成为两条单链。链。引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引引物的酶。物的酶。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整态并保护单链的完整。目录目录108局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、超螺旋状态、理顺理顺DNA链链n复制过程正超螺旋的形成：复制过程正超螺旋的形成：目录目录拓扑学拓扑学n n研究几何图形在连续变形下保持不变的性质(所谓连续变形，形象地说就是允许伸缩和扭曲等变形，但不许割断和粘合)；n n一般地说，对于任意形状的闭曲面，只要不把曲面撕裂或割破，他的变换就是拓扑变换，就存在拓扑等价。目录目录解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目录目录既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：目录目录拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n作用机制：作用机制：目录目录n拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：目录目录五、五、DNA连接酶连接连接酶连接DNA双链中的双链中的单链缺口单链缺口连连接接DNA链链3-OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5-P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相邻的相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。n DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式：HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353nDNA连接酶的作用：连接酶的作用：目录目录DNA连连接接酶酶在在复复制制中中起起最最后后接接合合缺缺口口的的作用。作用。在在DNA修修复复、重重组组及及剪剪接接中中也也起起缝缝合合缺缺口作用。口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目录目录提供核糖提供核糖3-OH提供提供5-P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中的引物或延长中的新链新链游离游离dNTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较 目录目录DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第第 三三 节节目录目录（一）复制起始：（一）复制起始：DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个问题：需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成目录目录复制起点（复制起点（origin）：指：指DNA复制所必需的一段特殊的复制所必需的一段特殊的DNA序列。序列。复制起点的一般特征复制起点的一般特征:由多个独特的短重复序列组成。由多个独特的短重复序列组成。短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。一般富含一般富含ATAT，利于双螺旋，利于双螺旋DNADNA解旋，以产生单链解旋，以产生单链DNADNA复复制模板。制模板。复制起点复制起点目录目录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1.DNA解链解链目录目录目录目录 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2.引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。目录目录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录目录目录（二）复制的延长过程：领头链连续复制，（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制随从链不连续复制复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目录目录n领头链的合成：领头链的合成：领头链的子链沿着领头链的子链沿着5 5 33 方向可以连续地延长。方向可以连续地延长。n随从链的合成随从链的合成n同一复制叉上领头链和随从链由相同的同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长催化延长 目录目录阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图目录目录目录目录原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口空缺、连接切口目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 随从链上不连续性片段的连接：随从链上不连续性片段的连接：目录目录目录目录目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关。性有关。蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而而实施调控作用。实施调控作用。目录目录细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性性有有关关。蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而而实实施施调调控控作作用用。相相关关的的激激酶酶都都有有调调节节亚亚基基即即细细胞胞周周期期蛋蛋白白(cyclin)，和和催催化化亚亚基基即即细细胞胞周周期期蛋蛋白白依依赖赖激激酶酶(cyclin dependent kinase，CDK)。目录目录CDK相匹配的周期蛋白相匹配的周期蛋白作用点作用点CDK2Cyclin D1,D2,D3G1期期Cyclin EG1S期期Cyclin AS期期CDK3和和CDK4Cyclin D1,D2,D3G2期期CDK1（CDC2）Cyclin A,BG2M期期哺乳类动物的周期蛋白和哺乳类动物的周期蛋白和CDK目录目录哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞内内还还发发现现天天然然抑抑制制CDK的的蛋蛋白白质质，例例如如锚锚蛋蛋白白(ankynin)是是CDK4的的特特异异性性抑抑制制物物，P21蛋蛋白白能能抑抑制制多多种种CDK。锚锚蛋蛋白白和和P21蛋蛋白白的的抑抑制制/活活化化可可使使细细胞胞周周期期开开放放/关关闭闭，因因此此被被形形容容为为细胞周期的检查点细胞周期的检查点(check point)蛋白。蛋白。目录目录真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分分组组方方式式激活而不是同步起动。激活而不是同步起动。复复制制的的起起始始需需要要DNA-pol（引引物物酶酶活活性性）和和pol（解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参与与。还还需需拓拓扑扑酶酶和和复复制因子制因子(replication factor,RF)。（一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似目录目录（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶目录目录TLS1 Rev 1TLS，体，体细细胞高胞高变变1Pol 相相对对准确的准确的TLS（穿越（穿越环环丁丁烷烷二聚体）二聚体）1Pol TLS1Pol 体体细细胞高胞高变变（somatic hypermutation）1Pol 减数分裂相关的减数分裂相关的DNA损伤损伤修复修复1Pol TLS1Pol DNA交交联损伤联损伤修复修复1Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复4Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复23Pol 线线粒体粒体DNA复制和复制和损伤损伤修复修复3Pol 碱基切除修复碱基切除修复1Pol 合成引物合成引物4Pol 功能功能亚亚基数目基数目真核生物真核生物TLS（translesion synthesis）3Pol (UmuC,UmuD)DNA损伤损伤修复，穿越修复，穿越损伤损伤合成（合成（TLS）1Pol (Din B)染色体染色体DNA复制复制9Pol 全全酶酶染色体染色体DNA复制复制3Pol 核心核心酶酶DNA损伤损伤修复修复1Pol 去除去除RNA引物，引物，DNA损伤损伤修复修复1Pol 功能功能亚亚基数目基数目原核生物（原核生物（E.coli）原核、真核细胞原核、真核细胞DNADNA聚合酶的类型和功能聚合酶的类型和功能目录目录增增 殖殖 细细 胞胞 核核 抗抗 原原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在在复复制制起起始始和和延延长长中中起起关关键键作作用用。PCNA为为同同源源三三聚聚体体，具具有有与与E.coli DNA 聚聚合合酶酶的的亚亚基基相相同同的的功功能能和和相相似似的的构构象象，即即形形成成闭闭合合环环形形的的可可滑滑动动DNA夹夹子子，在在RFC的的作作用用下下PCNA结结合合于于引引物物模模板板链链；并并且且PCNA使使pol获获得得持持续续合合成成能能力力。PCNA水水平平也也是是检检验验细细胞胞增增殖殖的重要指标。的重要指标。目录目录Pol /引发酶引发酶合成合成RNA-DNA引物引物Pol 合成前导链和后随链合成前导链和后随链RFC 识别引物识别引物iDNA的的3 端并驱除端并驱除Pol /引发引发酶酶PCNA 结合结合DNA并引入并引入Pol RNAse H I/FEN1 切除冈崎片段切除冈崎片段5 端的端的RNA引物引物真核生物复制过程中酶及功能真核生物复制过程中酶及功能目录目录Pol （或（或Pol ）填补冈崎片段之间的空隙填补冈崎片段之间的空隙DNA连接酶连接酶 封口封口RPA 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白,稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNADNA解旋酶解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力释放复制叉前进时产生的扭曲应力目录目录PCNA(proliferating cell nuclear antigen)同源三聚体结构、目录目录真核真核DNA复制模型（示聚合酶开启复制模型（示聚合酶开启与后随链岗崎片段过程）与后随链岗崎片段过程）目录目录pDNA-pol 和和pol 分分别别兼兼有有解解螺螺旋旋酶酶和和引引物物酶酶活活性性。在在复复制制叉叉及及引引物物生生成成后后，DNA-pol 通通过过PCNA的的协协同同作作用用，逐逐步步取取代代pol，在在RNA引引物物的的3-OH基基础础上上连连续续合合成成领领头头链链。随随从从链链引引物物也也由由pol 催催化化合合成成。然然后后由由PCNA协同，协同，pol 置换置换pol，继续合成，继续合成DNA子链。子链。（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体n真核生物复制叉的延长：真核生物复制叉的延长：目录目录目录目录DNA忠实性的保障1 1、碱基的配对规律：、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为基配对保证碱基配错几率约为1/101/104 41/101/105 5。2 2、DNADNA聚合酶的聚合酶的3 355外切酶活性的校对功能，外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低使碱基的错配几率又降低10010010001000倍。倍。3 3、复制中的即时校读功能。、复制中的即时校读功能。目录目录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题5 3 3 5 5 3 3 5+5 3 3 3 3 5 5 目录目录n线性线性DNA复复制的末端制的末端 目录目录端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNADNA分子末端的重复序列结构分子末端的重复序列结构n端粒的功能：端粒的功能：p稳定染色体末端结构稳定染色体末端结构p防止染色体间末端连接防止染色体间末端连接p可补偿滞后链可补偿滞后链5末端在消除末端在消除RNA引物后造引物后造成的空缺成的空缺n端粒的结构特点：端粒的结构特点：p由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。p末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短序列。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG目录目录目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)n组成：组成：目录目录端粒酶与端粒端粒酶与端粒目录目录端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways第四节第四节目录目录双双链链DNA是是大大多多数数生生物物的的遗遗传传物物质质。某某些些病病毒毒的的遗遗传传物物质质是是RNA。少少数数低低等等生生物物如如M13噬噬菌菌体体，它它的的感感染染型型只只含含单单链链DNA。原原核核生生物物的的质质粒粒，真真核核生生物物的的线线粒粒体体DNA，都都是是染染色色体体外外存存在在的的DNA。这这些些非非染染色色体体基基因组，采用特殊的方式进行复制。因组，采用特殊的方式进行复制。目录目录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录逆转录(reverse transcription)逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒的基因组是一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录其复制方式是逆转录RNARNADNADNA目录目录n逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA目录目录逆转录酶及其作用过程目录目录RNA病病毒毒在在细细胞胞内内复复制制成成双双链链DNA的的前前病病毒毒(provirus)。前前病病毒毒保保留留了了RNA病病毒毒全全部部遗遗传传信信息息，并并可可在在细细胞胞内内独独立立繁繁殖殖。在在某某些些情情况况下下，前前 病病 毒毒 基基 因因 组组 通通 过过 基基 因因 重重 组组(recombination)，参参加加到到细细胞胞基基因因组组内内，并并随随宿宿主主基基因因一一起起复复制制和和表表达达。这这种种重重组组方方式式称称为为整整合合(integration)。前前病病毒毒独独立立繁繁殖殖或或整整合合，都可成为致病的原因。都可成为致病的原因。目录目录分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。n试管内合成试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录二、逆转录的发现发展了中心法则二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能。样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。目录目录n 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、噬菌体三、噬菌体DNA按滚环方式复制和按滚环方式复制和线粒体线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 -OH5 引物引物A蛋白蛋白A蛋白断开蛋白断开母链与子链母链与子链目录目录dNTPDNA-pol n D环复制环复制(D-loop replication)是线粒体是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。mtDNAmtDNA的突变与衰老有关的突变与衰老有关.目录目录D-环环复复制制时时需需合合成成引引物物。mtDNA为为双双链链，第第一一个个引引物物以以内内环环为为模模板板延延伸伸。至至第第二二个个复复制制起起始始点点时时，又又合合成成另另一一个个反反向向引引物物，以以外外环环为为模模板板进进行行反反向向的的延延伸伸。最最后后完完成成两两个个双双链链环环状状DNA的复制。复制中呈字母的复制。复制中呈字母D形状而得名。形状而得名。D环环复复制制的的特特点点是是复复制制起起始始点点不不在在双双链链DNA同同一一位位点点，内内、外外环环复复制制有有时时序序差别。差别。DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)&Repair第五节第五节目录目录DNA突突变变具具体体指指个个别别dNMP残残基基以以至至片片段段DNA在在构构成成、复复制制或或表表型型功功能能的的异异常常变变化化，也称为也称为DNA损伤损伤(DNA damage)。从从分分子子水水平平来来看看，突突变变就就是是DNA分分子子上上碱碱基基的改变。的改变。目录目录一、突变在生物界普遍存在一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础从从长长远远的的生生物物史史看看，进进化化过过程程是是突突变变的的不不断断发生所造成的。发生所造成的。大大量量的的突突变变都都是是属属于于这这种种类类型型，只只是是目目前前还还未未能能认认识识其其发发生生的的真真正正原原因因，因因而而名名为为自自发发突变或自然突变突变或自然突变(spontaneous mutation)。目录目录（二）只有基因型改变的突变形成（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性的多态性这这种种突突变变没没有有可可察察觉觉的的表表型型改改变变，例例如如在在简简并并密密码码子子上上第第三三位位碱碱基基的的改改变变，蛋蛋白白质质非非功功能能区区段段上上编编码码序序列列的的改改变变等等。这这些些现现象象也也相相当普遍。当普遍。多多态态性性(polymorphism)一一词词用用来来描描述述个个体体之之间间的基因型差别现象。的基因型差别现象。目录目录（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（三）致死性的突