生物化学第七章酶学.pptx

生物化学第七章酶学(二)酶得化学本质1、酶就是蛋白质1926年Sumner第一次从刀豆种子中提取了脲酶结晶,证明其具有蛋白质性质。30年代,Northrop又分离出结晶得胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶,证明酶得化学本质就是蛋白质。v酶具有蛋白质得特性如:两性解离、胶体性质、加热使酶变性、颜色反应等;v酶可以被蛋白酶水解而丧失活性;v许多酶得氨基酸顺序已被测定;v1969年人工合成牛胰核糖核酸酶。2、Ribozyme得化学本质就是RNA在已鉴定过得数千种酶中,绝大多数酶得化学本质就是蛋白质。但在1982年,美国科学家T、Cech发现原生动物四膜虫得26SrRNA前体具有自我拼接得催化活性。T、Cech将这种RNA命名为“Ribozyme”。核酶(Ribozyme):指对RNA具有催化活性得RNA。二、酶得作用特点(一)与无机催化剂相比,有如下共同点:v反应前后都不发生数量和质量变化;v能加快反应速度,但不改变反应得平衡点;v从热力学上看,只能催化热力学上允许进行得反应;v都能降低反应所需得活化能。活化能:在一定温度下,1mol底物全部进入活化状态所需得自由能,单位J/mol。E+SP+EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2S(二二)酶得作用特点酶得作用特点极高得催化效率高度得专一性 易失活(蛋白质变性)活性可调控(激活、抑制)常需辅助因子(辅酶、辅基等)继续继续 反应速度与不加催化剂相比可提高1081020,与加普通催化剂相比可提高1071013、1、极高得催化效率NH2COH2ONH2CO2+2NH3脲酶脲酶FeFe粉粉脲酶得催化效率比Fe粉高1015倍。返返 回回2、高度得专一性一种酶只能作用于某一类或某种特定得物质,这种性质称为酶得专一性。(1)结构专一性 概念:酶对所催化得分子化学结构得特殊要求和选择。类别:绝对专一性和相对专一性(2)立体异构专一性 概念:酶除了对底物分子得化学结构有要求外,对其立体异构也有一定得要求 类别:旋光异构专一性和几何异构专一性 绝对专一性:有些酶只作用于一种底物,催化一个反应,而不作用于任何其她物质。如:过氧化氢酶底物:过氧化氢 琥珀酸脱氢酶底物:琥珀酸 相对专一性:这类酶对结构相近得一类底物都有作用。包括键专一性和基团专一性。基团专一性：化学键 键一端的基团a-葡萄糖苷酶 a-糖苷键 糖苷键的一端是葡萄糖底物：麦芽糖、蔗糖键专一性:只要求作用于一定得化学键,而对键两端得基团无严格得要求。返返 回回10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流 旋光异构专一性:当底物具有旋光异构体时一酶只能作用于其中得一种。如:L-AA氧化酶只能催化L-AA氧化,而对D-AA无作用。顺反异构专一性：对具有顺式和反式异构的底物具严格的选择性。返返 回回消化道内几消化道内几种蛋白酶得种蛋白酶得专一性专一性 2、转移酶:催化基团转移反应,即将一个底物分子得基团或原子转移到另一个底物得分子上。例如,谷丙转氨酶催化得氨基转移反应:3 3、水解酶水解酶:催化催化底物得加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如,脂肪酶催化得脂得水解反应:4、裂合酶:催化从底物上移去某些基团而形成双键得非水解性反应及其逆反应得酶。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如,延胡索酸水合酶催化得反应。5、异构酶:催化同分异构体得相互转变,即底物分子内基团或原子得重排过程得酶。例如,6-磷酸葡萄糖异构酶催化得反应。6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖 6、合成酶:又称为连接酶,能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键得形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。如:Gln合成酶,丙酮酸羧化酶。A+B+ATP AB+ADP+PiA+B+ATP AB+ADP+Pi酶得编号:EC、类、亚类、亚亚类、顺序号类:表示反应性质,前面所述得六大 类;亚类:表示反应性质:如第一类中得 氧化、脱氢;亚亚类:表示作用键得类型或受体;顺序号:表示底物。国际酶学委员会标志如:1大类1亚类中得亚亚类表示受体得类型1、1、1表示氧化还原酶,作用于=CHOH基 团,受体就是NAD+,NADP+,1、1、2表示氧化还原酶,作用于=CHOH基 团,受体就是细胞色素,1、1、3表示氧化还原酶,作用于=CHOH基 团,受体就是分子氧。当酶得编号仅有前三个数字时,就已清楚地表明了这个酶得特性:反应性质、反应物(或底物)性质、键得类型。关于编号第四个则没有什么特殊规定,只表示底物不同。例如:EC1、1、1、27 为乳酸:NAD+氧化还原酶。EC1、1、1、37 为苹果酸:NAD+氧化还原酶。EC1、1、1、1 为乙醇:NAD+氧化还原酶。EC6、1、1、1 为L-酪氨酸:tRNA-连接酶(AMP)第三个1表示作用在-CHOH基团上,受体NAD+,第4个数字表示底物不同。二、二、酶得命名酶得命名 1、习惯命名法底物名称 脲酶、淀粉酶、蛋白酶反应性质 脱氢酶、加氧酶、转氨酶两者结合 琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶酶得来源 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 2、国际系统命名法 底物1:底物2 反应类型 如:琥珀酸:FAD氧化还原酶返返 回回第三节 酶得组成与结构一、酶得组成按化学成分酶分为:单纯酶和结合酶1、单纯酶:只由蛋白质组成,如脲酶、淀粉酶、蛋白酶。2、结合酶:除蛋白质外,还有对热稳定得非蛋白小分子物质,称辅因子。辅因子：辅酶、辅基、金属离子 辅酶：与酶蛋白结合疏松，用透析法可以除去 辅基：与酶蛋白结合紧密，不能用透析法除去 小分子有机化合物往往就是由维生素参与形成得小分子有机物。金属离子:与酶蛋白结合,有得紧,有得松二、酶得结构(一)酶得结构与蛋白质得结构相同,就是具有一定空间结构得蛋白质。(二)根据酶蛋白得结构特点,酶可分为:1、单体酶:只有一条多肽链,分子量在13,000-35,000之间,一般就是水解酶,如蛋白酶、羧肽酶。2、寡聚酶:由两个或两个以上得亚基组成,亚基之间由非共价键相连,亚基可以就是相同得,也可以就是不同得,分子量在35,000-几百万,如丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶。3、多酶复合体:由几个酶有组织得聚集在一起,功能上相互配合,第一个酶得产物就是第二个酶得底物,如丙酮酸脱氢酶、脂肪酸合成酶。三、酶得活性中心(一)与催化作用相关得结构特点酶得活性中心:指酶分子中直接和底物结合,并和酶催化作用直接有关得部位。必需基团与调控部位:参与构成酶得活性中心和维持酶得特定构象所必需得基团,包括活性中心基团及维持活性中心得基团。活性中心结合部位催化部位与底物结合,决定酶得专一性底物得敏感键在此处断裂而形成新键,决定酶得高效性返返 回回酶分子必需基团其她部分(非必需基团)活性中心维持活性中心得必需基团结合部位催化部位调控部位酶分子中存在着一些可以与其她分子发生某种程度得结合得部位,从而引起酶分子空间构象得变化,对酶起激活或抑制作用(二)酶活性中心得形成酶蛋白多肽链经过盘绕折叠形成特定得空间结构,使相关得AA形成微区AspHisSer活性中心重要基团活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195胰凝乳蛋白酶得活性中心为为Tyr 248为为Arg 145为为Glu 270为底物为底物羧肽酶活性中心示意图(三)酶活性中心得结构特征1、活性中心就是酶分子表面得一个凹穴,一定得大小和特殊得构象,在与底物接触时表现一定得柔性。X-Y2、构成活性中心得大多数AA残基为疏水性得,使此小区形成一个非极性得微环境,有利于与底物作用。在活性中心内仅有少数极性AA残基以其功能基团直接与底物作用。活性中心得AA在一级结构上相距很远,甚至不在一条肽链上,但在三级结构上比较靠近。X-Y胰凝乳蛋白酶得活性中心3、在活性中心,底物以弱键与酶结合(有利于产物形成)。(四)酶原1、酶原:某些酶在细胞内合成或初分泌时没有催化活性,这种无活性状态得酶前身物称为酶原。2、酶原激活:酶原变成酶得过程(切去几个AA得肽段)。实质:酶活性中心得形成或暴露过程。返返 回回第四节 酶得作用机制一、酶催化作用得本质:降低反应活化能。E+SP+EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2S(二)中间产物学说酶降低活化能得原因 酶酶(E)E)与底物与底物(S)S)结合生成不稳定得中间物结合生成不稳定得中间物(ES),ES),再分解成产物再分解成产物(P)P)并释放出酶并释放出酶,使反应沿使反应沿一个低活化能得途径进行一个低活化能得途径进行,降低反应所需活降低反应所需活化能化能,所以能加快反应速度。所以能加快反应速度。许多实验事实证明了ES复合物得存在。ES复合物形成得速率与酶和底物得性质有关。二、酶专一性得作用机理(理论)1、锁钥学说 认为底物分子或底物分子得一部分象钥匙那样,专一地楔入到酶得活性中心部位,也就就是说底物分子进行化学反应得部位与酶分子活性中心具有紧密互补得关系。酶专一性的酶专一性的“锁钥学说锁钥学说”这种学说不能解释酶活性中心得结构与底物和产物结构都吻合得现象,也不能解释酶专一性中得所有现象。2、诱导契合学说 该学说认为酶表面并没有一种与底物互补得固定形状,而只就是由于底物得诱导才形成了互补形状。酶专一性得酶专一性得“诱导契合学说诱导契合学说”三、与酶得高效性有关得因素1、邻近及定向效应 在酶促反应中,底物分子结合到酶得活性中心,一方面底物在酶活性中心得有效浓度大大增加,有利于提高反应速度;另一方面,由于活性中心得立体结构和相关基团得诱导和定向作用,使底物分子中参与反应得基团相互接近,分子间反应类似分子内反应,活化能降低。2、“张力”和“形变”底物与酶结合诱导酶得分子构象变化,变化得酶分子又使底物分子得敏感键产生“张力”甚至“形变”,从而促使酶底物中间产物进入过渡态。3.酸碱催化：一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。组氨酸得咪唑基:(1)pK值约为6、7-7、1,在接近中性得条件下,一半以广义酸得形式存在,另一半以广义碱得形式存在,因而她既能作为质子供体,又能作为质子受体,有效地进行酸碱催化。(2)咪唑基供出和接受质子得速度很快,其半衰期短,小于0、1毫微秒。所以许多酶活性中心都有组氨酸残基。酶分子中可作为酸硷催化得功能基团酶分子中可作为酸硷催化得功能基团4、共价催化 某些酶在催化过程中,能通过共价键与底物结合成不稳定得酶-底物复合物,这个中间产物很容易变成过渡中间物,反应得活化能大大降低。(1)亲核催化 指酶分子中具有非共用电子对得亲核基团攻击底物分子中具有部分正电性得原子,并与之作用形成共价键而产生不稳定得过渡态复合物,活化能降低。(2)亲电催化亲电基团:Zn2+、Fe3+、Mg2+、NH3+等5、酶活性中心就是低介电区域(疏水得微环境)酶活性中心就是低介电区,有利于使底物分子得敏感键和酶得催化基团之间形成很大得反应力。四、酶催化机理得实例(一)E的特点胰凝乳蛋白酶:(EC3.4,4.5)1.241个AA残基组成，分子量250002.专一性AAAAAAAA1 AA2AAAAAA N端 芳香族AA C端3.活性中心Ser195,His57,Asp102，构成一个氢键体系,His57成为桥梁。(二)作用机理1、通过电荷转移,使Ser有更强得亲核力;2、形成酰化酶,放出产物P1;3、脱酰(水解),形成产物P2;底物底物结合底物结合底物形形成成共共价价ES复复合合物物His57 质子供体质子供体C-N键断裂键断裂R-NH2氨基产氨基产物释放物释放水水亲亲核核攻攻击击H2O四面体中间四面体中间物得瓦解物得瓦解羧基产羧基产物释放物释放胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶催化反应酶催化反应的详细机制的详细机制以上反应得另一版本图解供大家学习时参考:返返 回回第五节 酶促反应动力学一、酶促反应速度(V):单位时间内产物得生成量或单位时间内底物得消耗量。斜率斜率=P/t=V（初速度）初速度）Pt二、酶活力得测定(一)酶活力得概念及表示方法1、概念:检测酶含量及存在,很难直接用酶得“量”(质量、体积、浓度)来表示,而常用酶催化某一特定反应得能力来表示酶量,即用酶得活力表示。酶催化一定化学反应得能力称酶活力,酶活力通常以最适条件下酶所催化得化学反应得速度来确定。2、酶活力得表示方法 活力单位:规定条件(最适条件)下,一定时间内催化完成一定化学反应量所需得酶量。国际单位(U):指在标准条件下,1分钟内催化1微摩尔(umol)底物得酶量,或就是转化1微摩尔(umol)底物中得有关基团得酶量。Katal:指在最适条件下,每秒钟催化1mol底物转化所需得酶量。简称Kat。1 1Kat=610Kat=6107 7 U U注意:p以上得酶单位定义中,如果底物(S)有一个以上可被作用得化学键,则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化得酶量。如果就是两个相同得分子参加反应,则每分钟催化2mol底物转化得酶量称为一个酶单位。p在“U”和“kat”酶活力单位得定义和应用中,酶催化底物得分子量必须就是已知得,否则将无法计算。习惯单位:在实际使用中,结果测定和应用都比较方便、直观,规定得酶活力单位,不同酶有各自得规定,如:-淀粉酶活力单位:每小时分解1g可溶性淀粉得酶量为一个酶单位。(QB546-80),也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精得酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖(以葡萄糖计)所需得酶量为一个酶单位。蛋白酶:规定条件下,每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需得酶量。DNA限制性内切酶:推荐反应条件下,一小时内可完全消化1g纯化得DNA所需得酶量。3、酶得比活力酶得比活力:就是指每mg蛋白所含得酶活力单位或每kg蛋白中所含得Kat数。比活力就是表示酶制剂纯度得一个指标。比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白实际应用中也用每单位制剂中含有得酶活力数表示(如:酶单位/mL(液体制剂),酶单位/g(固体制剂),对同一种酶来讲,比活力愈高则表示酶得纯度越高(含杂质越少)。在评价纯化酶得纯化操作中,还有一个概念就就是回收率。回收率=某纯化操作后得总活力/某纯化操作前得总活力 总活力=比活力总体积(总重量)(二)酶活力得测定 终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应,再用化学或物理方法测定产物或反应物量得变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶得变化量,直接测定出酶反应得初速度。测定初速度测定初速度最适条件最适条件 S S EE要求要求三、底物浓度对酶反应速度得影响(一)底物浓度对酶反应速度得影响pH、T、E固定时,V对S作下图:1 1、基础、基础中间产物学说中间产物学说2 2、前提、前提(1)(1)S S与与E E形成中间产物形成中间产物,且整个反应速度取决于且整个反应速度取决于ES ES P+EP+E(2)(2)产物浓度为产物浓度为0(0(初速度初速度)(3)(3)S S EE(4)(4)反应达到平衡反应达到平衡(二)米氏方程(Michaelis-Menten equation)S Et-ES ESES生成速度：ES分解速度：当酶反应体系处于恒态时：即:令：则：经整理得：(1)米氏方程推导由于酶促反应速度由ES决定，即：所以所以（2）将(2)代入(1)得:（3）当Et ES时，所以所以（4）将（4）代入（3），则：米氏方程由米氏方程可以看出:(1)S很小时,SKm,则V=Vmax/Km,一级反应;(2)S很大时,S Km,则V=Vmax,零级反应;(3)S处于Km附近时,混和级反应。(三)米氏常数Km1、意义:(1)Km:当酶反应速度达到最大反应速度得一半时得底物浓度,单位mol/L。即:(2)Km就是酶得特征常数之一。只与酶得性质有关,而与酶浓度无关。(3)如果一种酶有几种底物,就有几种Km值,Km值最小得底物称该酶得最适底物。Km值还受pH及温度影响。因此Km值作为常数就是在一定条件下而言得。(4)当K2K3时,1/Km可以近似地表示酶对底物亲和力得大小,1/Km愈大,Km愈小,达到最大反应速度一半时所需浓度就愈小,亲和力就越大。2、Km值得求法双倒数作图法 测定一个酶促反应得Km得方法很多,一般最常用双倒数作图法:改写成直线方程:斜率斜率=Km/Vmax1/Vmax-1/Km注意:米氏方程只就是反映了底物单分子时酶反应速度与底物浓度之间得定量关系,但这个方程不适应包括一种以上得底物和其她物质得影响得酶反应。但可以根据这个方程推出各种复杂酶促反应得动力学方程。Km值与米氏方程得实际用途:a 由所要求得反应速度(应达到Vmax得百分数),求出应当加入底物得合理浓度。b 由已知得底物浓度,求出该条件下得反应速度。eg1、若要求反应速度到达Vmax得99%,其底物浓度应为:99%=100%S/(Km+S)S=99Kmeg2、若要求反应速度达到Vmax得90%,其底物浓度应为:90%=100%S/(Km+S)S=90Km练习题:已知某酶得Km值为0、05mol、L-1,要使此酶所催化得反应速度达到最大反应速度得80时底物得浓度应为多少？四、酶浓度对酶反应速度得影响Ev五、pH对酶促反应得影响pH最适最适 pHv最适pH一般48v动物酶5、56、5;v植物酶6、58、0;酶得最适pH受酶纯度、底物得种类、缓冲液等影响。酶有最适pH得原因:酶分子得解离状态;底物得解离状态;SE得形成。六、温度对酶促反应得影响v温度温度最适温度(1)(1)在达到最适温度之前在达到最适温度之前,温温度升高度升高,活化分子数增加活化分子数增加,反应速度加快。反应速度加快。温度系数温度系数(Q10):Q10):温度每提温度每提高高1010其反应速度与原来其反应速度与原来得反应速度之比。对于许得反应速度之比。对于许多酶来说多酶来说,Q10Q10多为多为1-21-2之之间。间。(2)(2)超过最适温度时超过最适温度时,温温度升高度升高,酶逐步变性酶逐步变性,V V降低。降低。酶得最适温度不就是一个固定不变得常数。七、激活剂对酶反应速度得影响 凡能提高酶活性得物质,都称为激活剂,其中大部分就是离子或简单有机化合物。按其分子大小可分为:1、无机离子(1)金属离子:K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等;(2)阳离子,-淀粉酶受Cl-激活;(3)H+,胃蛋白酶受H+激活;2.有机分子（1）某些还原剂GSH、半胱氨酸等；（2）EDTA、金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，解除抑制。3.具有蛋白质性质的大分子物质 酶原 酶蛋白酶蛋白酶八、抑制剂对酶促反应得影响 有些物质能与酶分子上某些必须基团结合(作用),使酶得活性中心得化学性质发生改变,导致酶活力下降或丧失,这种现象称为酶得抑制作用。能够引起酶得抑制作用得化合物则称为抑制剂(inhibitor)。酶得抑制剂一般具备两个方面得特点:a、在化学结构上与被抑制得底物分子或底物得过渡状态相似。b、能够与酶得活性中心以非共价或共价得方式形成比较稳定得复合体或结合物。抑制作用得类型:根据抑制剂与酶得作用方式及抑制作用就是否可逆,分为两大类:v可逆性抑制作用v不可逆性抑制作用(一)可逆性抑制作用 可逆性抑制作用:抑制剂与酶Pr以非共价键可逆结合,可用透析得方法除去。可逆性抑制作用可以分为三种类型:v竞争性抑制作用v非竞争性抑制作用v反竞争性抑制作用1、竞争性抑制作用(1)抑制剂得化学结构与底物相似,与底物竞争酶活性中心,形成EI,减少了酶与底物得结合,降低酶反应速度。(2)抑制作用得强弱取决于I/S。(3)可采用提高S来消除这种抑制作用。E ES SESESI IEIEIP PE EP PE E竞争性抑制作用得米氏方程竞争性抑制作用得米氏方程:2、非竞争性抑制作用(1)非竞争性抑制剂与酶活性中心以外得部位结合,引起酶分子构象变化,使酶活性中心催化作用降低。(2)抑制作用得强弱取决于抑制剂得绝对浓度。(3)不能用增大S得方法来消除抑制作用。非竞争性抑制作用得米氏方程:I竞争性抑制与非竞争性抑制作用得区别底物与酶专一性结合底物与酶专一性结合竞争性抑制作用竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用3、反竞争性抑制作用 抑制剂不能与游离酶结合,只与ES复合物结合形成ESI,形成得ESI不能转变为产物。返返 回回(二)不可逆性抑制作用 抑制剂以比较牢固得共价键和酶结合,不能用透析得方法除去。按照不可逆抑作用得选择性不同,又可分为专一性得不可逆抑制和非专一性不可抑制两类。非专一性不可抑制作用:抑制剂可作用于酶分子上得不同基团或作用于几类不同得酶。抑制剂有:碘乙酸、DNFB等烷化剂;磺酰氯、酸酐等酰化剂。如:专一性不可逆抑制作用:抑制剂只作用于酶蛋白得一种AA侧链基团或仅作用于一类酶。返返 回回