碱性磷酸酶的分离纯化鉴定.ppt

碱性磷酸酶的分离纯化有机溶剂分步沉淀法有机溶剂分步沉淀法分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化分析及鉴定分析及鉴定 AKP AKP溶于溶于30%30%乙醇、乙醇、33%33%丙酮（丙酮（上清上清中），中），AKPAKP不溶于不溶于60%60%乙醇、乙醇、50%50%丙酮（丙酮（沉淀沉淀中），中），原理：操操 作作一、取材及匀浆一、取材及匀浆 取兔肝取兔肝2g，剪碎，剪碎，加入加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠醋酸镁和醋酸钠混合液，充分混合液，充分匀浆。匀浆。记录体积记录体积 （取（取0.1ml至一新至一新EP管留作管留作A液，测定时稀释液，测定时稀释25倍倍）二、提取二、提取 加入加入2ml正丁醇，搅拌正丁醇，搅拌2min，室温放置，室温放置30min。过。过滤，滤，留上清留上清。计体积。计体积。三、分离纯化三、分离纯化1、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 加入加入等体积等体积丙酮，丙酮，3000rpm5min，留沉淀，留沉淀，加加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，醋酸镁溶解沉淀，记录体积记录体积。（取（取0.1ml留作留作B液液，稀释，稀释10倍倍）2、30乙醇溶解乙醇溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.46ml 2000rpm5min，留上清留上清（记录体积记录体积）3、60乙醇沉淀乙醇沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.86ml 3000rpm5min，留沉淀，留沉淀，加加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，醋酸镁溶解沉淀，记录体积记录体积。（取（取0.1ml留作留作C液，液，使用时稀释使用时稀释5倍倍）4、33丙酮溶解丙酮溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.33ml丙酮丙酮 2000rpm5min，留上清留上清（记录体积记录体积）5、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.36ml丙酮丙酮 3000rpm15min，留沉淀，留沉淀，5ml Ph8.8的的Tris-醋酸镁醋酸镁溶解沉淀溶解沉淀 （D液，不稀释液，不稀释）四、分析及鉴定四、分析及鉴定1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法）法）3、比活性及纯化倍数计算、比活性及纯化倍数计算分光光度法分光光度法（Spectrophotometry）根根据据物物质质对对不不同同波波长长的的光光线线具具有有选选择择性性吸吸收收（即即可可产产生生吸吸收收光光谱谱）的的特特性性而而建建立立起起来来的的一一种种定定量量、定定性性分分析析的的技技术术。也也称称为为吸吸收收光光谱谱法法（Absorption spectrometry）。）。不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来（一）基本原理（一）基本原理 光具有波粒二相性。光具有波粒二相性。波波长长和和频频率是光的波率是光的波动动性的特征。性的特征。1、光的基本知识、光的基本知识紫外分光光度计（紫外分光光度计（200400nm）可见光分光光度计可见光分光光度计（400760nm）红外分光光度计红外分光光度计（7601000nm）2、定量分析的理论基础定量分析的理论基础 LambertBeer定律定律A KLC吸光度吸光度(Aabsorbance,A)消光度消光度(degree of extinction,E)光密度光密度(optical density,D)K-吸光系数吸光系数,是物质的特征性常数。是物质的特征性常数。对比法进行定量分析对比法进行定量分析A样样=K L C样样A标标=K L C标标A样样A标标K L C样样K L C标标C样样C标标C样样=A样样 C标标/A标标单色光、平行光（单色光、平行光（maxmax）溶液均匀、清澈、无散射溶液均匀、清澈、无散射溶液性质稳定，比色皿中无化学反应溶液性质稳定，比色皿中无化学反应适用于稀溶液（适用于稀溶液（A 0.2-0.7）LambertBeer定律的适用范围：定律的适用范围：溶剂空白：溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水如蒸馏水)作参作参比溶液。比溶液。试剂空白试剂空白：当显色前的样品在测定波长没有吸当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的时，可用不加入样品的“试剂空白试剂空白”作参比溶液，作参比溶液，这种方式最为常用。这种方式最为常用。参比溶液的选择参比溶液的选择 基本组件及常见分光光度计基本组件及常见分光光度计分光光度计的使用分光光度计的使用1.打开电源预热打开电源预热15分钟分钟2.选择波长（选择波长（max）3.光标指向光标指向Trans4.打开光门，调节打开光门，调节0；关上光门调节；关上光门调节1005.重复重复4一次一次6.将光标指向将光标指向ABS7.读数读数磷酸苯二钠磷酸苯二钠碱性磷酸酶碱性磷酸酶苯酚苯酚 +磷酸盐磷酸盐碱性碱性苯酚苯酚 +4-+4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 +铁氰化钾铁氰化钾红色醌式化合物红色醌式化合物AKP活性测定基本原理磷酸苯二钠法活性测定基本原理磷酸苯二钠法单位（单位（ml）空白管空白管 标准管标准管 A B C D 各阶段稀释液各阶段稀释液酚标准液酚标准液（0.1mg/ml）Tris-醋酸镁醋酸镁复合底物液复合底物液 /0.1 0.1 0.1 0.1 /0.1 /0.1 /3 3 3 3 3 3酶活性单位酶活性单位（U/ml）=A样样 A标标0.1 稀释倍数稀释倍数37保温保温 15分钟分钟各管加入铁氰化钾液各管加入铁氰化钾液2ml，静置，静置15min510nm 比色比色酚标准液浓度酚标准液浓度稀释倍数稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液醋酸镁溶液）/25 10 5 1蛋白含量测定基本原理蛋白含量测定基本原理BCA法法蛋白质蛋白质+Cu 2 碱性碱性BCA试剂试剂紫色化合物紫色化合物Cu二喹啉甲酸，BCA单位（单位（ml）空白管空白管 标准管标准管 A B C D 各阶段稀释液各阶段稀释液蛋白标准液（蛋白标准液（0.2mg/ml）蒸馏水蒸馏水BCA试剂试剂 /0.1 0.1 0.1 0.1 /0.1 /0.1 /1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5蛋白含量（蛋白含量（mg/ml）=A样样 A标标0.2 稀释倍数稀释倍数37保温保温 30分钟分钟562nm 比色比色蛋白标准液浓度蛋白标准液浓度稀释倍数稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液醋酸镁溶液）/50 20 5 1碱性磷酸酶比活性（碱性磷酸酶比活性（U/mg）=样品的酶活性单位样品的酶活性单位样品的蛋白含量样品的蛋白含量纯化倍数纯化倍数=每一步比活性每一步比活性初提液比活性初提液比活性得率得率=每一步总活性每一步总活性初提液总活性初提液总活性计计 算算每一步总活性每一步总活性=酶活性酶活性 每一部记录的体积数每一部记录的体积数