碱性磷酸酶的分离纯化鉴定.ppt
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1、碱性磷酸酶的分离纯化有机溶剂分步沉淀法有机溶剂分步沉淀法分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化分析及鉴定分析及鉴定 AKP AKP溶于溶于30%30%乙醇、乙醇、33%33%丙酮(丙酮(上清上清中),中),AKPAKP不溶于不溶于60%60%乙醇、乙醇、50%50%丙酮(丙酮(沉淀沉淀中),中),原理:操操 作作一、取材及匀浆一、取材及匀浆 取兔肝取兔肝2g,剪碎,剪碎,加入加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠醋酸镁和醋酸钠混合液,充分混合液,充分匀浆。匀浆。记录体积记录体积 (取(取0.1ml至一新至一新EP管留作管留作A液,测定
2、时稀释液,测定时稀释25倍倍)二、提取二、提取 加入加入2ml正丁醇,搅拌正丁醇,搅拌2min,室温放置,室温放置30min。过。过滤,滤,留上清留上清。计体积。计体积。三、分离纯化三、分离纯化1、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 加入加入等体积等体积丙酮,丙酮,3000rpm5min,留沉淀,留沉淀,加加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀,醋酸镁溶解沉淀,记录体积记录体积。(取(取0.1ml留作留作B液液,稀释,稀释10倍倍)2、30乙醇溶解乙醇溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.46ml 2000rpm5min,留上清留上清(记录体积记录体积)3、60乙醇沉淀乙醇沉淀AK
3、P 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.86ml 3000rpm5min,留沉淀,留沉淀,加加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀,醋酸镁溶解沉淀,记录体积记录体积。(取(取0.1ml留作留作C液,液,使用时稀释使用时稀释5倍倍)4、33丙酮溶解丙酮溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.33ml丙酮丙酮 2000rpm5min,留上清留上清(记录体积记录体积)5、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.36ml丙酮丙酮 3000rpm15min,留沉淀,留沉淀,5ml Ph8.8的的Tris-醋酸镁醋酸镁溶解沉淀溶解沉淀 (D液,不稀释液,不稀释)四、分析及
4、鉴定四、分析及鉴定1、碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法)、碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法)2、碱性磷酸酶蛋白含量测定(、碱性磷酸酶蛋白含量测定(BCA法)法)3、比活性及纯化倍数计算、比活性及纯化倍数计算分光光度法分光光度法(Spectrophotometry)根根据据物物质质对对不不同同波波长长的的光光线线具具有有选选择择性性吸吸收收(即即可可产产生生吸吸收收光光谱谱)的的特特性性而而建建立立起起来来的的一一种种定定量量、定定性性分分析析的的技技术术。也也称称为为吸吸收收光光谱谱法法(Absorption spectrometry)。)。不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来不需要把欲
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