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第八章第八章 特种实验动物特种实验动物1杜小燕（杜小燕（Ph.DPh.D）emailemail：第一节第一节 免疫缺陷动物免疫缺陷动物一、概念一、概念 1962年年，苏苏格格兰兰医医师师Issacson等等发发现现无无胸胸腺腺裸裸小小鼠鼠。1969年年，Rygaard首首次次成成功功将将人人类类恶性肿瘤移植于裸小鼠体内。恶性肿瘤移植于裸小鼠体内。免疫缺陷动物免疫缺陷动物(immunodeficient animal)是是指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。多种免疫系统组成成分缺陷的动物。2二、二、免疫缺陷动物的分类免疫缺陷动物的分类 从单一的从单一的T淋巴细胞免疫缺陷到几种淋巴细胞免疫缺陷到几种免疫细胞联合缺陷动物；从自发突变的免疫细胞联合缺陷动物；从自发突变的先天性免疫缺陷到后天获得性免疫缺陷。先天性免疫缺陷到后天获得性免疫缺陷。3三三 常用免疫缺陷动物的生物学特征常用免疫缺陷动物的生物学特征 一、裸小鼠一、裸小鼠 指先天性无胸腺无毛的裸体小鼠指先天性无胸腺无毛的裸体小鼠(Nude mice)。导致这种异常状态的裸基因。导致这种异常状态的裸基因(nu)是一个是一个位于位于11号染色体上隐性突变基因。纯合裸基因号染色体上隐性突变基因。纯合裸基因（nu/nu）小鼠具有典型缺陷特征：）小鼠具有典型缺陷特征：体外表无毛，无胸腺。不能使体外表无毛，无胸腺。不能使T细胞正常分细胞正常分化，细胞免疫力低下。化，细胞免疫力低下。B细胞功能基本正常，成细胞功能基本正常，成年裸小鼠（年裸小鼠（68周龄）较普通鼠有较高水平的周龄）较普通鼠有较高水平的NK细胞细胞 活性，但幼鼠（活性，但幼鼠（34周龄）的周龄）的NK细胞细胞活性低下，裸小鼠粒细胞数比普通小鼠低。活性低下，裸小鼠粒细胞数比普通小鼠低。4 应用：应用：（一）在微生物学方面（一）在微生物学方面 感染麻风杆菌裸小鼠的病理组织学特征与人的结感染麻风杆菌裸小鼠的病理组织学特征与人的结节性麻风非常相似。节性麻风非常相似。（二）在免疫学方面（二）在免疫学方面 有人用有人用BALB/c品系的裸小鼠制备单克隆抗体。品系的裸小鼠制备单克隆抗体。（三）在寄生虫学方面（三）在寄生虫学方面 胸腔内接种卡氏肺囊虫，能成功复制出卡氏肺囊胸腔内接种卡氏肺囊虫，能成功复制出卡氏肺囊虫疾病模型。虫疾病模型。（四）在遗传学方面（四）在遗传学方面 裸裸小小鼠鼠因因遗遗传传背背景景的的不不同同，所所表表现现的的细细胞胞免免疫疫反反应应和实验室检查指标也不同。和实验室检查指标也不同。5 二、裸大鼠二、裸大鼠 裸大鼠裸大鼠(Nude rat)，在，在1953年由英国年由英国Rowett首先发现，基因符号为首先发现，基因符号为rnu。纯合子裸。纯合子裸大鼠（大鼠（rnu/rnu）具有与裸小鼠基本相似的特征，）具有与裸小鼠基本相似的特征，能接受人类正常组织和肿瘤的异种移植，体型能接受人类正常组织和肿瘤的异种移植，体型大可为常规血液学和血清生物化学分析实验提大可为常规血液学和血清生物化学分析实验提供足够的血样，也可为各种研究提供足够的瘤供足够的血样，也可为各种研究提供足够的瘤组织。易于进行外科手术，为各部位保瘤移植组织。易于进行外科手术，为各部位保瘤移植和肿瘤供血研究提供了方便。和肿瘤供血研究提供了方便。6 三、性连锁免疫缺陷小鼠三、性连锁免疫缺陷小鼠 (X-linked immune deficiency mouse XID)起源于起源于CBA/N品系。品系。B细胞功能缺陷，细胞功能缺陷，基因符号基因符号xid，位于，位于X性染色体上。纯合子雌性染色体上。纯合子雌鼠（鼠（xid/xid）和杂合子雄鼠（）和杂合子雄鼠（xid/Y）对非）对非胸腺依赖性胸腺依赖性型抗原没有体液免疫反应，是型抗原没有体液免疫反应，是研究研究B淋巴细胞的发生、功能与异质性理想淋巴细胞的发生、功能与异质性理想动物。动物。7 四、四、Beige小鼠小鼠 为为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，细胞活性缺陷的突变系小鼠，bg是隐性突变基因，位于第是隐性突变基因，位于第13号染色体上。号染色体上。纯合的小鼠（纯合的小鼠（bg/bg），表型特征与人的齐），表型特征与人的齐-希二氏综合征（希二氏综合征（Chediak-Higashi syndrome）相似。由于溶酶体功能缺陷，）相似。由于溶酶体功能缺陷，bg对各种病原因子较敏感。在对各种病原因子较敏感。在SPF环境中环境中才能较好地生存。采用纯合子繁殖。才能较好地生存。采用纯合子繁殖。8 五、严重联合免疫缺陷小鼠五、严重联合免疫缺陷小鼠 SCID小小鼠鼠（severe combined immunodeficient mice）在在1983年年由由美美国国学学者者Bosma首首先先发发现现于于C.B-17近近交交系系小小鼠鼠，是是位位于于第第16号号染染色色体体的的称称之之为为scid的的单单个个隐隐性性突突变变基基因因所所导导致致。SCID小小鼠鼠在在高高度度洁洁净净的的SPF条条件件下下存存活活1年左右年左右.910 第二节第二节 转转 基基 因因 动动 物物19821982年，年，Richard Palmiter Richard Palmiter 和和 Ralph Brinster Ralph Brinster 领导的研究小领导的研究小组将大鼠的生长激素基因，显微注射到小鼠胚胎中，从而培育组将大鼠的生长激素基因，显微注射到小鼠胚胎中，从而培育出了出了世界上第一批转基因小鼠。世界上第一批转基因小鼠。Gordon（1980）等采用原核显微注射法获得了第一例转基因小鼠。Palmiter（1982）等采用显微注射法将带有小鼠mMt启动子的大鼠生长激素基因注入小鼠的受精卵中，获得“超级小鼠”，引起巨大轰动。12一、转基因动物的研究历史一、转基因动物的研究历史1 1、19601960年代，将外源基因导入鸡的卵年代，将外源基因导入鸡的卵巢和睾丸，得到性状改变的鸡，估巢和睾丸，得到性状改变的鸡，估计是转基因鸡。计是转基因鸡。2 2、19741974年，美国珍尼斯首次用显微注年，美国珍尼斯首次用显微注射法获得体细胞有射法获得体细胞有SVSV4040病毒病毒DNADNA的小的小鼠。鼠。3 3、19801980年，戈登完善了显微注射技术。年，戈登完善了显微注射技术。134 4、19821982年，帕尔米特将大鼠生长激素基因年，帕尔米特将大鼠生长激素基因结构区融合在结构区融合在SMSM（金属巯蛋白基因（金属巯蛋白基因（MTMT）启动子）中，注射到小鼠受精卵）启动子）中，注射到小鼠受精卵雄性原核内，获得体型似大鼠的转基因雄性原核内，获得体型似大鼠的转基因小鼠。小鼠。5 5、19851985年，英国拉尔夫布林斯特研制出能年，英国拉尔夫布林斯特研制出能生成人类生长激素的转基因猪。生成人类生长激素的转基因猪。6 6、19891989年，意大利拉维特拉纳运用精子载年，意大利拉维特拉纳运用精子载体法转移外源性体法转移外源性DNADNA，获得，获得PSV2PSV2CATCAT转转基因小鼠。基因小鼠。147 7、我国、我国19801980年代开始转基因动物年代开始转基因动物研究，成功研制出转基因牛、小研究，成功研制出转基因牛、小鼠、猪、羊、兔、金鱼。鼠、猪、羊、兔、金鱼。1516 通过基因工程对通过基因工程对DNA进行体外操作，添加进行体外操作，添加或删除一个特殊的或删除一个特殊的DNA序列，然后导入早期的序列，然后导入早期的胚胎细胞，所产生遗传结构得以修饰的动物，胚胎细胞，所产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的性状可以遗传给后代。这些其改变的性状可以遗传给后代。这些“New Animal”统统称为转基因动物。称为转基因动物。二、二、转基因动物的概念转基因动物的概念（二）转基因动物命名（二）转基因动物命名转基因的命名遵循以下原则：转基因的命名遵循以下原则：符符号号：一一个个转转基基因因符符号号由由以以下下三三部部分分组组成成，均均以以罗罗马字体表示：马字体表示：TgX （YYYYYY）#Zzz，其中各部分符号表示含意为：其中各部分符号表示含意为：TgX =方式（方式（mode）（YYYYYY）=插插 入入 片片 段段 标标 示示（insert designation）#=实实验验室室指指定定序序号号 （laboratory-assigned number）及）及Zzz =实验室注册代号实验室注册代号(laboratory code)例如例如:C57BL/6J-TgN（CD8Ge）23Jwg 是来源于美国杰克逊研究所（是来源于美国杰克逊研究所（J）的）的C57BL/6品系小品系小鼠被转入人的鼠被转入人的CD8基因组（基因组（Ge）；转基因在）；转基因在JonW.Gordon(Jwg)实验室完成，获取于一系列显实验室完成，获取于一系列显微注射后得到的序号为微注射后得到的序号为23的小鼠。的小鼠。根根据据转转基基因因动动物物命命名名的的原原则则，如如果果转转基基因因动动物物的的遗遗传传背背景景是是由由不不同同的的近近交交系系或或远远交交群群之之间间混混合合而而成成时时，则该转基因符号应不使用动物品系或种群的名称。则该转基因符号应不使用动物品系或种群的名称。转基因符号可以缩写，即去掉插入片断标示部份，转基因符号可以缩写，即去掉插入片断标示部份，例如例如TgN（GPDHIm）1Bir 可缩写为可缩写为TgN 1 Bir。一般在文章中第一次出现时使用全称，以后再出现一般在文章中第一次出现时使用全称，以后再出现时可使用缩写名称。时可使用缩写名称。三、三、制备转基因动物的方法制备转基因动物的方法 卵 受精卵 2-细胞胚 4-细胞胚 桑葚胚 早期囊胚 Zygote Fertilized zgote 2-cell stage 4-cell stage Morula Blastocyte 精子精子载体体导入法入法 显微注射法微注射法 逆逆转录病毒法病毒法 胚胎干胚胎干细胞法胞法 超数排卵母鼠超数排卵母鼠 公公 鼠鼠 显微注射产生转基因小鼠显微注射产生转基因小鼠 向假孕母鼠人向假孕母鼠人向假孕母鼠人向假孕母鼠人工植入受精卵工植入受精卵工植入受精卵工植入受精卵结扎输精管的公鼠结扎输精管的公鼠 母母 鼠鼠受精卵受精卵外源基因已外源基因已注入受精卵注入受精卵雄性原核雄性原核假孕母鼠假孕母鼠怀孕母鼠怀孕母鼠可能带有外源基因片段的小鼠可能带有外源基因片段的小鼠PCR/Southern-blotRT-PCR/Western-blot/Immunohistochemistry 取取 卵卵显微操作步骤显微操作步骤 移移植植 注注射射（持卵针）（持卵针）（穿刺针）（穿刺针）安安乐死死体体视镜释放卵放卵酶处理理锻针器器拉拉针器器 显微注射显微注射麻醉麻醉体体视镜把卵吹入把卵吹入输卵管卵管体视显微镜体视显微镜倒置显微镜倒置显微镜显微操作系统显微操作系统22（二）反转录病毒感染法（二）反转录病毒感染法 将外源基因将外源基因DNA插入逆转录病插入逆转录病毒载体；通过辅助细胞包装成病毒毒载体；通过辅助细胞包装成病毒颗粒，感染胚胎；再将感染的桑颗粒，感染胚胎；再将感染的桑椹期胚胎导入子宫。椹期胚胎导入子宫。23（三）胚胎干细胞法（三）胚胎干细胞法 （1 1）获取胚胎干细胞（）获取胚胎干细胞（ESES细胞）；细胞）；（2 2）将外源基因导入）将外源基因导入ESES细胞；细胞；（3 3）获取囊胚期胚胎；）获取囊胚期胚胎；（4 4）将含有外源基因的）将含有外源基因的ESES细胞注入细胞注入囊胚期胚胎的腔内；囊胚期胚胎的腔内；（5 5）将其移植到假孕动物子宫。）将其移植到假孕动物子宫。24（四）电脉冲法（四）电脉冲法 利用外界高电压短脉冲使细利用外界高电压短脉冲使细胞膜产生可逆性穿孔，外源性胞膜产生可逆性穿孔，外源性DNA通过此孔可进入细胞。通过此孔可进入细胞。（五）精子载体导入法（五）精子载体导入法 以精子作为外源性以精子作为外源性DNA的载的载体，通过受精作用将外源性体，通过受精作用将外源性DNA导入受精卵。导入受精卵。25四、转基因动物的进展四、转基因动物的进展四、转基因动物的进展四、转基因动物的进展广空458医院转基因工程研究室的传肝炎小鼠美国佛罗里达州立大学戴碧法多尔领导的研究小组培育出一种具有超凡嗅觉能力的转基因实验鼠。27美国密苏里大学通过克隆技术培育了4只含有水母荧光转基因猪 28英国转基因猪日本转基因猪29黄禹锡教授正在为刚刚出生的转基因克隆猪打针30中国科学院上海实验动物中心中国科学院上海实验动物中心31转基因荧光兔转基因荧光鱼 32（Chan AWS,et al.Science 2001;291:309-312）绿色荧光蛋白（GFP）基因猴的组织被证明含有绿色荧光蛋白质的转基因表达，“安迪”于年月日诞生 33“安迪”与其妈妈3435五、转基因动物的应用：五、转基因动物的应用：（一）生命现象的基础理论研究：（一）生命现象的基础理论研究：1、发育生物学研究：、发育生物学研究：通过了解基因的表达、关闭和调通过了解基因的表达、关闭和调控，了解调控顺序。控，了解调控顺序。2、遗传学研究、遗传学研究 观察导入的突变基因的表达，了观察导入的突变基因的表达，了解基因结构与功能的关系，还可用于解基因结构与功能的关系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等.36（二）医学研究：（二）医学研究：1、心血管疾病研究：、心血管疾病研究：将转脂蛋白和转纤维蛋白溶酶将转脂蛋白和转纤维蛋白溶酶原等作为外源原等作为外源DNA转入动物体内，转入动物体内，建立心血管疾病转基因动物模型。建立心血管疾病转基因动物模型。2、肿瘤学研究：、肿瘤学研究：肿瘤基因肿瘤基因 肿瘤转基因动物模型。肿瘤转基因动物模型。373 3、遗传病研究：、遗传病研究：导入遗传疾病外源基因，制作遗导入遗传疾病外源基因，制作遗传疾病转基因动物模型；导入正常基传疾病转基因动物模型；导入正常基因，弥补基因缺陷所致遗传疾病。因，弥补基因缺陷所致遗传疾病。4 4、免疫学研究：、免疫学研究：用转基因用转基因HBsAGHBsAG小鼠模型研究免疫小鼠模型研究免疫耐受性的问题。耐受性的问题。38（三）改良和培育动物新品种：（三）改良和培育动物新品种：使用重组使用重组DNADNA的转基因技术，培育的转基因技术，培育出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗料极少的转基因家畜。料极少的转基因家畜。（四）研制和生产生物活性物质：（四）研制和生产生物活性物质：将具有医学价值的生物活性物质将具有医学价值的生物活性物质（如组织型纤溶蛋白元激活因子，（如组织型纤溶蛋白元激活因子，tPAtPA）导入家畜或家禽的受精卵，从转）导入家畜或家禽的受精卵，从转基因动物的体液如乳汁、血液、尿液、基因动物的体液如乳汁、血液、尿液、腹水中收获基因产物。腹水中收获基因产物。39图中上侧为转基因鱼40北京华大台湾4142中国农业大学、西北农业科技大学等单位成功地培育出体细胞克隆牛 43我国首批转基因克隆牛的再克隆体在梁山降生，共出生五头，存活三头，分别取名为福欢娃、福迎娃和福圣娃44六、转基因疾病动物模型与基因治疗六、转基因疾病动物模型与基因治疗 动物模型动物模型（一）转基因疾病动物模型：（一）转基因疾病动物模型：1 1、病毒性疾病模型：、病毒性疾病模型：（1 1）小儿麻痹病毒受体转基因小鼠）小儿麻痹病毒受体转基因小鼠（2 2）乙型肝炎病毒携带者模型）乙型肝炎病毒携带者模型（3 3）乙型肝炎表面抗原转基因动物）乙型肝炎表面抗原转基因动物 模型模型2 2、肿瘤转基因动物模型、肿瘤转基因动物模型 453 3、代谢疾病转基因动物模型、代谢疾病转基因动物模型（1 1）高歇氏病转基因动物模型）高歇氏病转基因动物模型（2 2）家族性神经多发性淀粉样变）家族性神经多发性淀粉样变（FAPFAP）转基因小鼠）转基因小鼠（二）基因治疗的动物模型：（二）基因治疗的动物模型：将外源生长激素基因导入将外源生长激素基因导入“侏儒侏儒症症”小鼠小鼠个头增大个头增大3 3倍，恢复生育倍，恢复生育能力。能力。46 左侧为转移了大鼠生长激素基因的小鼠左侧为转移了大鼠生长激素基因的小鼠 19821982年，年，Richard Palmiter Richard Palmiter 和和 Ralph Brinster Ralph Brinster 领导领导的一个小组将一个能够被锌调控的的一个小组将一个能够被锌调控的DNADNA元件与大鼠的生长激元件与大鼠的生长激素基因连在一起，并将其注射到了受精了的小鼠胚胎中，素基因连在一起，并将其注射到了受精了的小鼠胚胎中，从而培育出了从而培育出了世界上第一批转基因小鼠。世界上第一批转基因小鼠。这些转基因小鼠这些转基因小鼠长期取食含有足量锌的食物后，就会长得非常大。转基因长期取食含有足量锌的食物后，就会长得非常大。转基因小鼠的出现掀起了遗传学研究的新的浪潮。小鼠的出现掀起了遗传学研究的新的浪潮。47 基因敲除动物基因敲除动物 一、概述一、概述 是指对一个结构已知但功能未知的基因，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除从分子水平上设计实验，将该基因去除（knock out），或用其它顺序相近基因），或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。相应基因的功能。4819871987年，年，Martin EvansMartin Evans，Oliver Smithies Oliver Smithies 和和 Mario Mario Capecch Capecch 领导的几个研究小组对胚胎干细胞中特定目领导的几个研究小组对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠第一只基因敲除小鼠。这。这三位科学家因为这项工作在三位科学家因为这项工作在20012001获得了获得了LaskerLasker奖。接奖。接下来，科学家们用同样的技术又培育出了几千只基因下来，科学家们用同样的技术又培育出了几千只基因敲除小鼠。敲除小鼠。49 基因敲除动物的建立基因敲除动物的建立 在体外先构建一个打靶载体，这个载体上含有一段与欲敲除的基因具有高度同源性外源基因，在外源基因中插入一带有启动子的选择标记基因，把这个含有修饰后外源基因的载体利用转染的方法导入ES细胞中，这样导入细胞中的外源基因就有机会与染色体上的靶基因发生同源重组，把修饰的外源基因置换到ES细胞中，通过筛选标记基因而检出发生同源重组的ES细胞并在体外扩增，将此ES细胞注入供体囊胚，再将带有此ES细胞的囊胚胎移植到假孕鼠的子宫内，发育成一个嵌合体，经过进一步杂交传代的方法，使外源基因纯合，即建立成基因敲除动物。50第三节第三节 克隆动物克隆动物一、一、克隆动物的概念克隆动物的概念 cloning animal 动物通过体细胞进行的无性生殖（也动物通过体细胞进行的无性生殖（也称无性繁殖）以及由无性生殖形成的基因称无性繁殖）以及由无性生殖形成的基因型几乎完全相同的后代个体组成的群体。型几乎完全相同的后代个体组成的群体。世界卫生组织在关于克隆的非正式声世界卫生组织在关于克隆的非正式声明中定义为：明中定义为：遗传上同一的机体或细胞系（株）的遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性生殖。无性生殖。二、二、动物克隆技术的基本方法动物克隆技术的基本方法 （一）胚胎分割（一）胚胎分割 （二）细胞核移植：（二）细胞核移植：1.1.胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植 2.2.胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植 3.3.胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植 4.4.体细胞核移植体细胞核移植52（一）胚胎分割：（一）胚胎分割：将胚胎分割成将胚胎分割成2 2份、份、4 4份。份。（二）细胞核移植（孤雌繁殖）（二）细胞核移植（孤雌繁殖）将一个细胞的细胞核移植到将一个细胞的细胞核移植到另一个去掉细胞核的卵或细胞另一个去掉细胞核的卵或细胞中，再移植到雌性动物的子宫中，再移植到雌性动物的子宫中孕育成熟。中孕育成熟。53卵母细胞卵母细胞 去核卵母细胞去核卵母细胞胚胎干细胞或其他细胞的胚胎干细胞或其他细胞的细胞核细胞核 细胞核移植技术细胞核移植技术核移植核移植54 1、胚胎细胞核移植、胚胎细胞核移植:将单个早期胚胎细胞导入去将单个早期胚胎细胞导入去除细胞核的未受精的成熟卵母细除细胞核的未受精的成熟卵母细胞，经电融合，使卵母细胞质与胞，经电融合，使卵母细胞质与导入的胚胎细胞核融合、分裂、导入的胚胎细胞核融合、分裂、发育成胚胎，将胚胎移植给受体发育成胚胎，将胚胎移植给受体继续孕娠。继续孕娠。55 2 2、胚胎干细胞核移植：、胚胎干细胞核移植：胚胎或胎儿原始生殖细胞经过胚胎或胎儿原始生殖细胞经过抑制分化培养，让细胞数目增加，抑制分化培养，让细胞数目增加，但不分化。将单个胚胎干细胞按照但不分化。将单个胚胎干细胞按照（二）（二）1 1、的方法进行核移植。、的方法进行核移植。3 3、胎儿成纤维细胞核移植：、胎儿成纤维细胞核移植：从孕娠早期的胎儿体内分离出从孕娠早期的胎儿体内分离出胎儿成纤维细胞，按照（二）胎儿成纤维细胞，按照（二）1 1、的、的方法进行核移植。方法进行核移植。56 4、体细胞核移植：、体细胞核移植：将动物体细胞经过抑制培养，使将动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态，细胞处于休眠状态，进行核移植。绵羊进行核移植。绵羊“多利多利”就是利用体就是利用体细胞核移植技术培细胞核移植技术培育成功的世界第一育成功的世界第一只克隆哺乳类动物。只克隆哺乳类动物。571 1、从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取、从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；细胞称之为供体细胞；2 2、从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢、从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；此细胞称之为受体细胞；3 3、利用电脉冲的方法，使供体细胞、利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；分裂、分化，从而形成胚胎细胞；4 4、将胚胎细胞转移到另一只苏格兰、将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。步分化和发育，最后形成一只小绵羊。多莉羊的克隆多莉羊的克隆5820032003年年2 2月月1414日日，英英国国苏苏格格兰兰爱爱丁丁堡堡罗罗斯斯林林研研究究所所的的科科学学家家宣宣布布，全全世世界界第第一一个个克克隆隆动动物物多多利利羊羊已已经经死死亡亡，活活了了6 6年年半半。当当科科学学家家们们发发现现它它患患上上无无法法治治愈愈的的肺肺病病后后，决决定定实实施施“安安乐乐死死”让它长眠。让它长眠。一一般般说说来来，一一只只绵绵羊羊平平均均可可以以活活年年，而而多多莉莉今今年年只只有有岁岁，寿寿命仅相当于普通羊的一半。命仅相当于普通羊的一半。59三、克隆动物的研究概况：三、克隆动物的研究概况：（1）1952年，用豹蛙囊胚期细胞年，用豹蛙囊胚期细胞核进行了核移植，获得可以摄食核进行了核移植，获得可以摄食的幼体。的幼体。（2）1962年，将非洲爪蟾的小肠年，将非洲爪蟾的小肠上皮细胞的核注入同种或异种非上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾去核的未受精卵中，约洲爪蟾去核的未受精卵中，约1%发育为成熟蛙。发育为成熟蛙。60（3 3）19861986年，用胚胎分裂球与去核未年，用胚胎分裂球与去核未受精卵融合，并用仙台病毒或电激诱受精卵融合，并用仙台病毒或电激诱导，用核移植技术培育出克隆绵羊。导，用核移植技术培育出克隆绵羊。（4 4）1994199419961996年，维尔穆特培育出年，维尔穆特培育出克隆绵羊克隆绵羊“多利多利”。（5 5）我国的克隆动物研究：）我国的克隆动物研究：先后培育出克隆山羊、先后培育出克隆山羊、兔、牛、小鼠，曹谊林博士兔、牛、小鼠，曹谊林博士在裸小鼠身上克隆出人耳。在裸小鼠身上克隆出人耳。61克隆牛克隆牛克隆鼠克隆鼠克隆山羊克隆山羊克隆猫克隆猫62 我国首批本土自主克隆牛，这我国首批本土自主克隆牛，这5头出头出生在山东的克隆牛于生在山东的克隆牛于2003年年8月通过人工月通过人工授精成功受孕，预产期为授精成功受孕，预产期为2004年年4月中旬月中旬。这是我国自主完成的体细胞。这是我国自主完成的体细胞“克隆牛克隆牛”，首次通过无性方式怀孕。，首次通过无性方式怀孕。63我国首例异种克隆羊我国首例异种克隆羊20042004年年1 1月月2121日零时日零时在新疆诞生。异种克在新疆诞生。异种克隆羊不同于世界上第隆羊不同于世界上第一只克隆羊一只克隆羊“多莉多莉”的同种体细胞核移植的同种体细胞核移植的克隆方法，而是把的克隆方法，而是把A A种动物体细胞的细胞种动物体细胞的细胞核移植到核移植到B B种动物的种动物的去核卵细胞中，生出去核卵细胞中，生出A A种动物。种动物。图为图为1 1月月3030日，异种克日，异种克隆北山羊（右）与接受胚隆北山羊（右）与接受胚胎的母山羊在一起（左）胎的母山羊在一起（左）64胚胎细胞克隆兔在广西大学出生胚胎细胞克隆兔在广西大学出生 过程：先从一只兔子身上获得早期胚胎，注过程：先从一只兔子身上获得早期胚胎，注入已去除细胞核的成熟卵母细胞中，融合形成重入已去除细胞核的成熟卵母细胞中，融合形成重组胚。重组胚在体外培养后，移入一只雌性兔子组胚。重组胚在体外培养后，移入一只雌性兔子的输卵管内，经过的输卵管内，经过3434天的正常孕期后，克隆兔天的正常孕期后，克隆兔（后）顺利降生。（后）顺利降生。65 意大利科学家意大利科学家20042004年年6 6月成功培育出世界上首月成功培育出世界上首匹匹“自体克隆马自体克隆马”（前）。这匹名叫（前）。这匹名叫“普罗米塔普罗米塔”的小母马（前）的的小母马（前）的“妈妈妈妈”（后）同时也是其（后）同时也是其“姐姐姐姐”。66 在在20002000年美国的年美国的科学科学杂志上，科学家宣杂志上，科学家宣布，他们使用新的方法成功地克隆了一只恒河猴布，他们使用新的方法成功地克隆了一只恒河猴，该猕猴被命名为，该猕猴被命名为“泰特拉泰特拉”（TetraTetra），），TetraTetra是希腊词，意义为是希腊词，意义为“四四”，看来，科学家以此来，看来，科学家以此来暗示他们暗示他们“一分为四一分为四”的方法。的方法。这是与人类血缘这是与人类血缘最近的动物最近的动物灵长目动物第一次被成功克隆灵长目动物第一次被成功克隆。科学家希望，使用这种方法能生成基因完全相同科学家希望，使用这种方法能生成基因完全相同的动物，供在研究诸如糖尿病和帕金森病等人类的动物，供在研究诸如糖尿病和帕金森病等人类疾病时使用。疾病时使用。67四、动物克隆技术的意义与应用：四、动物克隆技术的意义与应用：（1）生物医药方面生物医药方面：对能够生产抗凝血酶、血清白对能够生产抗凝血酶、血清白蛋白等的转基因动物进行克隆，大蛋白等的转基因动物进行克隆，大批生产该药。批生产该药。（2）医学方面医学方面：利用克隆技术培育模型动物利用克隆技术培育模型动物（高血压等），直接克隆出人的心、（高血压等），直接克隆出人的心、肝、肾等器官，供器官移植。肝、肾等器官，供器官移植。6869美国密苏里大学通过克隆技术培育出四只含有荧美国密苏里大学通过克隆技术培育出四只含有荧光水母基因的小猪。五只小猪中有四只小猪的猪光水母基因的小猪。五只小猪中有四只小猪的猪嘴和猪蹄呈荧光黄色（左），剩下的一只小猪嘴和猪蹄呈荧光黄色（左），剩下的一只小猪（右）和正常小猪无异。专家们称，荧光小猪的（右）和正常小猪无异。专家们称，荧光小猪的成功培育对培育动物器官用于人体移植具有重要成功培育对培育动物器官用于人体移植具有重要意义。意义。70（3）畜牧业方面畜牧业方面：选育良种后进行克隆，加快选育良种后进行克隆，加快培育良种的速度。培育良种的速度。（4）保存物种保存物种：保存或克隆大熊猫等珍稀濒保存或克隆大熊猫等珍稀濒危动物。危动物。7172附：该不该克隆大熊猫附：该不该克隆大熊猫 权威专家不支持克隆大熊猫权威专家不支持克隆大熊猫 具体理由有具体理由有3 3个：个：一、克隆大熊猫本身还有缺陷或者说不很完善、成熟。一、克隆大熊猫本身还有缺陷或者说不很完善、成熟。特别是在异种动物的克隆技术上的困难更多，比如在其他特别是在异种动物的克隆技术上的困难更多，比如在其他家畜上的研究表明，一般情况下异种动物克隆的胚胎发育家畜上的研究表明，一般情况下异种动物克隆的胚胎发育到囊胚阶段后就会停止发育，这个问题到现在无法解决。到囊胚阶段后就会停止发育，这个问题到现在无法解决。二、就现在成功的克隆动物研究例子来说，其成功率二、就现在成功的克隆动物研究例子来说，其成功率也极低，异种动物的克隆目前尚未有个体成活的报道。也极低，异种动物的克隆目前尚未有个体成活的报道。三、即使克隆技术完善了，异种动物的克隆技术成功三、即使克隆技术完善了，异种动物的克隆技术成功了，类似大熊猫这样的濒危物种也不可能靠其得到拯救。了，类似大熊猫这样的濒危物种也不可能靠其得到拯救。因为克隆动物只是个体的复制，它根本无利物种本身的遗因为克隆动物只是个体的复制，它根本无利物种本身的遗传多样性保护。与其把有限的资金花到这种前景不明的项传多样性保护。与其把有限的资金花到这种前景不明的项目，不如集中精力搞好大熊猫就地和异地保护。目前鼓动目，不如集中精力搞好大熊猫就地和异地保护。目前鼓动大熊猫克隆之说，无异于舍本求末。大熊猫克隆之说，无异于舍本求末。73 美国科学家美国科学家2003年年5月宣布培育出一头克隆骡子（左）月宣布培育出一头克隆骡子（左）。这头小公骡被取名为。这头小公骡被取名为“爱达荷宝石爱达荷宝石”。它头上戴有它头上戴有3 3个个“世界第一世界第一”桂冠：第一个克隆的骡子，第一个克隆的马桂冠：第一个克隆的骡子，第一个克隆的马科动物，第一个克隆的杂种动物。科动物，第一个克隆的杂种动物。科学家们说，该成果将科学家们说，该成果将有助于克隆其他自身繁殖有困难的濒危动物，对研究癌症有助于克隆其他自身繁殖有困难的濒危动物，对研究癌症等疾病也有重要的参考价值。等疾病也有重要的参考价值。骡子体内包含骡子体内包含6363个染色体，个染色体，是有是有6262个染色体的公驴和有个染色体的公驴和有6464个个染色体的母马所生的种间杂种，染色体的母马所生的种间杂种，通常情况下没有生育能力。研究通常情况下没有生育能力。研究发现，细胞内的钙含量会对马科发现，细胞内的钙含量会对马科动物细胞生长和繁殖产生重要影动物细胞生长和繁殖产生重要影响，马科动物繁殖过程中细胞内响，马科动物繁殖过程中细胞内钙含量格外高。科学家们基于这钙含量格外高。科学家们基于这一发现对实验进行了改进，提高了克隆骡子胚胎培养液的一发现对实验进行了改进，提高了克隆骡子胚胎培养液的钙浓度，最终成功培育出钙浓度，最终成功培育出“爱达荷宝石爱达荷宝石”。科学家们说，。科学家们说，同样的方法对克隆其他马科动物应该也适用。同样的方法对克隆其他马科动物应该也适用。74 2003 2003年年1212月月2222日，美国得克萨斯农业和日，美国得克萨斯农业和机械大学公布了世界上第一头克隆鹿的照片。机械大学公布了世界上第一头克隆鹿的照片。这头取名为这头取名为“杜威杜威”的白尾小鹿于的白尾小鹿于20032003年年5 5月月2323日出生，是该校兽医学院和日出生，是该校兽医学院和ViagenViagen公司公司合作培育的产物。这一成果被认为在濒危鹿合作培育的产物。这一成果被认为在濒危鹿种保护等领域具有潜在应用价值。种保护等领域具有潜在应用价值。75 第四节第四节 转基因动物和克隆动物的转基因动物和克隆动物的 生物安全与社会安全生物安全与社会安全（1）生物安全）生物安全大自然正常的生态大自然正常的生态平衡被打破。平衡被打破。（2）社会安全）社会安全涉及技术、宗教、涉及技术、宗教、伦理等问题。如有人担心，坏人会克伦理等问题。如有人担心，坏人会克隆出第二个希特勒，造成世界大乱。隆出第二个希特勒，造成世界大乱。76新近克隆的新近克隆的8 8个人类胚胎的早期阶段个人类胚胎的早期阶段韩国科学家和美国韩国科学家和美国科学科学周刊周刊20042004年年2 2月月1212日日宣布克隆出世界上第一批成熟人类胚胎，称这是宣布克隆出世界上第一批成熟人类胚胎，称这是克隆技术的又一重大进克隆技术的又一重大进展，有助于进一步加快展，有助于进一步加快用干细胞治疗疾病的研用干细胞治疗疾病的研究。专家则警告说，这究。专家则警告说，这一成果表明人类朝克隆出婴儿迈进了一步。一成果表明人类朝克隆出婴儿迈进了一步。7778思考题思考题1、免疫缺陷动物、免疫缺陷动物2、转基因动物（、转基因动物（Transgenic animals）3、克隆动物、克隆动物(cloning animal)79