动物细胞培养技术.ppt

动物细胞培养技术动物细胞培养技术1.1.动物细胞的生长与培养动物细胞的生长与培养动物细胞的特点动物细胞的特点l进化程度高进化程度高l结构、形态、成分复杂结构、形态、成分复杂l细胞间连接形式多样细胞间连接形式多样l生长相对缓慢生长相对缓慢l功能全面功能全面1.1 1.1 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征Hepatocytes体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型 （一）贴附型（一）贴附型 成纤维细胞型成纤维细胞型 上皮型细胞上皮型细胞 游走细胞型游走细胞型 多形型细胞多形型细胞（二）悬浮型（二）悬浮型（三）半贴壁型（三）半贴壁型（一）贴附型：（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴附贴附:是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内生存生存和和生长发育生长发育的的基本基本存在方式存在方式结果结果:基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须织，有机体的绝大多数细胞必须贴附贴附于一于一固相表面固相表面才能才能生生存存和和生长生长。培养时：培养时：这些细胞被放到体外环境中以后这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞属于贴附型细胞贴附贴附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：细胞：唯有贴附于固相表面才唯有贴附于固相表面才能生存的细胞能生存的细胞细胞在体内、外细胞在体内、外的的贴附贴附方式：方式：存在差异存在差异体内：体内：贴附贴附是是全方位全方位,外形外形具有具有复杂的立体特征复杂的立体特征体外：体外：多数情况，细胞只有多数情况，细胞只有一个附着平面一个附着平面，外外形形一般一般与体内时明显不同与体内时明显不同贴附的固相表面：贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型几大类型 1 1、成纤维细胞型：、成纤维细胞型：名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的的来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织如：的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮血管内皮形态：形态：似体内成纤维细胞的形态，似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出三角形，胞质向外伸出2 23 3个长短不等的突起，个长短不等的突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片并不紧靠连成片，细胞细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动，单独行动，游离的游离的单独单独的的成纤维样细胞，常有几个成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起伸长的细胞突起2 2、上皮型细胞：、上皮型细胞：名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内，实际上不完全相同，实际上不完全相同来源：来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍如：皮肤及其衍生物生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞，扁平扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆形核中有圆形核 生生长长特特点点：易易相相连连成成片片，相相靠靠紧紧密密相相连连成成薄薄层层铺铺石石状状生生长长时时呈呈膜膜状状移移动动，很很少少脱脱离离细细胞胞群群而而单单个个活动活动3 3、游走细胞型：、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。胞相区别。4 4、多型细胞型：、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。规律和稳定的形态，可统归于此类。（二）悬浮型：（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。大量繁殖。概念：概念：培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：特点：在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好细胞细胞圆形圆形，单个或小细胞团，单个或小细胞团优点：优点：生存空间大，生存空间大，提供数量大，传代方便提供数量大，传代方便(不需消化不需消化)，易于收获，易于收获，可获得稳定状态可获得稳定状态缺点：缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离无菌无毒害的环境无菌无毒害的环境1支持生长增殖的营养支持生长增殖的营养2其它类似体内的环境其它类似体内的环境3维持细胞性状维持细胞性状41.2 1.2 细胞培养总原则细胞培养总原则(一一)细胞培养无菌无毒环境细胞培养无菌无毒环境l实验室设计合理实验室设计合理l常用设施及设备常用设施及设备l培养器皿：培养器皿：透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。性硬度玻璃制品。细胞培养无菌操作基本技术细胞培养无菌操作基本技术l工作环境及表面的处理工作环境及表面的处理l细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理l培养液与培养细胞的处理培养液与培养细胞的处理(二二)细胞的营养细胞的营养l培养基：培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。供培养细胞生长和繁殖的生存环境。l血清：血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一，血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分成分。l其它成分（条件培养基）其它成分（条件培养基）合成培养基的主要成分合成培养基的主要成分l氨基酸氨基酸l碳水化合物碳水化合物l无机盐无机盐l维生素维生素l其它辅助物质其它辅助物质培养基种类培养基种类lRPMI-1640（标准型）（标准型）lDMEM-高糖（标准型）高糖（标准型）lDMEM-低糖（标准型）低糖（标准型）lMcCoys 5AlM199lF12血清血清牛血清、马血清、人血清牛血清、马血清、人血清（1 1）储存于）储存于-20-20 -70 -70 低温冰箱中低温冰箱中（2 2）一般厂商提供的血清为无菌）一般厂商提供的血清为无菌（3 3）热灭活是指）热灭活是指56,30 56,30 分钟加热已完全分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complementcomplement）灭活）灭活（4 4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去除，也可不用处理。分钟去除，也可不用处理。其它常用液体试剂其它常用液体试剂lHankslD-HankslPBSlNaHCO3（7.5%）l胰酶溶液（胰酶溶液（0.25%）(三三)其它类似体内的环境其它类似体内的环境n温度温度n气体气体n渗透压渗透压n氢离子浓度氢离子浓度(PH)(PH)n其他其他(四四)合理的计划，维持细胞性状合理的计划，维持细胞性状尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复的细胞以及转染后稳定存在的细胞的细胞以及转染后稳定存在的细胞需要做实验的细胞要选对数生长期需要做实验的细胞要选对数生长期防止细胞污染，如遇污染，及时处理防止细胞污染，如遇污染，及时处理一、细菌污染一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量一般为预防剂量)，也可能，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pHpH改改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系系)丢失。丢失。二、真菌污染二、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。性作用而使细胞脱落死亡。三、支原体污染三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件现，能在偏碱条件(pH7.68.0)下生存，对青霉素下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。还会产生交叉污染。四、病毒污染四、病毒污染采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病或多发瘤病毒，毒，B淋巴细胞含淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变异、转病毒，细胞会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。化，形成异倍体的细胞系。五、非同种细胞污染五、非同种细胞污染由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如种细胞污染。如“灵长类灵长类”细胞系发现猴和鼠类细细胞系发现猴和鼠类细胞胞的混合物，的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，细胞是从兔肾中分离出来的，而现在却认为是而现在却认为是HeLa细胞。细胞。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。而带入一些有毒化学物质所致。常用的排除微生物污染的方法常用的排除微生物污染的方法 u抗生素排除法：采用抗生素排除法：采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用度抗生素后作用2448h，再换入常规培养物，有时可能奏，再换入常规培养物，有时可能奏效。效。u加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于细胞至于41摄氏度作用摄氏度作用510h（最长可达（最长可达18h），以杀灭支），以杀灭支原体。原体。u动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养细胞进行培养u与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活710天，并保天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点，可将少量的污持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点，可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。1.3 1.3 培养细胞的生长和增殖过程培养细胞的生长和增殖过程 幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养养单个细胞细胞细胞悬液悬液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养如何界定原代培养和传代培养；如何界定原代培养和传代培养；多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变遗传物质未改变遗传物质未改变l原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第细胞为原代细胞。培养的第1 1代细胞与代细胞与传传1010代以内的细胞称为原代细胞培养。代以内的细胞称为原代细胞培养。l传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。为传代培养。有关概念有关概念细胞的原代培养细胞的原代培养 将动物机体的各种组织从机体中取出，经将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。组织块直接培养法（机械法）组织块直接培养法（机械法）1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡酒精泡23秒钟秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。平皿中。2、用、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（、用手术剪将肝脏剪成小块（1-2mm），再用），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中液洗三次，转移至小青霉素瓶中4 4、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面5 5、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入组织块。入37静置静置35小时，轻轻翻转培养瓶，使小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37继续培养继续培养 胰酶消化法胰酶消化法1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡酒精泡23秒钟秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。平皿中。2、用、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入、视组织块量加入56倍的倍的0.25%胰酶液，胰酶液，37中消中消化化2040分钟，每隔分钟，每隔5分钟振荡一次分钟振荡一次.5、加入、加入2 2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。用吸管吹打，冲散细胞。6、静置，使未分散的组织块下沉。、静置，使未分散的组织块下沉。7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，量培养液，37下培养。下培养。（一）培养细胞生命期（一）培养细胞生命期在培养中持续增殖和生长的时间。在培养中持续增殖和生长的时间。1 1原代培养期：原代培养期：从体内取出组织从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段接种培养到第一次传代阶段（初代培养）（初代培养）特点：特点：1 1一一4 4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性、多呈似性、多呈二倍体核型二倍体核型细胞群是异质的细胞群是异质的，细胞克隆形成率细胞克隆形成率很低，即细很低，即细胞独立生存性差。胞独立生存性差。2 2传代期：传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系细胞系。在。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代或传代后早期冻存。一般情况下当传代10105050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。细胞进入第三期。3 3衰退期：衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得转化的标志之一是细胞可能获得永生性永生性或或恶恶性性性性。细胞永生性细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称能力，这样的细胞群体称无限细胞系无限细胞系，也称，也称连连续细胞系续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成型大多变成异倍体异倍体。细胞转化亦可用人工方法。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。胞永生性和恶性性非同一性状。（二）组织培养细胞一代生存期（二）组织培养细胞一代生存期所谓细胞所谓细胞“一代一代”一词，系指从一词，系指从细胞接种到分离再培养时的一段时细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第含义。如某一细胞系为第153153代细胞，代细胞，即指该细胞系已传代即指该细胞系已传代153153次。它与细次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增细胞能倍增3 36 6次。细胞传一代后，次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：一般要经过以下三个阶段：潜伏期潜伏期指数生长期指数生长期停滞期停滞期1 1潜伏期：潜伏期：过程过程:游离游离:悬浮悬浮,胞质回缩胞质回缩,全部细胞变为圆球形全部细胞变为圆球形吸附吸附:贴附底物贴附底物,一般一般2424小时内贴壁小时内贴壁潜伏期潜伏期:可有运动活动可有运动活动,基本无增殖基本无增殖,少少见分裂相见分裂相 影响因素：影响因素：潜伏期的长短与：潜伏期的长短与：细胞种类细胞种类接种的细胞密度接种的细胞密度培养条件培养条件1.1.细胞类型细胞类型传代传代培养的细胞之培养的细胞之潜伏期潜伏期比原代培养的比原代培养的细胞短细胞短。传代培养期的细胞传代培养期的细胞6-24h;6-24h;原代原代24-96h24-96h或更长或更长单个细胞快单个细胞快,细胞大团慢细胞大团慢,组织块慢组织块慢连续细胞系连续细胞系与发生恶性与发生恶性转化的细胞转化的细胞(6-24h)(6-24h)比比有限细胞系与正常二倍体细胞的有限细胞系与正常二倍体细胞的短短来源：胚胎来源：胚胎组织组织:短短,2,2天可见细胞生长，成体天可见细胞生长，成体:长长 2.2.细胞密度细胞密度密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，外环境，潜伏期就短潜伏期就短。相反，即便是在很小的。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长期仍会较长3.3.培养条件培养条件培养液、培养液、pHpH 底物、污染底物、污染,有毒有毒 2 2指数增生期：指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数细胞分裂指数表示，即细胞群中每表示，即细胞群中每10001000个细个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.1%0.5%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%3%5%5%。特点：特点：是细胞是细胞增生最活跃增生最活跃、活力最旺盛活力最旺盛的阶段的阶段培养物中培养物中细胞数量呈指数增长细胞数量呈指数增长,细胞群体均一细胞群体均一是理想的实验用细胞是理想的实验用细胞接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制3 3停滞期：停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称称平台期平台期（PlateauPlateau）。停滞期细胞虽不增）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、趋耗尽，代谢产物积累、pHpH降低。此时需做降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡态改变，重则从底物脱落死亡特点特点 (1)(1)细胞数量：细胞数量：细胞达细胞达饱和密度，出现密度抑制饱和密度，出现密度抑制。(2)(2)细胞活动小细胞活动小(3)(3)生长组分下降生长组分下降 (4)(4)及时传代：及时传代：细胞细胞已中毒已中毒，即使，即使传代传代，也会，也会影响下一代细胞影响下一代细胞的功能状况的功能状况潜伏期潜伏期指数生长期指数生长期停滞期停滞期细胞计数及活力测定细胞计数及活力测定l培养的培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度胞在一般条件下要求有一定的密度才能生才能生长良好，所以要良好，所以要进行行细胞胞计数，数，结果果以每毫升以每毫升细胞数表示。胞数表示。l在在细胞群体中胞群体中总有一些因各种原因而死亡的有一些因各种原因而死亡的细胞，胞，总细胞中活胞中活细胞所占的百分比叫做胞所占的百分比叫做细胞活力，由胞活力，由组织中分离中分离细胞一般也要胞一般也要检查活活力，以了解分离的力，以了解分离的过程程对细胞是否有胞是否有损伤作作用。复用。复苏后的后的细胞也要胞也要检查活力，了解活力，了解冻存存和复和复苏的效果。的效果。细胞计数原理细胞计数原理细胞胞计数操作步数操作步骤 1、将血球、将血球计数板及盖片擦数板及盖片擦试干干净，并将盖片盖在，并将盖片盖在计数数板上。板上。2、将、将细胞胞悬液吸出少液吸出少许，滴加在盖片，滴加在盖片边缘，使，使悬液充液充满盖片和盖片和计数板之数板之间。3、静置、静置3分分钟。4、镜下下观察，察，计算算计数板四大格数板四大格细胞胞总数，数，压线细胞胞只只计左左侧和上方的。然后按下式和上方的。然后按下式计算：算：细胞数胞数/ml4大格大格细胞胞总数数/410000注意：注意：镜下偶下偶见由两个以上由两个以上细胞胞组成的成的细胞胞团，应按按单个个细胞胞计算，若算，若细胞胞团占占10%以上，以上，说明分散不好，明分散不好，需重新制需重新制备细胞胞悬液。液。请计算一下请计算一下细胞毒实验需要效应细胞与靶细胞的比例为细胞毒实验需要效应细胞与靶细胞的比例为2020：1 1且靶细胞需要且靶细胞需要1 1x10 x104 4/TEST/TEST。现有效应细胞现有效应细胞10ml10ml，取，取100ul100ul效应细胞加入效应细胞加入900ul900ulPBSPBS中，混匀后记数，细胞浓度为中，混匀后记数，细胞浓度为2 2x10 x104 4/ml/ml。靶靶细胞也有胞也有10ml10ml，经记数，数，细胞胞浓度度为1x101x105 5/ml/ml。效效应细胞共有多少？靶胞共有多少？靶细胞共有多少？胞共有多少？以以现有的有的细胞做胞做实验，能做几个，能做几个TESTTEST？细胞活力胞活力测定步骤测定步骤1 1、将、将细胞胞悬液以液以0.5ml0.5ml加入加入试管中。管中。2 2、加入、加入0.5ml 0.4%0.5ml 0.4%台盼台盼兰染液，染色染液，染色2 2一一3 3分分钟。3 3、吸取少、吸取少许悬液涂于液涂于载玻片上，加上盖片。玻片上，加上盖片。4 4、镜下取几个任意下取几个任意视野分野分别计死死细胞和活胞和活细胞胞数，数，计细胞活力。胞活力。死死细胞能被台盼胞能被台盼兰染上色，染上色，镜下可下可见深深兰色的色的细胞，活胞，活细胞不被染色，胞不被染色，镜下呈无色透明状。下呈无色透明状。活力活力测定可以和定可以和细胞胞计数合起来数合起来进行，但要考行，但要考虑到染液到染液对原原细胞胞悬液的加倍稀液的加倍稀释作用。作用。哺乳动物细胞冷冻保存哺乳动物细胞冷冻保存主要目的：主要目的：（1 1）保存种子细胞，以便随时取用。）保存种子细胞，以便随时取用。（2 2）降低人力和物力）降低人力和物力（3 3）减少细胞被微生物污染的危险性。）减少细胞被微生物污染的危险性。（4 4）避免有限细胞系出现衰老或恶性转变）避免有限细胞系出现衰老或恶性转变（5 5）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变和形态改变冷冻保存要点冷冻保存要点（1）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟控降温仪，按每分钟-1 到到 -3速度降温，一速度降温，一直到直到-80以下，然后直接放入液氮中长期保存以下，然后直接放入液氮中长期保存（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。，无微生物污染。（3）细胞浓度控制在：）细胞浓度控制在：11061107/ml。（4）使用高浓度血清（）使用高浓度血清（30%30%）（5）使用合适的细胞冷冻保护剂（）使用合适的细胞冷冻保护剂（DMSODMSO、甘油）、甘油）细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（5-5-10%10%，培养基（，培养基（60%60%），血清（），血清（30%30%）。）。细胞冻存实用程序细胞冻存实用程序l收集细胞收集细胞l冻存液重悬分装入冻存管冻存液重悬分装入冻存管106-107/mLl4 40min 40minl-20 30-60 min-20 30-60 minl-30 30min-30 30minl-80 -80 过夜过夜l液氮罐保存并记录液氮罐保存并记录冷冻保存细胞的解冻与复苏冷冻保存细胞的解冻与复苏（1）快速解冻）快速解冻（2）解冻操作过程动作要轻）解冻操作过程动作要轻特别注意：特别注意：l解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入放入37水浴中。切不可直接用手，以免冻水浴中。切不可直接用手，以免冻伤伤l冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染管盖面，否则，易发生污染解冻冷冻保存细胞的离心方法解冻冷冻保存细胞的离心方法:1.1.从液氮中取出冻存的细胞，立即放入从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37水浴水浴中快速解冻。中快速解冻。2.2.将将12ml 冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。细胞生长培养液中，轻轻混匀。3.3.用用80g 离心离心23 分钟（分钟（800-1000rpm 5min800-1000rpm 5min），），弃上清液。弃上清液。4.4.用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。胞。5.5.接种细胞到培养瓶中，起始密度不低于接种细胞到培养瓶中，起始密度不低于3105/ml。24-48h 24-48h 后换液。后换液。1.4 1.4 体外培养细胞的种类体外培养细胞的种类 细胞系细胞系细胞株细胞株二倍体细胞二倍体细胞遗传缺陷细胞遗传缺陷细胞肿瘤细胞肿瘤细胞（一）细胞系（一）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。续细胞系或无限细胞系。（二）细胞株（二）细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株胞群，亦可称之为亚株（三）二倍体细胞（三）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（体数相同或基本相同（2n2n细胞占细胞占7575或或8080以以上）的细胞群，称上）的细胞群，称二倍体细胞二倍体细胞。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为改变者为假二倍体假二倍体。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或或2 25 5代即大量冻存作为代即大量冻存作为原种。原种。（四）遗传缺陷细胞（四）遗传缺陷细胞从有先天遗传缺陷者取材（主要为成从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。也可呈异倍体。（五）肿瘤细胞系或株（五）肿瘤细胞系或株这是现有细胞系中最多的一类，我国已这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。和异体接种致瘤性。细胞系或细胞株的命名细胞系或细胞株的命名 HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天传代，每次天传代，每次接种接种3105细胞毫升。细胞毫升。细胞系或株的鉴定、管理和使用细胞系或株的鉴定、管理和使用 ATCCATCC入库细胞要求检测项目如下：入库细胞要求检测项目如下：http:/www.atcc.orghttp:/www.atcc.org培养简历：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等代数等冻冻 存存 液：液：培养基和防冻液名称培养基和防冻液名称细胞活力：细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性融解前后细胞接种存活率和生长特性培培 养养 液：液：培养基种类和名称（一般要求不含抗培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量生素）、血清来源和含量细胞形态：细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性融解后细胞生长特性核核 型：型：二倍体或多倍体，标记染色体的二倍体或多倍体，标记染色体的有无有无无污染检测：无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等虫和病毒等物种检测：物种检测：检测同工酶，以证明细胞有否交检测同工酶，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测叉污染以及反转录酶检测免疫检测：免疫检测：一两种血清学检测一两种血清学检测细胞建立者：细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名建立者姓名；检测者姓名 细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡:是能量依赖的细胞内死亡程是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞