分子诊断的临床应用.ppt

分子诊断的临床应用分子诊断的临床应用赣南医学院第一临床学院赣南医学院第一临床学院马华谋马华谋 副教授副教授 用分子生物学技术通过检测基因而达用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。学技术发展的最初阶段就有的设想。上世纪上世纪7070年代人们开始在实验室进行年代人们开始在实验室进行研究，研究，8080年代以来，基因检测在许多国家年代以来，基因检测在许多国家已成为常规检验项目，主要用于感染性和已成为常规检验项目，主要用于感染性和遗传性疾病等的诊断。遗传性疾病等的诊断。n n19531953年年Watson Watson 和和Crick Crick 提出脱氧核糖核酸提出脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型。的双螺旋结构模型。n n19901990年人类基因组计划正式启动。年人类基因组计划正式启动。n n20012001年年2 2月科学家宣布完成人类基因组的全月科学家宣布完成人类基因组的全部序列图。部序列图。DNADNA重组技术重组技术(DNA recombination)(DNA recombination)转基因技术转基因技术(transgenic technique)(transgenic technique)基因组学基因组学(genomics)(genomics)蛋白组学蛋白组学(proteomics)(proteomics)基因治疗基因治疗(genotherapygenotherapy)生物芯片生物芯片(biochip)(biochip)等技术等技术 已应用到医学领域，对疾病机理的认识、疾已应用到医学领域，对疾病机理的认识、疾病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。n分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊 断，也能确定个体对疾病的易感性，判别断，也能确定个体对疾病的易感性，判别 致病基因携带者并对疾病的分期、分型、致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。疗效监测和预后作出判断。n分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组 成部分，成为一门新的学科。成部分，成为一门新的学科。Molecular diagnosis Molecular diagnosticsMolecular diagnosis Molecular diagnosticsMolecular diagnosis Molecular diagnosticsMolecular diagnosis Molecular diagnostics 一、基因检测在感染性疾病一、基因检测在感染性疾病中的应用中的应用SARSSARS相关冠状病毒的分子诊断相关冠状病毒的分子诊断n n20032003年年4 4月，香港研究者月，香港研究者PeirisPeiris等报告了等报告了50 50 例例SARSSARS病人的临床表现和病毒学研究结果。病人的临床表现和病毒学研究结果。n n一种新的冠状病毒一种新的冠状病毒 (CoronavirusCoronavirus)是是SARS SARS 的致病原因。的致病原因。(Lancet,2003,361:9365)(Lancet,2003,361:9365)20032003年年4 4月，德国汉堡月，德国汉堡Bernhard-Bernhard-NochtNocht热带医热带医学研究所学者学研究所学者DrostenDrosten等用随机扩增技术，获等用随机扩增技术，获得一段长度为得一段长度为300bp300bp的核苷酸序列。的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量规和实时定量PCRPCR技术。技术。.org on April 10,2003 on April 10,2003 on April 10,2003 on April 10,2003）n n检测标本检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液 、血浆、粪便。、血浆、粪便。n n检测方法检测方法 1.1.逆转录逆转录-巢式巢式PCR(Reverse-Nested PCR)PCR(Reverse-Nested PCR)2.2.逆转录逆转录-实时实时PCR(Reverse-Real time PCR(Reverse-Real time PCR)PCR)n n有报道显示，在可能有报道显示，在可能SARSSARS病人中病毒的病人中病毒的检出率为检出率为100%100%。n n在疑似在疑似SARSSARS病人中的检出率为病人中的检出率为23%23%。n n所有健康接触者中未检测到病毒。所有健康接触者中未检测到病毒。另一项研究显示另一项研究显示 检测病毒的检测病毒的3 3种方法（血清学检测、病种方法（血清学检测、病毒分离、毒分离、PCRPCR技术）中技术）中，PCRPCR技术的检出率技术的检出率最高。最高。讨 论n n疾病的早期即可获得阳性结果疾病的早期即可获得阳性结果疾病的早期即可获得阳性结果疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换早于血清转换早于血清转换早于血清转换期）。期）。期）。期）。n nSARSSARSSARSSARS患者中的阳性率约为患者中的阳性率约为患者中的阳性率约为患者中的阳性率约为80%80%80%80%，对照中的阴性，对照中的阴性，对照中的阴性，对照中的阴性率约为率约为率约为率约为98%98%98%98%100%100%100%100%。n n现有的现有的现有的现有的PCRPCRPCRPCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，方法有较高的特异性但灵敏度较差，方法有较高的特异性但灵敏度较差，方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。阴性结果不能排除病毒感染。阴性结果不能排除病毒感染。阴性结果不能排除病毒感染。讨 论n n痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径。n n血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒复制不仅发生于呼吸道。n n病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪便可能也是一种传播途径。n n鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可能漏检）。SARSSARS相关冠状病毒基因检测相关冠状病毒基因检测必须注意的问题必须注意的问题n n必须在规范的基因扩增实验室中进行。n n应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。n n阳性结果时必须对原始样本重复检验：或者扩增另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。肝炎病毒基因的检测 临床价值主要体现在：临床价值主要体现在：病情评估病情评估病情评估病情评估 血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。疗疗疗疗效效效效预测预测预测预测 治治治治疗疗疗疗前病毒核酸前病毒核酸前病毒核酸前病毒核酸载载载载量越高，量越高，量越高，量越高，疗疗疗疗效越差；效越差；效越差；效越差；载载载载量越低，量越低，量越低，量越低，机体清除病毒的可能性越大。机体清除病毒的可能性越大。机体清除病毒的可能性越大。机体清除病毒的可能性越大。预后判断预后判断预后判断预后判断 病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。垂直传播途径感染者，预后较差。垂直传播途径感染者，预后较差。垂直传播途径感染者，预后较差。垂直传播途径感染者，预后较差。反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸 水平经常波动者更易发展为肝硬化。水平经常波动者更易发展为肝硬化。水平经常波动者更易发展为肝硬化。水平经常波动者更易发展为肝硬化。病毒分型和耐药检测病毒分型和耐药检测 各个编码区段存在着大量有意义的自然变异各个编码区段存在着大量有意义的自然变异各个编码区段存在着大量有意义的自然变异各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致株，从而导致株，从而导致株，从而导致 HBVHBVHBVHBV感染的不同血清学和临床感染的不同血清学和临床感染的不同血清学和临床感染的不同血清学和临床表现。表现。表现。表现。检测检测检测检测HBVHBVHBVHBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受的变异株对了解疾病机制、药物耐受的变异株对了解疾病机制、药物耐受的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值。和指导用药有一定的价值。和指导用药有一定的价值。和指导用药有一定的价值。HPV基因的检测在预防宫颈癌中的作用 n n宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50505050万左右万左右万左右万左右新发病例。新发病例。新发病例。新发病例。n n我国每年有新我国每年有新我国每年有新我国每年有新发发发发病例病例病例病例约约约约13.1513.1513.1513.15万，占世界万，占世界万，占世界万，占世界宫颈宫颈宫颈宫颈癌新癌新癌新癌新发发发发病例病例病例病例总总总总数的数的数的数的26%26%26%26%。n n持续的人乳头瘤病毒持续的人乳头瘤病毒持续的人乳头瘤病毒持续的人乳头瘤病毒(human(human(human(human papillomaviruspapillomaviruspapillomaviruspapillomavirus,HPV)HPV)HPV)HPV)感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，素，素，素，93.0%-99.7%93.0%-99.7%93.0%-99.7%93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到的宫颈癌组织中均可检测到的宫颈癌组织中均可检测到的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNAHPV DNAHPV DNAHPV DNA。n n高危型高危型高危型高危型HPV-16HPV-16HPV-16HPV-16和和和和HPV-18HPV-18HPV-18HPV-18分分分分别别别别占占占占宫颈宫颈宫颈宫颈癌的癌的癌的癌的50%50%50%50%和和和和14%14%14%14%。高危型。高危型。高危型。高危型HPVHPVHPVHPV的持续感染可使患宫颈癌的风的持续感染可使患宫颈癌的风的持续感染可使患宫颈癌的风的持续感染可使患宫颈癌的风险增加险增加险增加险增加250250250250倍。倍。倍。倍。HPV DNAHPV DNAHPV DNAHPV DNA的检测方法的检测方法的检测方法的检测方法n n实时定量实时定量实时定量实时定量PCR(Real time PCR)PCR(Real time PCR)PCR(Real time PCR)PCR(Real time PCR)n n核酸杂交捕获（核酸杂交捕获（核酸杂交捕获（核酸杂交捕获（Hybrid CaptureHybrid CaptureHybrid CaptureHybrid Capture，HCHCHCHC）n nHC HC HC HC 可一次检测所有致癌的可一次检测所有致癌的可一次检测所有致癌的可一次检测所有致癌的13131313种高危型种高危型种高危型种高危型HPVHPVHPVHPV。n n敏感度：对敏感度：对敏感度：对敏感度：对CIN CIN CIN CIN、和癌的检出率为和癌的检出率为和癌的检出率为和癌的检出率为 98%98%98%98%。n n阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度病变的阴性预期值病变的阴性预期值病变的阴性预期值病变的阴性预期值99.9%99.9%99.9%99.9%n n细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPVHPVHPVHPV基因基因基因基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。n n细胞学检查细胞学检查细胞学检查细胞学检查+HPV+HPV+HPV+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫基因的检测是宫颈癌前病变和宫基因的检测是宫颈癌前病变和宫基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。基因检测在监测移植物排斥中的作用 关于多瘤病毒n n人类多瘤病毒中常见的人类多瘤病毒中常见的人类多瘤病毒中常见的人类多瘤病毒中常见的3 3 3 3种病毒：种病毒：种病毒：种病毒：BKBKBKBK、JCJCJCJC、SV40SV40SV40SV40。n nBKBKBKBK病毒于病毒于病毒于病毒于1971197119711971年首次从肾脏移植受体的尿液中分离年首次从肾脏移植受体的尿液中分离年首次从肾脏移植受体的尿液中分离年首次从肾脏移植受体的尿液中分离出。出。出。出。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。n n在美国，在美国，1010岁以上的正常人群中岁以上的正常人群中60%60%80%80%有有BKBK病病毒感染史。毒感染史。n n感染的病毒多潜伏于感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和尿道上皮肾小管上皮细胞和尿道上皮细胞中。细胞中。n nBKBK病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或大病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或大量使用免疫抑制剂后。量使用免疫抑制剂后。n n肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂，使肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂，使BKBK病毒重病毒重新激活，大量复制。新激活，大量复制。n nBKBK病毒复制进一步发展，成为病毒复制进一步发展，成为BKBK病毒感染的病毒感染的肾间肾间质性肾病（质性肾病（BKVANBKVAN）。）。n nBKVANBKVAN患者中患者中60%60%70%70%会发生远期的肾脏移植失会发生远期的肾脏移植失败。败。n nBK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的重要原因之一。n nBK病毒感染越来越受到关注。n n早期无临床症状，早期无临床症状，后期症状与肾移植排斥和药后期症状与肾移植排斥和药物毒性反应相似物毒性反应相似，易引起误诊和漏诊。，易引起误诊和漏诊。n nBKBK病毒感染和移植排斥治疗原则相反：病毒感染和移植排斥治疗原则相反：BKBK病毒病毒感染需要降低免疫抑制剂量，而移植排斥则应感染需要降低免疫抑制剂量，而移植排斥则应加大用量。加大用量。因此，建立有效的因此，建立有效的BKBK病毒检测和监测体系病毒检测和监测体系是十分必要的。是十分必要的。decoydecoy细胞细胞n nBKBK病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。n n形态学检测敏感性较好，但特异性差。形态学检测敏感性较好，但特异性差。n n细胞形态在尿液中很容易破坏。细胞形态在尿液中很容易破坏。巴氏染色的巴氏染色的decoy细胞细胞未经染色的未经染色的decoy细胞细胞BK病毒感染的检测BKBK病毒的检测病毒的检测n n血、尿中血、尿中BKBK病毒核酸定量检测病毒核酸定量检测n n尿液中尿液中decoydecoy细胞检查细胞检查n n尿沉渣涂片原位杂交尿沉渣涂片原位杂交组织病理学检查（判断肾脏间质性肾病）组织病理学检查（判断肾脏间质性肾病）肾脏移植术后病人BK病毒检测的研究对象对象n n瑞金医院肾脏移植术后瑞金医院肾脏移植术后2 2个月个月3 3年的患者年的患者9595例例n n正常人标本正常人标本6060例例研究方法研究方法n n尿沉渣细胞形态学检测尿沉渣细胞形态学检测n n血、尿中血、尿中BK BK 病毒病毒DNADNA的定量检测的定量检测Decoy细胞形态学特征:小管上皮细胞的细胞核明显增大，多偏向一侧，核浆比例明显增加；细胞边缘常常出现毛玻璃样改变；胞浆有细小颗粒，较均匀，呈果冻状；细胞核常较粗糙。结 果 95例患者的尿沉渣形态学检查，35例患者的尿沉渣中出现可疑的病毒感染肾小管上皮细胞（decoy细胞）。尿液中BK病毒核酸定量检测n n14例尿液中检测到BKV DNA，病毒载量为41032109/ml，平均为5.6105/ml。n n发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。血浆中血浆中血浆中血浆中BKBKBKBK病毒核酸检测病毒核酸检测病毒核酸检测病毒核酸检测n n14141414例病毒尿中，有例病毒尿中，有例病毒尿中，有例病毒尿中，有5 5 5 5例同时出现病毒血症。例同时出现病毒血症。例同时出现病毒血症。例同时出现病毒血症。n n核酸载量为核酸载量为核酸载量为核酸载量为2 2 2 2101010104 4 4 4/ml/ml/ml/ml4.84.84.84.8101010106 6 6 6/ml/ml/ml/ml，平均为，平均为，平均为，平均为 4.24.24.24.2101010104 4 4 4/ml/ml/ml/ml。阴性对照阴性对照 n6 6例病毒检测阳性的核酸标本进行序列分析。例病毒检测阳性的核酸标本进行序列分析。n 所测片段序列均为所测片段序列均为BKBK病毒的核酸序列病毒的核酸序列BK病毒核酸序列病毒核酸序列核酸序列分析核酸序列分析n n3 3例患者在临床上出现不明原因的发热、白细胞例患者在临床上出现不明原因的发热、白细胞降低、缓慢的肌酐升高等症状，有降低、缓慢的肌酐升高等症状，有1 1例甚至出现例甚至出现了尿道阻塞。了尿道阻塞。n n临床上认为发生临床上认为发生BKVANBKVAN的可能性较大，给予抗病的可能性较大，给予抗病毒治疗。毒治疗。病例1、2治疗前：治疗前：n n尿液和血浆病毒核酸载量在尿液和血浆病毒核酸载量在10104 4/ml/ml10105 5/ml/mln n血肌酐分别为血肌酐分别为181mol/L181mol/L和和168mol/L168mol/L治疗后：治疗后：n n血浆和尿液中血浆和尿液中BKBK病毒已检测不出病毒已检测不出n n血肌酐降为血肌酐降为160mol/L160mol/L和和129mol/L129mol/L病例3治疗前n n尿液中BK病毒核酸载量为2109拷贝/mln n尿沉渣细胞中见到大量decoy细胞和炎性细胞治疗后n n尿液中BK病毒核酸载量降至105拷贝/mln n尿沉渣细胞中decoy细胞明显减少治疗前治疗前治疗治疗1010天后天后治疗治疗2020天后天后讨 论n n文献报道BK病毒的复制感染率为5%60%，本研究中发生BK病毒复制的占14.7%。n n35例患者中发现decoy细胞，仅14例被证实存在病毒核酸，提示形态学检查特异性差。n n肾脏移植的患者容易导致包括BK病毒在内的多种病毒感染。因此n n是否存在BK病毒感染，形态学仅作为筛查实验。n n病毒核酸定量可有效地动态观察病毒核酸的复制。BK病毒核酸定量检测n n用于检测BK病毒是否复制n n为是否需要进行病理学检查提供依据n n监测疾病和评价治疗效果n n预防间质性肾病，防止移植远期失败二、遗传性疾病的分子诊断 分子诊断能够检出家系中的致病基因携带者或高危个体，能够在胎儿出生前判断其是否为患者，因此分子诊断是降低单基因遗传病发病率的根本措施。n n单基因遗传病是由于某一基因结构的变化或基因表达异常而导致的疾病n n用分子生物学技术检测致病基因的遗传缺陷是诊断这类疾病最根本的手段遗传性疾病中常见的分子异常n n遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物蛋白质（或酶）的表现异常所致。n n基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。点突变(point mutation)n n包括错义突变、无义突变、移码突变n n各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变 蛋白质合成量下降 无蛋白质合成片段性突变(fragememtal mutation)核苷酸的丢失和增多n n缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失n n插入：外来基因片段插入某一基因序列中n n倍增：基因内部某一段序列发生重复n n基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起动态性突变(dynamic mutation)n n以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中 不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往 往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复 少年脊髓型共济失调：GAA重复 亨廷顿病：CAG重复X染色体（染色体（xq27.3）的脆性位点）的脆性位点 脆性脆性X X综合征综合征是遗传性智力缺陷最常见的一种。是遗传性智力缺陷最常见的一种。致病基因致病基因FMR-1FMR-1的的5 5端有端有CGGCGG三核苷酸重复区。三核苷酸重复区。普通男性群体中的患病率为普通男性群体中的患病率为1/40001/4000。普通女性群体中的患病率为普通女性群体中的患病率为1/60001/6000。患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊 面容。面容。n正常个体：正常个体：CGG重复次数重复次数652次，中国人群以次，中国人群以(CGG)28为多见。为多见。n前突变前突变(premutation)：(CGG)53230为携带者，虽表型正常，但在传为携带者，虽表型正常，但在传 递过程中易发生进一步扩展，使后代的递过程中易发生进一步扩展，使后代的CGG重复次数大大增加，并重复次数大大增加，并 有异常表型。有异常表型。n全突变：全突变：(CGG)230时，时，100%的男性表现为典型的脆性的男性表现为典型的脆性X综合征综合征,53%的女性表现为程度不同的智力低下。的女性表现为程度不同的智力低下。遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略（一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略是通过各种分基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。序列和结构必须被阐明。直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。因而比较可靠。DMD的基因检测n n Duchenne muscular dystrophy(DMD)是一种高发病率、高致残、高致死的X连锁的遗传性疾病，在3500个活产男婴中即有一个患者。n n DMD基因的全长为250kb，有79个外显子。n n DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占 60%70%。DMD基因外显子的检测（二）间接诊断策略 间接诊断的实质是在家系中进行连锁间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。判断该个体是否带有致病基因。间接诊断不是寻找间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，的遗传缺陷，而是通过分析而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。计被检者患病的可能性。间接诊断：分析间接诊断：分析DNADNA的遗传标记的多态性的遗传标记的多态性双等位基因(bi-allele）多态性：n n限制性片段长度多态性（RFLP）第一代DNA遗传标记，所含信息量有限。检测技术：Southern印迹技术多等位基因多态性(multi-allele)小卫星序列小卫星序列n n又称串联重复可变数目（又称串联重复可变数目（variable number variable number tandem repeatstandem repeats，VNTRVNTR）n n第二代第二代DNADNA遗传标记遗传标记n n以以 6 670bp 70bp 为单位，以串联形式排列，构成为单位，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列数量可变的串联重复序列n n等位基因常常达等位基因常常达1010个以上，信息量比个以上，信息量比 RFLPRFLP大大 检测技术：检测技术：PCRPCR 微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列 (microsatellitemicrosatellitemicrosatellitemicrosatellite)n n以以以以 2 2 2 26bp 6bp 6bp 6bp 为单位，重复次数可达几十次，又称为单位，重复次数可达几十次，又称为单位，重复次数可达几十次，又称为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列短串联重复序列短串联重复序列短串联重复序列(STR)(STR)(STR)(STR)。n n在基因组中分布广泛，出现的数目和频率不同，在基因组中分布广泛，出现的数目和频率不同，在基因组中分布广泛，出现的数目和频率不同，在基因组中分布广泛，出现的数目和频率不同，具高度多态性。具高度多态性。具高度多态性。具高度多态性。检测技术：检测技术：检测技术：检测技术：PCRPCRPCRPCR单核苷酸多态性单核苷酸多态性(single(single nucleotide poly-nucleotide poly-morphismmorphism，SNP)SNP)n n第三代DNA的遗传标记，其多态性仅表现为 单个核苷酸的变异。n n在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。检测技术：DNA芯片技术C50:C49:C45:C44:Cjp:11223C50:C49:C45:C44:Cjp:1221221313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112121313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112121313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112112212C50:C49:C45:C44:Cjp:12212C50:C49:C45:C44:Cjp:21313C50:C49:C45:C44:Cjp:1122312212C50:C49:C45:C44:Cjp:21313C50:C49:C45:C44:Cjp:213131234567891011121314151617181920212223凝血因子(F8)基因的主要遗传缺陷n n点突变(point mutation)n n缺失(deletion)n n倒位(invertion)：发生于第22号内含子，可在40%-50%重型HA中检测到间接诊断的不确定性n n遗传标记所带的信息性有限n n新突变n n基因重组n n家系成员不完整三、基因检测在多基因病中的应用 多基因病具一定的遗传因素，家庭发多基因病具一定的遗传因素，家庭发病率高于人群发病率，但是疾病的产生都病率高于人群发病率，但是疾病的产生都以一定的环境条件为诱因，遗传因素在其以一定的环境条件为诱因，遗传因素在其中所起作用程度各异。中所起作用程度各异。多基因病中的遗传因素是若干个易感多基因病中的遗传因素是若干个易感基因微小作用的累加，某一易感基因结构基因微小作用的累加，某一易感基因结构的变化不足以导致疾病的产生。的变化不足以导致疾病的产生。人类基因组多态性是多基因病基因诊断的基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和分类。高血压候选基因多态性分析在EH中的应用前景n n 临床分型n n 靶器官损伤研究n n 个体化治疗基因多态性与盐敏感性高血压基因多态性与盐敏感性高血压-内收素内收素血管紧张素转换酶血管紧张素转换酶上皮钠通道上皮钠通道血管紧张素原血管紧张素原心钠素心钠素 2 2肾上腺素能受体肾上腺素能受体 SA GSA G蛋白亚单位蛋白亚单位3 3基因多态性与高血压靶器官损伤脑卒中脑卒中脑卒中脑卒中 载脂蛋白载脂蛋白载脂蛋白载脂蛋白E E E E -纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白原 血管紧张素原血管紧张素原血管紧张素原血管紧张素原 血管紧张素血管紧张素血管紧张素血管紧张素IIIIIIII的的的的1 1 1 1型受体型受体型受体型受体 内皮型一氧化氮合酶内皮型一氧化氮合酶内皮型一氧化氮合酶内皮型一氧化氮合酶 心钠素心钠素心钠素心钠素冠心病冠心病冠心病冠心病 副氧酶副氧酶副氧酶副氧酶 凝血因子凝血因子凝血因子凝血因子V V V V 凝血因子凝血因子凝血因子凝血因子VIIVIIVIIVII 载脂蛋白载脂蛋白载脂蛋白载脂蛋白B B B BACE基因多态性与高血压靶器官损伤疾病疾病疾病疾病 研究报告数研究报告数研究报告数研究报告数 I D DDI D DDI D DDI D DD冠心病冠心病 30 +11%+32%30 +11%+32%心肌梗死心肌梗死 1515 +12%+39%+12%+39%脑卒中脑卒中 5 +22%+94%5 +22%+94%高血压肾病高血压肾病 1919 +10%+53%+10%+53%糖尿病肾病糖尿病肾病 1111 +40%+56%+40%+56%*与与与与IIIIIIII型相比型相比型相比型相比，DDDDDDDD型和型和型和型和IDIDIDID型发生上述疾病的危险性增高程度型发生上述疾病的危险性增高程度型发生上述疾病的危险性增高程度型发生上述疾病的危险性增高程度 (ACE(ACE(ACE(ACE基因基因基因基因I/DI/DI/DI/D多态性研究多态性研究多态性研究多态性研究49959499594995949959例的荟萃分析）例的荟萃分析）例的荟萃分析）例的荟萃分析）ACE基因多态性：基因多态性：16号内含子有一号内含子有一Alu重复序列，为插入重复序列，为插入/缺失多态性，缺失多态性，构成构成II、ID、DD三种基因型三种基因型基因多态性检测与个体化治疗 人类基因组计划已经完成，功能基因组研究正在实施。有朝一日，临床医师能根据病人易感基因的多态性设计有效的、个体化的治疗方案，以达到最佳治疗效果。ATG基因多态性研究目的：目的：目的：目的：观察观察ATGATG基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的 血压变化和高血压发病率间的关系血压变化和高血压发病率间的关系对象：对象：对象：对象：15091509例例基因分析：基因分析：基因分析：基因分析：ATGATG基因基因G-AG-A多态性多态性结果：结果：结果：结果：三年后高血压发生率（三年后高血压发生率（%）对照组对照组对照组对照组 限盐组限盐组限盐组限盐组 减轻体重组减轻体重组减轻体重组减轻体重组 AAAA型型 45 28 2545 28 25 GG GG型型 32 41 3232 41 32 Hunt SC,et al:Hypertension,Hunt SC,et al:Hypertension,Hunt SC,et al:Hypertension,Hunt SC,et al:Hypertension,1998;32:393-4011998;32:393-4011998;32:393-4011998;32:393-401基因多态性分析指导抗高血压药物的选择药物种类药物种类 基因基因 利尿剂利尿剂-内收素内收素 ACEACE抑制剂抑制剂ACEACE、AT1AT1-受体阻滞剂受体阻滞剂G G蛋白蛋白（GsGs)四、肿瘤相关基因检测在肿瘤病情监测中的应用 肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因）发生突变而导致的疾病。肿瘤相关基因的突变只是增加了个体对肿瘤的易感性而并不一定马上产生肿瘤，肿瘤的发生是一个多因素、多步骤打击的过程。实时定量RT-PCR技术在急性早幼粒细胞白血病中的应用PML-RAR 融合基因是融合基因是APL特异的分子标志特异的分子标志n n初发APL的PML-RAR融合基因的拷贝数均大于1000。n n经全反式维甲酸、ATRA+化疗、三氧化二砷 治疗获得缓解后，其PML-RAR融合基因的拷 贝数明显降低，并随着巩固治疗的进行而进一步降低。n n长期无病生存的患者的PML-RAR融合基因的拷贝数均长期低于200n n一旦患者的检测值高于该值，则强烈提示复发的可能复发复发APL完全缓解和复发时PML-RAR融合基因的检测CEACEA基因的定量检测基因的定量检测在监测胃肠癌微转移中的应用在监测胃肠癌微转移中的应用 CEA基因在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，而在正常成人体内极少表达。正常人外周血正常人外周血CEACEA基因表达情况基因表达情况 在肿瘤发生血道转移时，外周血中有少量肿瘤细胞残留。在肿瘤细胞内可检测到CEA基因的转录本。胃肠癌组织中胃肠癌组织中CEACEA基因的表达基因的表达胃肠癌患者外周血中胃肠癌患者外周血中CEACEA基因的表达基因的表达n n用灵敏、特异的荧光定量PCR技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关键。