分子诊断技术在结核病诊治中的应用.ppt

分子诊断技术在结核病诊分子诊断技术在结核病诊治中的应用治中的应用武汉大学人民医院检验医学中心武汉大学人民医院检验医学中心李李 艳艳全球结核病流行状况全球结核病流行状况WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况全球结核感染人数全球结核感染人数2004年后处于下降趋势年后处于下降趋势HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段患者并发结核病数量处于平稳阶段中国结核感染人数全球排名第二中国结核感染人数全球排名第二WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况全球结核死亡人数处于下降趋势全球结核死亡人数处于下降趋势斯威士兰结核病感染率最高斯威士兰结核病感染率最高WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况Globally,an estimated 3.6%of new cases and 20.2%of previously treated cases have MDR-TBThere were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012On average,an estimated 9.6%of MDR-TB cases have XDR-TBWHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况 2012年年全全球球新新发发结结核核病病例例为为860万万人人，中国占总数的中国占总数的12%在在860万万新新病病例例中中约约110万万人人（13%）为为HIV阳性，这些病例的阳性，这些病例的75%在非洲在非洲 每每年年约约有有130万万人人死死于于结结核核病病，我我国国为为25万万 结核病每结核病每24秒钟就杀死秒钟就杀死1人人 预预计计未未来来20年年还还将将有有3600万万人人死死于于结结核病。核病。全全球球每每年年有有45万万新新发发MDR-TB，大大约约4.3万万为为 XDR-TB流流 行行现现 状状感染人数多感染人数多死亡人数多死亡人数多耐药患者多耐药患者多潜伏感染多潜伏感染多“4多多”WHO report，2013结核病诊治中存在的问题结核病诊治中存在的问题预防预防问题问题诊断诊断问题问题治疗治疗问题问题医疗医疗问题问题检验人员最关检验人员最关心的问题心的问题根根据据不不同同分分子子水水平平及及技技术术特特点点来来选选择择诊断检测体系诊断检测体系细菌菌载体疫苗体疫苗DNA疫苗疫苗灵敏度灵敏度特异性特异性标本类型标本类型 目的用途目的用途费用费用实验平台实验平台 检测时间检测时间方法选择方法选择方法选择的影响因素方法选择的影响因素SputumSputum 涂片涂片涂片涂片MTBMTBMTBMTB培养培养培养培养孵育孵育4-8周周（阳性）（阳性）药敏试验药敏试验药敏试验药敏试验观察观察观察观察 孵孵孵孵育育育育4 4周周周周观观观观察察察察生生生生长长长长情情情情况况况况 涂片涂片涂片涂片 （阳性）（阳性）分子诊断技术分子诊断技术分子诊断技术分子诊断技术液体培养及药敏试验液体培养及药敏试验液体培养及药敏试验液体培养及药敏试验 平均时间平均时间平均时间平均时间2-32-3个个个个月月月月平均时间平均时间平均时间平均时间2020天天天天 只需只需只需只需2 2小时小时小时小时-2-2天天天天涂涂阳阳=60-98%有有结结核核分分枝枝杆杆菌菌，因因此此涂涂阳阳后后最最好好用用分分子子生生物物学学方法进行快速鉴定方法进行快速鉴定IGRAs、TST等等RNA水平水平DNA水平水平蛋白质水平蛋白质水平恒温扩增恒温扩增 变温扩增变温扩增 鉴定鉴定 鉴定鉴定+耐药耐药结核病分子结核病分子诊断诊断 扩增扩增 杂交杂交LAMP、SDA 芯片、芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe分子分子诊诊断适宜技断适宜技术术的的选择选择T-SPOT.TB与与 QFT-GI为为IGRAs实验实验潜伏性结核潜伏性结核（LTBILTBI）结结核菌素核菌素试验试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TB Gold in-tube(QFT-GI)蛋白质水平蛋白质水平全血全血IFN-释放分析技术释放分析技术(IGRA)结结核核感感染染者者体体内内存存在在特特异异的的效效应应T淋淋巴巴细细胞胞，效效应应T淋淋巴巴细细胞胞再再次次受受到到结结核核抗抗原原刺刺激激时时会会分分泌泌多多种种细细胞胞因因子子（IFN-）。因因此此，检检测测效效应应T淋淋巴巴细细胞胞可可用用于于结结核核病病或或结结核核潜潜伏伏感感染染者者的的诊诊断。断。由由于于效效应应T细细胞胞存存活活时时间间很很短短，而而且且具具有有特特异异性性，因因此此可可以作以作为为机体是否正机体是否正处处于被感染的指于被感染的指标标，无，无论论是否有是否有临临床症状。床症状。基基于于IGRA原原理理的的产产品品目目前前已已被被美美国国、加加拿拿大大、英英国国、德德国国、意意大大利利、瑞瑞士士、法法国国、荷荷兰兰、日日本本等等二二十十余余个个国国家家写写入入本本国国的的结结核核诊疗诊疗指南中指南中-干扰素释放实验干扰素释放实验酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点技术培养滤液蛋白培养滤液蛋白10（CFP 10）早期抗原靶早期抗原靶6（ESAT-6）一、一、T-SPOT技术基础技术基础T-SPOTT-SPOT由由结核杆菌基因核杆菌基因组RD1区相区相同的操同的操纵子子编码的蛋白的蛋白所有的卡介苗（所有的卡介苗（BCG）均）均丢失失该基因序列基因序列绝大多数的大多数的环境分枝杆菌也境分枝杆菌也不存在不存在RD1区区结核杆菌特异抗原核杆菌特异抗原ESAT-6与与CFP 10抗原抗原PlamaPBMCsGel BarrierErythrocytes检测过程检测过程分离分离PBMCs加入加入PBMCs与与结结核特异抗原核特异抗原37孵育孵育16-20小小时时PBMCs特异抗原特异抗原-干干扰扰素抗体素抗体加入加入标记标记二抗，孵育二抗，孵育1小小时时加入加入显显色液，色液，终终止反止反应应观观察察结结果：果：1个斑点个斑点=1个效个效应应T细细胞胞结果判断图结果判断图阴性阴性结果果阳性阳性结果果空白空白对照照抗原抗原 AESAT-6抗原抗原 BCFP10阳性阳性对照照（PHA）潜伏性潜伏性结结核（核（LTBI）诊诊断技断技术术比比较较IGRAs与TST相比，具有更高的灵敏度和特异性IGRAs与BCG,NTM无交叉反应，TST有交叉反应难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者小于5岁儿童、免疫力低下患者不适合采用IGRAs检测试剂成本非常高 costs（费用）（费用）availability for clinicians and other health workers（医疗水平）（医疗水平）patient acceptability（患者是否接受）（患者是否接受）ease of distribution and storage（实验平台）（实验平台）核酸核酸扩扩增技增技术术核酸扩增技术反应条件扩增产物检测方法代表公司RT-PCR热循环DNA实时RocheRT-LAMP恒温DNAEikenGenoType MTBDRplus热循环DNAHain LifescienceCPA恒温DNA优思达NASBA恒温 RNAbioMerieuxTMA恒温RNA终点Gen-ProbeSAT恒温RNA实时仁度SAT：Simultaneous Amplification and Testing(RNA仁度仁度)CPA:Cross Priming Amplification(DNA/RNA,优思达优思达)LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification(DNA,Japan)TMA:Transcription Mediated Amplification(RNA,Gen-Probe)GenoType MTBDRplus：(Hain Lifescience)NASBA:Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(RNA,OT)RCA:Rolling Circle Amplification(DNA,Molecular Staging)HDA：Helicase-Dependant Amplification(DNA,Biohelix,NEB)RNA 拷贝数拷贝数 DNA拷贝数拷贝数 生命力旺盛的病原体生命力旺盛的病原体RNA转录活跃转录活跃较好的愈后指标较好的愈后指标交叉污染少交叉污染少TMATMA、SATSAT优点优点优点优点RNA作为临床分子诊断靶标作为临床分子诊断靶标二、二、SAT技术技术 同同一一温温度度下下（42），以以RNA为为起起始始模模板板，通通过过M-MLV反反转转录录酶酶产产生生一一个个双双链链DNA拷拷贝贝，然然后后利利用用T7 RNA多多聚聚酶酶从从DNA拷拷贝贝上上产产生生多多个个（1001000个个）RNA拷拷贝贝；每每一一个个RNA拷拷贝贝再再从从反反转转录录开开始始进进入入下下一一个个扩扩增增循循环环；同同时时，带带有有荧荧光光标标记记的的探探针针和和这这些些RNA拷拷贝贝特特异异结结合合，产产生生荧荧光光。该该荧荧光光信信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况RNA(+)Forward PrimerRTRNase H activityReverse PrimerRTT7100-1000 copiesMolecular BeaconReverse PrimerForward PrimerRT/RNase H activityRNA(+)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)RNA(-)RNA(-)RNA(-)DNA(+)DNA(+)TB-SAT操作步操作步骤骤阳性结果阳性结果阴性结果阴性结果恒温扩增-42CRNA 检测-起始靶标与扩增产物都是RNA扩增产物的污染更少-RNA环境中易降解更高的扩增效率-30分钟内扩增10亿倍反应稳定-抑制物少高灵敏度、特异性活菌检测操作简单、快速MTBDRsl-鉴定鉴定XDRMTBDRplus-鉴定鉴定MDRMTBC-鉴定鉴定MTB复合群复合群MTBCM-鉴定鉴定MTB和和NTM分类分类Gene-Probe(TMA/Hain)技术技术三、三、MTBC-鉴定鉴定MTB复合群复合群(TMA技术技术)方法名称：方法名称：HPV（Hybridization Protection Assay）-杂杂交交保保护护分分析析法法为为Gen-probe公司专利公司专利原理：原理：以以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群检测设备：检测设备：LEADER 50iHPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct):2.5h 报告，直接从标本中检测结核菌报告，直接从标本中检测结核菌HPA-Accuprobe:1h 报告，用菌落或自动培养系统的菌报告，用菌落或自动培养系统的菌样本样本细胞溶解细胞溶解目标目标 r-RNA释放释放MTD技术路线技术路线杂交体杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60C15分钟分钟加入探针加入探针探针探针杂交杂交AEAEAE选择性试剂选择性试剂60C化学发光读数仪化学发光读数仪 荧光检测荧光检测MTD技术特点技术特点MTD结结核分枝杆菌核分枝杆菌检测检测技技术术特点特点n采用分子技术快速鉴定（2.5小时小时）结核分枝杆菌复合群n标本可以是涂片阴性或者阳性涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物n唯一获得FDA推荐推荐的凃阴样本快速检测技术n检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）n采用TMA恒温扩增恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证nHPA杂交保护分析技术：灵敏、特异灵敏、特异n严格的实验室防污染技术实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染MTD结结核分枝杆菌的直接核分枝杆菌的直接检测检测意意义义nTB与其他分枝杆菌区分与其他分枝杆菌区分 AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）n提高提高TB检出率检出率 CSF、胸腹水等、胸腹水等n疑似患者疑似患者 长期低热、长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、痰做血、痰TB菌菌MTD检测检测DNA作为临床分子诊断作为临床分子诊断靶标靶标四、四、MTBDRplus-鉴定鉴定MDR方法名称：方法名称：耐多药结核病耐多药结核病(MDR-TB)快速诊断为快速诊断为Hain Lifescience公司公司专利专利原理：原理：采采用用线线性性探探针针技技术术（Line-Probe或或称称DNA-Strip）检检测测结结核核分分枝枝杆杆菌菌复复合合群群利利福福平平(rpoB)和和异异烟烟肼肼(katG和和inhA)等等结结核核治治疗疗药药物物的的耐耐药药基基因因来来判断判断TB体内耐药性体内耐药性MTBDRplus:6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果抗 结 核药物 靶基因 编码的产物 靶区域和突变率 最常见突变位点 耐药水平 RFPrpoBRNA聚合酶亚单位RRDR 81 bp，95Codon531，30-75高INHkatG过氧化氢酶-过氧化物酶整个基因，60-95S315T，60-95高INHinhA烯酰基还原酶调节区，25inhA-15低INHahpC-Promoter过氧化物酶启动区，12%低PZApncA吡嗪酰胺酶整个基因，68-97无特定位点高EMBembB阿拉伯糖基转移酶ERDR少数密码子，47-94Codon306，47-89高SMrpsL核糖体蛋白S12Codons 43 和88，40-95K43R，40-90高SMrrs16S rRNA多个碱基，29%513位、905位碱基，各占10.3%低喹 诺 酮类gyrAgyrBDNA旋转酶67106位,75-94%Codon90,94高结核耐药结核耐药的分子的分子机制机制MTBDRplus技术路线技术路线DNA提取提取PCR扩增扩增探针杂交探针杂交结果判读结果判读结果解释结果解释 野野生生型型：有有杂杂交交带带显显色色为为“+”，表示未发生突变，表示未发生突变 耐耐药药突突变变位位点点：有有杂杂交交带带显显色为色为“+”，表示发生突变，表示发生突变 敏敏 感感：所所 有有 野野 生生 型型 探探 针针“+”和和所所有有耐耐药药位位点点探探针针“-”耐耐药药：对对应应药药物物有有1条条野野生生型型探探针针“-”或或有有1条条耐耐药药位位点点“+”优势优势快速检测快速检测RFP和和INH的耐药的耐药时间短、操作简单、安全高时间短、操作简单、安全高 特异性和灵敏度较高、重复性好特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠主观因素影响小、更为可靠不足不足不能检测所有药物的耐药基因型不能检测所有药物的耐药基因型缺少缺少ahpC-oxyR间隔序列范围间隔序列范围不不能能取取代代传传统统细细菌菌学学检检测测、只只能能作为参考作为参考技术特点技术特点MTBDRplus技技术术方法方法结果结果比例法药敏结果比例法药敏结果耐药耐药敏感敏感灵敏度灵敏度（%）特异度特异度（%）符合率符合率（%）MTBDRplusRFP耐药耐药48098.0100.098.5敏感敏感116RFP（涂阳）耐药耐药391295.192.192.7敏感敏感2140INH耐药耐药45086.5100.089.7敏感敏感716INH（涂阳）耐药耐药63098.4100.099.5敏感敏感1129MTBDRplus技技术术性能参数性能参数J Clin Microbiol.2010 Aug;45(8):2635-40.Epub 2007 May 30MTBDRplus技技术术性能参数性能参数中国人群存在一定中国人群存在一定数量的数量的KatG S315N突变突变nWHO、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在6小时小时内给出药敏鉴定结果n可以做一一线线结结核核药药物物（异烟肼 利福平）、二二线线结结核核药药物物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）n标本可是涂片阳性的痰标本痰标本，或是培养物培养物n技术步骤简单技术步骤简单：核酸提取、PCR扩增、核酸杂交仪检测n每个试剂条上自带质控：CC杂交质控、AC扩增质控、TUB结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度可信度 HAIN-结结核分枝杆菌耐核分枝杆菌耐药药快速快速检测检测系系统统特点特点五、交叉引物恒温扩增技术五、交叉引物恒温扩增技术(Cross Priming Amplification,CPA)本本试试剂剂盒盒将将病病原原体体DNA扩扩增增、核核酸酸杂杂交交和和核核酸酸试试纸纸条条检检测测三三种种技技术术有有机机地地融融为为一一体体，在在恒恒温温扩扩增增反反应应中中加加入入两两对对TB特特异异性性引引物物、一一对对特特异异性性探探针针，同同时时一一次次性性完完成成TB DNA的的扩扩增增及及杂杂交交过过程程，然然后后用用3号号一一次次性性核核酸酸检检测测装装置置对对TB感感染染进进行行定定性性诊诊断断，其其检检测测灵灵敏敏度度为为10个个病病原原体体，高高特特异异引引物物设设计计确确保保了了结结果果的的可可靠靠性性。由由于于待待测测样样本本的的扩扩增增（PCR管管盖盖和和石石蜡蜡油油双双重重保保护护）和和检检测测过过程程均均在在物物理理封封闭闭条条件件下下完完成成，所所以以本本试试剂剂盒盒具具有有防防止止实实验验室室扩扩增增物物交交叉叉污污染染，防止假阳性的效果，防止假阳性的效果杭州优思达公司杭州优思达公司CPA技术原理图技术原理图A:引入交叉引入交叉引物位点引物位点B:交叉引交叉引物扩增物扩增C:检测产物检测产物CPA技技术术路路线图线图核酸提取核酸提取痰液痰液石蜡油石蜡油反应液反应液试剂配制试剂配制63 2恒温扩增恒温扩增金属浴金属浴防污染检测装置防污染检测装置取出反应管取出反应管15-30分钟分钟读取结果读取结果有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体双重标记的双重标记的特异性扩增物特异性扩增物阳性阳性抗抗体抗抗体有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体停留，显色停留，显色试纸试纸条条检测结检测结果判果判读读原理原理图图抗体包被的颗粒抗体包被的颗粒有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体阴性阴性无特异性扩增物无特异性扩增物抗抗体抗抗体有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体无抗抗原无抗抗原有色颗粒流出有色颗粒流出停留，但无色停留，但无色结果的判读结果的判读n 阳性：阳性：试纸条出现试纸条出现两条红色条带两条红色条带，一条位于质控区（，一条位于质控区（C C线），一条位于线），一条位于检测检测 区（区（T T线）且其强度线）且其强度L4L4（与附带的色卡比较）。表明样本中含有结（与附带的色卡比较）。表明样本中含有结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限n 阴性阴性：试纸条质控区（试纸条质控区（C C线）出现一线）出现一条红色条带条红色条带，检测区（，检测区（T T线）没有条线）没有条带或者其强度带或者其强度L4L4（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，或其水平低于本试剂盒的最低检出限或其水平低于本试剂盒的最低检出限n 无效无效：试纸条质控区（试纸条质控区（C C线）线）未出现条带未出现条带。表明试剂盒已损坏、失效或。表明试剂盒已损坏、失效或者操作有误者操作有误恒温扩增恒温扩增-CPACAP技术技术CPA的的优势优势：快速，：快速，简单简单，灵活，灵活，稳稳定定A Affordable低价低价:不需昂不需昂贵的的设备和分子和分子实验室室Sensitive灵敏：灵敏：10个菌个菌/ml；与快培比；与快培比较：87%Specific特异：能特异：能鉴别人型和牛型人型和牛型结核分枝杆菌核分枝杆菌User-friendly容易使用：不需容易使用：不需PCR仪,操作操作简单Rapid/robust快速快速/稳定：定：样本到本到结果果2小小时Equipment-free无无仪器：器：仅需离心机、水浴需离心机、水浴锅或金属浴或金属浴Deliverable易易储运：不需冷运：不需冷链运运输。装置。装置可可储存于室温存于室温ASSURED CPA技技术术性能参数性能参数六、环介导恒温扩增技术六、环介导恒温扩增技术 (Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)环环介介导导恒恒温温扩扩增增法法是是日日本本荣荣研研化化学学独独立立研研发发的的一一种种“简简便便、快快速速、准准确确、廉廉价价”的的基基因因扩扩增增方方法法。它它的的特特征征是是针针对对目目标标DNA链链上上的的六六个个区区段段设设计计四四个个不不同同的的引引物物，然然后后再再利利用用链链置置换换反反应应在在一一定定温温度度下下进进行行反反应应。反反应应只只需需要要把把基基因因模模板板、引引物物、链链置置换换型型DNA合合成成酶酶、基基质质等等共共同同置置于于一一定定温温度度下下（60-65）、经经一一个个步步骤骤即即可可完完成成。扩扩增增效效率率极极高高，可可在在15min-1h内内实实现现109-1010倍倍的的扩扩增增。而而且且由由于于有有着着高高度度的的特特异异性性，只只需需根根据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断 不需要使双链不需要使双链DNA先变性成单链先变性成单链 扩增反应在扩增反应在等温等温下可持续进行下可持续进行 扩增扩增效率极高效率极高 针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列 仅使用一种链置换仅使用一种链置换DNA聚合酶，聚合酶，成本低廉成本低廉 扩扩增增产产物物是是在在同同一一条条DNA链链上上互互补补序序列列周周而而复复始始形形成成大大小小不不一一的结构的结构 当模板是当模板是RNA时，仅需加入时，仅需加入逆转录酶逆转录酶即可与即可与DNA一样进行扩增一样进行扩增LAMP技术原理动画图技术原理动画图LAMP方法建立阶段所需的试剂方法建立阶段所需的试剂 DNA 扩增扩增 RNA扩增扩增 n模板模板DNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶ndNTPsn反应缓冲液反应缓冲液n模板模板RNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶n逆转录酶逆转录酶ndNTPsn反应缓冲液反应缓冲液LAMP技术结果判读原理图技术结果判读原理图LAMP法结果判断方式法结果判断方式-目视检查混浊目视检查混浊 LAMP法结果判断方式法结果判断方式/-目视检查绿色荧光目视检查绿色荧光/浊度检测仪浊度检测仪 n 扩增反应在等温条件（扩增反应在等温条件（6065）下连续进行）下连续进行 可以使用简便、廉价的扩增装置可以使用简便、廉价的扩增装置n 扩增效率高、可在短时间内完成扩增扩增效率高、可在短时间内完成扩增 可在短时间内得出结果可在短时间内得出结果n 有非常高的特异性有非常高的特异性 可得出可得出“扩增反应发生扩增反应发生=有目的菌存在有目的菌存在”的结论的结论n 产生大量扩增产物，检测方法简便产生大量扩增产物，检测方法简便 无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视 方法确认扩增结果方法确认扩增结果n 从扩增到检测可在从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成个反应试管内（封闭系统）完成 可防止由于扩增产物产生的污染可防止由于扩增产物产生的污染n 从从RNA经一步反应可完成扩增经一步反应可完成扩增 无需另外进行逆转录反应无需另外进行逆转录反应小结小结LAMP技术特点技术特点LAMP技术的应用领域技术的应用领域 食品领域食品领域食物中毒致病菌的检测食物中毒致病菌的检测食品的卫生管理食品的卫生管理食物中毒的防止食物中毒的防止 临床领域临床领域病原菌病原菌、病毒的检测及鉴定病毒的检测及鉴定通过通过SNP多态性分型决定用多态性分型决定用药量药量 农业领域农业领域植物病害的早期发现植物病害的早期发现及蔓延防止及蔓延防止转基因作物的检测转基因作物的检测 环境领域环境领域环境、水中病原微生物的环境、水中病原微生物的检测检测 工业领域工业领域工业产品用大量工业产品用大量DNA的生的生产成为可能产成为可能 畜牧业领域畜牧业领域雌雄性别判断雌雄性别判断病原微生物的检测病原微生物的检测遗传病的发现遗传病的发现LAMP技术性能参数技术性能参数七、七、DNA微阵列（基因芯片）技术微阵列（基因芯片）技术 DNA微微阵阵列列或或芯芯片片技技术术是是利利用用光光导导化化学学合合成成、照照相相平平板板印印刷刷以以及及固固相相表表面面化化学学合合成成等等技技术术，在在固固相相表表面面合合成成成成千千上上万万个个寡寡核核苷苷酸酸探探针针，或或将将液液相相合合成成的的探探针针由由微微阵阵列列器器或或机机器器人人点点样样于于尼尼龙龙膜膜或或硅硅片片上上，再再与与放放射射性性同同位位素素或或荧荧光光物物标标记记的的DNA或或cDNA杂杂交交，用用于于分分析析DNA突突变变及及多多态态性性、DNA测测序序、监监测测同同一一组组织织细细胞胞在在不不同同状状态态下下多多种种组组织织细细胞胞基基因因表表达达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域博奥生物博奥生物基因芯片技术操作流程基因芯片技术操作流程样品制备样品制备试剂配制试剂配制杂交杂交激光共焦扫描激光共焦扫描软件判读软件判读r分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）同同时时快快速速检检测测 17 种种分分枝枝杆杆菌菌：结结核核、胞胞内内、鸟鸟、戈戈登登、堪堪萨萨斯斯、偶偶然然、瘰瘰疬疬、浅浅黄黄、土土、龟龟-脓肿、草、不色、海脓肿、草、不色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍及耻垢。溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍及耻垢。分离株或者痰样本均可检测。分离株或者痰样本均可检测。通通 量：量：同时检测同时检测 17 种分枝杆菌种分枝杆菌速速 度：度：6小小时 versus 传统 4 周周灵敏度：灵敏度：103 CFU/反应反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读r结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）基基于于rpoB/katG/inhA的的基基因因突突变变，快快速速检检测测分分离离株株或或者者痰痰样样本本中中结结核核分分枝枝杆杆菌菌多多药药耐耐药药（利利福平、异烟肼）福平、异烟肼）通通 量：量：两两种一线抗结核药物种一线抗结核药物、8个突变位点个突变位点速速 度：度：6小时小时versus 传统传统 48 周周灵敏度：灵敏度：103 CFU/反应反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读基因芯片技术特点基因芯片技术特点基因芯片技术性能参数基因芯片技术性能参数n 分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）n 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）（基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究）（基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究）基因芯片检测和基因芯片检测和DNA测序结果的符合率为测序结果的符合率为100%绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别是是93.7、83.8、82.4-中华检验医学杂志中华检验医学杂志2011年第年第9月第月第34卷第卷第9期期 MTC和和NTM的的测测序序符符合合率率分别为分别为100%和和98.4%TB分分离离株株鉴鉴定定灵灵敏敏度度和和特特异性分别为异性分别为99.6%和和100%各项技术比较各项技术比较检测检测方法方法性能性能检测时间检测时间耗耗费费扩扩增效率增效率靶分子靶分子储储运要求运要求温度温度实验实验平台要平台要求求传统传统培养培养特异性好，灵敏度低鉴定+药敏：2-3月较大-抗原一般普通孵育较高T-SPOT特异性与灵敏度较TST好24 h高-ESAT-6与CFP 10抗原高二氧化碳孵育较高PCR特异性与灵敏度较好2.5h较高较高DNA高热循环高SAT特异性极好，灵敏度好2 h较低极高RNA一般恒温较低TMA特异性极好，灵敏度好2.5 h较低-RNA一般恒温较低各项技术比较各项技术比较检测检测方法方法性能性能检测时间检测时间耗耗费费扩扩增效率增效率靶分子靶分子储储运要求运要求温度温度实验实验平台要平台要求求Hain特异性与灵敏度较好鉴定+耐药：6 h高较高DNA高热循环较高CPA特异性与灵敏度极好2 h极低高DNA低恒温低LAMP特异性极好，灵敏度好2 h极低高DNA低恒温低基因芯片基因芯片特异性极好，灵敏度好鉴定+耐药：6 h高高DNA高热循环高Hain特异性与灵敏度较好鉴定+耐药：6 h高较高DNA高热循环较高Thank You!