分子生物学技术-课件.ppt

分子生物学常用实验技术分子生物学常用实验技术The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室徐文弟徐文弟2010.9.23现代分子生物学现代分子生物学遗传中心法则与组学遗传中心法则与组学 遗传信息传递的基本规律遗传信息传递的基本规律分子生物学研究内容分子生物学研究内容生物大分子结构与功能生物大分子结构与功能生物大分子的相互作用生物大分子的相互作用 分子生物研究技术分子生物研究技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用蛋白质蛋白质-核酸相互作用核酸相互作用工具酶的应用工具酶的应用遗传中心法则 基因信息的流向、基因表达的环节基因信息的流向、基因表达的环节与调控的不同水平；与调控的不同水平；DNA所占的中心位置；所占的中心位置；RNA是信息表达的体现；是信息表达的体现；蛋白质执行生物学功能。蛋白质执行生物学功能。基因工程的基本原理基因工程的基本原理!生命的起源？生命的起源？基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系 基因组学是基础、基因组学是基础、转录组学是信息、转录组学是信息、蛋白质组学是功能、蛋白质组学是功能、代谢组学是结果。代谢组学是结果。整合也是创新整合也是创新方法的结合方法的结合形态与机能研究的结合形态与机能研究的结合 中西医的结合中西医的结合2121世纪分子医学发展的主要领域世纪分子医学发展的主要领域分子诊断基因治疗生物工程药物第一讲第一讲蛋白质的分离、纯化、鉴定蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析和结构分析Isolation,Purification,Identificationand Structural Analysis of Proteins一一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:是常用的蛋白质沉淀方法是常用的蛋白质沉淀方法 使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在04低低温温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮沉淀后，应立即分离。酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。盐析盐析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，导导致致蛋白质沉淀。蛋白质沉淀。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉将将某某一一纯纯化化蛋蛋白白质质免免疫疫动动物物可可获获得得抗抗该该蛋蛋白白的的特特异抗体。异抗体。利利用用特特异异抗抗体体识识别别相相应应的的抗抗原原蛋蛋白白，并并形形成成抗抗原原抗抗体体复复合合物物的的性性质质，可可从从蛋蛋白白质质混混合合溶溶液液中中分分离离获获得得抗原蛋白。抗原蛋白。免疫沉淀法免疫沉淀法（immunoprecipitation）二、二、透析及超滤法透析及超滤法:可清除蛋白质溶液中的小分子化合物可清除蛋白质溶液中的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。分开的方法。应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤法超滤法 透析透析(dialysis)(dialysis)三三、电泳、电泳:是蛋白质分离与鉴定的常用方法是蛋白质分离与鉴定的常用方法电泳电泳(elctrophoresis)蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为称为电泳电泳。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶胶电电泳泳等。等。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量，常用于蛋白质分子量的测定。的测定。等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。，蛋白质组学研究的重要技术。几种重要的蛋白质电泳：几种重要的蛋白质电泳：蛋白质的二维电泳蛋白质的二维电泳二二维维电电泳泳图图四四、应用相分配或亲和原理：、应用相分配或亲和原理：可将蛋白质进行层析分离可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的白质的目的。层析层析(chromatography)(chromatography)离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。分离。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法五五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：可进行超速离心分离可进行超速离心分离超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也可可以以用用作作测测定定蛋白质的分子量。蛋白质的分子量。沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient,S)蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数表表示示,沉沉降系数与蛋白质的密度和形状相关降系数与蛋白质的密度和形状相关。因因为为沉沉降降系系数数S大大体体上上与与分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量，但但对对分分子子形形状状的的高高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。六、用化学或反向遗传学方法：六、用化学或反向遗传学方法：可分析或演绎多肽链的氨基酸序列可分析或演绎多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。化学法化学法溶解法溶解法二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNP法）法）肼解法肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法氯法）还原成氨基醇法亮氨酸氨肽酶法亮氨酸氨肽酶法细胞外氨肽酶法细胞外氨肽酶法羧肽酶羧肽酶A A法法羧肽酶羧肽酶B B法法羧肽酶羧肽酶C C法法氨基酸和肽的末端测定法氨基酸和肽的末端测定法通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列七、应用物理学、生物信息学原理：七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测可进行蛋白质空间结构测定或预测通通常常采采用用圆圆二二色色光光谱谱(circular dichroism，CD)测测定定溶溶液液状状态态下下的的蛋蛋白白质质二二级级结结构构含含量量。-螺螺旋旋的的CD峰峰有有222nm处处的的负负峰峰、208nm处处的的负负峰峰和和198nm处处的的正正峰峰3个个成分；而成分；而-折叠的折叠的CD谱不很固定。谱不很固定。（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。（二）（二）X X射线衍射法和核磁共振技术：射线衍射法和核磁共振技术：用于三维空间结构分析用于三维空间结构分析1A2.Structure of dCTP 3.Base Tautomerism 3.Chargaff rules-A=T,G=C helical10 layer Lines BetweenCrossPatterns(10 ResiduesPer turn)Evidence for the Double Helix1.Fiber Diffraction data:-Helical geometry-3.4 A spacing(1A=10-10 m)-34 A pitch*用用分分子子力力学学、分分子子动动力力学学的的方方法法，根根据据物物理理化化学学的的基基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（三）根据氨基酸序列：（三）根据氨基酸序列：预测预测蛋白质蛋白质三维空间结构三维空间结构*通通过过对对已已知知空空间间结结构构的的蛋蛋白白质质进进行行分分析析，找找出出一一级级结结构构与与空空间间结结构构的的关关系系，总总结结出出规规律律，用用于于新新的的蛋蛋白质空间结构的预测。白质空间结构的预测。30第二讲第二讲DNADNA操作的基本技术操作的基本技术The Basic Technologies for DNA Manipulations31 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization32什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）以以DNADNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNADNA或或RNARNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成复性处理后，形成异源双链异源双链的过程的过程 可用于基因诊断可用于基因诊断n核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化化双双链链(heteroduplex)。分子杂交与印迹技术的原理分子杂交与印迹技术的原理复性复性RNADNA印迹技术印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探，探针可以与固定在针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。源的核酸分子存在。是基因诊断的常用技术是基因诊断的常用技术 探针技术探针技术基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年年加加州州大大学学华华裔裔科科学学家家 Kan YW用用核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术首首次次对对一一例例地地中中海海贫贫血进行诊断。血进行诊断。基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义：利利用用分分子子生生物物学学技技术术，通通过过检检测测基基因因及及基基因因表表达达产产物物的的存存在在状状态态，对对人人体体疾疾病病作作出出诊诊断断的的方方法法。基基因因诊诊断断检检测测的的目目标标分分子子是是DNADNA、RNARNA，也也可可以以是是蛋蛋白白质质或者多肽或者多肽(分子诊断分子诊断）。）。诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNADNA、RNARNA或或蛋蛋白白质质水水平平变变化化。如如病病毒毒基基因因及及其其转转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；l基基因因结结构构变变化化。如如点点突突变变引引起起基基因因失失活活、染染色色体体转转位引起基因异常激活或灭活。位引起基因异常激活或灭活。基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性高特异性高灵敏性高灵敏性早期诊断性早期诊断性应用广泛性应用广泛性基因诊断中常用的分子生物学技术基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridizationNucleic acid hybridization）聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP）限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）DNADNA序列测定（序列测定（DNA sequencingDNA sequencing）生物芯片（生物芯片（biochipsbiochips）WesternWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blottingWestern blotting）免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛使用使用选择合适的芯片选择合适的芯片印迹技术印迹技术 44一、一、Southern Southern 印迹印迹:可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化由由E.M.Southern在在1975年提出年提出可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化基本操作过程包括基本操作过程包括待测待测DNA样品的样品的制备制备和基因探针的和基因探针的标记标记；待测待测DNA样品的样品的电泳电泳分离；分离；电泳分离的电泳分离的DNA经变性、经变性、转移转移、固定到合适的固相支、固定到合适的固相支持物；持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段片段杂交杂交，放射自，放射自显影显影或或显色检测目的显色检测目的DNA的存在。的存在。Edwin Southern Sir Edwin Southern(born 1938),US biologist and deviser of the DNA analytical technique Southern blotting.This technique uses enzymes to fragment DNA(deoxyribonucleic acid),and the fragments are then separated in an electrophoresis gel.The separated fragments are then blotted onto a nitrocellulose filter and marked with radioactive probes.The probes indicate the presence of specific genes(lengths of DNA that code for proteins).A sheet of photographic film is then laid over the filter.The radioactivity darkens the film,which reveals the position of genes in the DNA.This technique is widely used in genetic research.Photographed in the 1980s.核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂交杂交去除未杂交的探针去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针47SouthernSouthern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液Northern Northern 印迹印迹 RNA经经变变性性琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳后后，转转移移到到固固相相支支持持物物上上，通通过过分分子子杂杂交交检检测测特特定定的的mRNA分子的含量与大小。分子的含量与大小。Northern印迹杂交印迹杂交(Northern blotting)50二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR:可用于分析基因转录水平的变化可用于分析基因转录水平的变化Northern blot是是将将RNA从从凝凝胶胶中中转转印印到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，定性分析定性分析mRNA的常用方法；的常用方法；RT-PCR是是以以mRNA为为模模板板反反转转录录合合成成cDNA、再再以以cDNA为为模模板板进进行行特特异异性性扩扩增增，进进行行RNA定定性性或或定定量量分分析析的的一一种种方法；方法；二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化。三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较52三、三、原位分子杂交技术原位分子杂交技术:可用于基因及其表达产物的定位分析可用于基因及其表达产物的定位分析原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。可用于基因及其表达产物的定位分析。53（一）（一）利用原位杂交技术利用原位杂交技术:进行基因定位分析进行基因定位分析荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）基因组原位杂交基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH）斑点杂交（斑点杂交（dot blotting）将将RNA或或DNA变变性性后后直直接接点点样样于于硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜上上，用用于于基基因因组组中中特特定定基基因因及其表达产物的定性及定量的研究。及其表达产物的定性及定量的研究。反向斑点杂交反向斑点杂交（reverse dot blotting）先先将将探探针针固固定定于于硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜上上，将将样样品品RNA或或DNA标标记记变变性性后后进进行行杂杂交交。改改变变了了传传统统杂杂交交方方法法中中一一次次杂杂交交只只能能检检测测一一种种样样品品的的局局限限，大大大大提提高高了了基基因因诊断的效率诊断的效率。56FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）58（二）（二）利用原位杂交技术利用原位杂交技术:确定特定基因的表达定位确定特定基因的表达定位RNA原位杂交原位杂交 整体原位杂交（整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization,WISH）固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwich hybridization)待待测测靶靶基基因因序序列列上上两两个个相相邻邻但但不不重重叠叠的的DNA片片段段（A、B片片段段），分分别别作作为为捕捕捉捉探探针针（不不标标记记的的A片片段段）和和检检测测探探针针（标记的（标记的B片段），同时与靶基因杂交。片段），同时与靶基因杂交。先先将将捕捕捉捉探探针针吸吸附附于于固固相相支支持持物物上上，与与靶靶基基因因序序列列A部部分分杂杂交交，再再加加入入标标记记的的检检测测探探针针，检检测测探探针针与与靶靶基基因因序序列列B部分杂交，检测杂交信号。部分杂交，检测杂交信号。固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。诊断的技术途径选择。（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件：被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知已知5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 在在DNA序序列列上上有有一一段段较较长长序序列列的的重重新新排排布布。包包括括数数十十个个碱碱基基到到数数千千个个碱碱基基的的丢丢失失、插插入入、替替换换、重重复复和和倒倒位位等等，以以及及染染色色体体突突变变或或畸畸变变，包包括括染染色色体体的的易易位位、缺缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.2.基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR PCR BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断a-珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍珠蛋白生成障碍性贫血性贫血 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR）3.3.基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测 DNA多态性：多态性：指指群群体体中中的的DNA分分子子存存在在至至少少两两种种不不同同的的类类型型，即即个个体体间间同同一一染染色色体体的的相相同同位位置置上上核核苷苷酸酸序序列列存存在在一一定的差异或变异。定的差异或变异。多多在在进进化化中中形形成成，本本身身并并不不致致病病，只只是是与与某某些些遗遗传性致病基因有一定连锁关系。传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标记遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide polymorphism)7.6kb13kb患患者者正正常常 HbSHbS的间接基因诊断的间接基因诊断 RFLPRFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针73聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction74什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由由K.MullisK.Mullis于于19831983年建立年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNADNA序列的相互作序列的相互作用。用。The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistryMulls Nobel Prize for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method B.194476PCRPCR技术的工作原理技术的工作原理53355335+55变性、退火变性、退火引物引物5335+55dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶不同长度新链不同长度新链DNA循环循环1+引物引物变性、退火变性、退火772530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增5335+5335+5335+5335+dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶均一长度新链均一长度新链DNADNA循环循环2 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直直接接以以组组织织和和细细胞胞的的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序序列列相相似似的基因片段；的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。文库或基因组文库中克隆基因。PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求求很低，是很低，是DNA和和RNA微量分析的最好方法。微量分析的最好方法。（二）（二）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（三）基因突变（三）基因突变 利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性。（四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析PCRPCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用RT-PCRRT-PCR荧光定量荧光定量PCRPCR多重多重-PCR-PCRPCR-ASOPCR-ASOAS-PCRAS-PCRPCR-SSCPPCR-SSCPPCR-RFLPPCR-RFLPRT-PCR85一、一、PCRPCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物反反转转录录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是是将将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反应联合应用的一种技术。RT-PCR是是目目前前从从组组织织或或细细胞胞中中获获得得目目的的基基因因以以及及对对已已知知序列的序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。进行定性及半定量分析的最有效方法。86mRNA 5 AAAAAA(n)3 mRNA 5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 反转录合成反转录合成cDNAcDNA 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR 寡寡核核苷苷酸酸中中的的碱碱基基错错配配会会大大大大影影响响杂杂交交分分子子的的稳稳定定性性，可可用用人人工工合合成成的的针针对对正正常常和和突突变变ASO探探针针进进行行反反向向斑斑点点杂杂交交，检检测测点点突突变变，大大大提高检测结果的可靠性。大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO）PCR-ASON N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）DNA 的的突突变变造造成成DNA片片段段中中碱碱基基序序列列不不同同，变变性性为为单单链链后后在在中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的构构象象不不同同（单单链链构构象象多多态态性性），利利用用迁迁移移率率的的差差别别可可使使各各种种序序列列不不同同的的单单链分离开来。链分离开来。PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism,RFLP）由由于于DNA 变变异异产产生生新新的的酶酶切切位位点点或或原原有有的的酶酶切切位位点点消消失失，在在用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化时时产产生生不不同同长长度度或或不不同同数数量量的片段。的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。设设计计适适当当的的扩扩增增引引物物，使使扩扩增增片片段段包包括括某某一一个个或或数数个个限限制制性性内内切切酶酶识识别别序序列列，在在PCR扩扩增增后后用用该该限限制制酶酶切切割割PCR产产物物，根根据据电电泳泳后后酶酶切切片片段段长长度度变变化化，即可作出诊断。即可作出诊断。PCR-RFLPABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoREcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化 1985年年，英英国国遗遗传传学学家家Jeffeys等等人人用用TR的的核核心心序序列列为为探探针针进进行行RFLP分分析析时时，检检测测到到许许多多HVR，并并产产生生相相应应的的图图谱谱，所所得得图图谱谱具具有有高高度度的的个个体体特特异异性性，达达到到了了如如同同人人类类指指纹纹那那样样的的高高度度专专一一性性，所所以以称称其其为为DNA指指纹纹图图谱谱（DNA fingerprinting）。）。Alec John JeffreysOxford,United Kingdom 目目 录录Alec John Jeffreys亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。DNADNA指纹用于罪犯识别指纹用于罪犯识别99二、二、PCRPCR技术可以进行实时、定量分析技术可以进行实时、定量分析QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355100三、三、PCRPCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合的DNADNA序列序列PCRPCR与点突变与点突变 重叠延伸重叠延伸PCRPCR技术技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物由于采用具有互补末端的引物,使使PCR产物形成了重产物形成了重叠链叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。来源的扩增片段重叠拼接起来。重叠延伸重叠延伸PCRPCR技术技术 此技术利用此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重技术能够在体外进行有效的基因重组组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。物。重叠延伸重叠延伸PCR技术成功的关键是技术成功的关键是重叠互补引物重叠互补引物的设计。的设计。重叠延伸重叠延伸PCR在基因的在基因的定点突变定点突变、融合基因融合基因的构建、的构建、长片段基因长片段基因的合成、的合成、基因敲