光山油茶饼粕蛋白水解物的制备及功能活性分析.pdf
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1、2582023年第9期中国食品添加剂China Food Additives分析测试光山油茶饼粕蛋白水解物的制备及功能活性分析朱静,吕静,邢淑婕,陈亚蓝,李亚钦,陈龙*(信阳农林学院食品学院,河南省大别山特色食物资源综合利用工程技术研究中心,信阳 464000)摘 要:从光山油茶饼粕中提取蛋白,以油茶粕多肽含量为指标,通过酶法生产油茶饼粕蛋白水解物,并对其功能活性进行验证。采用单因素试验优化酶解时间、加酶量和底物浓度,利用 Design Expert 8.0.6 统计分析软件得到油茶粕多肽含量随加酶量、底物浓度和酶切时间变化的标准回归模型,采用响应面分析得到最佳酶解条件,并做验证试验。最佳水解
2、条件为:采用胃蛋白酶处理油茶粕,在加酶量 6950 U/g、底物浓度 2.9%、时间为 4.1 h 时为最佳酶解条件,油茶粕多肽含量为(6.200.15)g/mL,通过检测发现,油茶粕蛋白多肽对羟自由基的清除能力为 93.89%,对 DPPH 和 ABTS+自由基的清除能力分别为 61.29%和 37.17%,对油脂吸附能力为 0.414 g/g,0.20 g/mL 的多肽胆酸盐结合能力为 0.9 g/mL,说明油茶粕蛋白水解物具有较好的抗氧化和降脂能力。关键词:油茶籽粕多肽;响应面分析;抗氧化活性;降脂能力中图分类号:TS202.3 文献标识码:A 文章编号:1006-2513(2023)0
3、9-0258-08doi:10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.034Preparation and functional activity analysis of protein hydrolysate from Guangshan Camellia oleifera oil extraction residues ZHU Jing,L Jing,XING Shujie,CHEN Yalan,LI Yaqin,CHEN Long*(College of Food Science,Xinyang Agriculture and Forestry University
4、,Engineering Technology Research Center for Comprehensive Utilization of Characteristic Food Resources in Dabie Mountain,Xinyang 464000)Abstract:Protein was extracted from Guangshan Camellia oleifera oil extraction residues,and its hydrolysate was prepared by enzymatic method using polypeptide as th
5、e index.The functional activity of the protein hydrolysate was tested.The single factor design was used to optimize the enzyme hydrolysis time,the enzyme amount and the concentration of the substrate.The standard regression model was obtained using the Design Expert 8.0.6 statistical analysis softwa
6、re.The optimized enzyme hydrolysis conditions by response surface analysis were as follows:Camellia oleifera meal treated with pepsin,enzyme amount 6950 U/g,substrate concentration 2.9%,and reaction time 4.1 h.The content of polypeptide in camellia oleifera meal was(6.200.15)g/mL.the scavenging abil
7、ity of protein polypeptide of Camellia oleifera meal to hydroxyl free radical was 93.89%,the scavenging ability to DPPH and ABTS free radical was 61.29%and 37.17%,respectively,and the adsorption ability to oil was 0.414 g/g.The binding 收稿日期:2023-02-21 *通信作者基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(212102110314),河南省
8、青年科学基金项目(212300410228),信阳农林学院高水平科研孵化器建设项目(FCL202014),信阳农林学院 2019 年度学校青年基金项目(2019LG002),信阳农林学院科技创新团队(XNKJTD-001)。作者简介:朱静(1983-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物技术、食品微生物与发酵技术。2592023年第9期中国食品添加剂China Food Additives分析测试capacity of 0.20 g/mL polypeptide cholate was 0.9 g/mL,indicating that the protein hydrolysate of C
9、amellia oleifera meal had good antioxidant and lipid-lowering capacity.Key words:Camellia oleifera meal polypeptide;response surface analysis;antioxidant activity;lipid-lowering ability油茶籽经压榨后得到的茶籽油,是一种有“东方橄榄油”美称的高品质食用油,但其残渣油茶粕,因其中含有皂素而辛辣刺激,油茶粕无论做肥料还是饲料,效果均不理想,通常作为清塘剂直接撒到池塘中;若作为废弃物丢弃堆积,霉变之后会造成污染。但油茶
10、粕中含有 10%20%的蛋白质,其氨基酸组成为 17 种,其中8 种为人体必需氨基酸,组氨酸和精氨酸两种半必需氨基酸含量也较高,为潜在的优质植物蛋白资源。研究表明,油茶粕降脂多肽具有降血脂和降低胆固醇的功效,对动脉粥样硬化导致的冠心病、心肌梗塞、中风等多种脂代谢异常疾病及心脑血管疾病都有一定的预防作用1。后期如能将其开发成功能食品,可增加其经济附加值,提高农民收入。目前制备生物功能性肽最为常见的方法是酶解法,其专一性高,酶切效果好,反应条件也不剧烈2-3。赵丽娜等4用复合蛋白酶水解茶渣,水解产物对 DPPH 的清除率为 90.30,对 OH 的清除率为 65.18,且分子量 8000 Da的蛋
11、白质水解产物具有更有效的抗氧化活性。赵世光等5用胃蛋白酶酶解油茶籽粕,多肽产率达到 61.8%。林秀椿等6用产蛋白酶的红曲霉、米曲霉、构巢曲霉菌对油茶茶粕蛋白进行发酵,低分子蛋白含量达到了 49.38%。基于以上研究,本文采用胃蛋白酶处理获得油茶粕蛋白水解物,通过响应面分析法得到最佳酶解条件。并初步探究酶解物抗氧化及降脂功能,包括羟自由基、DPPH 及 ABTS+自由基清除能力、油脂吸附和胆酸盐结合能力,为油茶饼粕的综合应用和提高附加值等提供研究基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂油茶籽粕:光山县槐店乡司马光油茶园。胃蛋白酶(120 U/g):上海源叶生物科技有限公司;DPPH(1,1-Di
12、phenyl-2-picrylhydrazyl radical;2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl):上海麦克林生化科技有限公司;ABTS(2,2-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt):上海麦克林生化科技有限公司;所有提取试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备TDL-40B 低速离心机:上海安亭科学仪器厂;TGL-16 高速离心机:江苏省金坛市环宇科学仪器厂;FD-1A-80 冷冻干燥机:上海比朗仪器制造有限公司;A390 紫外分光光度计:翱艺仪器
13、(上海)有限公司;DXF-20C 粉碎机:广州市大祥电子机械设备有限公司。1.3 方法1.3.1 油茶粕蛋白的提取参考范东斌方法7,采用超声波辅助溶剂法提取油茶粕中的蛋白质。将干燥粉碎过的油茶粕过筛,脱脂后取 100 g 加入 4000 mL 70%的乙醇溶液,并调节其 pH至 10,在 48 的水浴中超声波提取 68 min,过滤得滤液,其超声功率为 450 W。将过滤后的残渣按照 140 的固液比加 70%乙醇溶液进行三次浸提。将所得滤液合并后静置 12 h,然后再次过滤,将滤液 4000 r/min 离心 10 min,并用 20%的盐酸将离心后的上清液调至蛋白质的等电点(pH=4.2)
14、,待沉淀出现并稳定后将沉淀真空冷冻干燥,得到油茶粕蛋白,采用凯氏定氮法,根据下面公式,代入计算其提取率。蛋白质提取率/%=mM100%(1)式中:m 为干燥后油茶粕蛋白含量,g;M为原料中蛋白质含量,g。1.3.2 油茶粕蛋白酶解单因素试验设计1.3.2.1 酶解时间对酶解效果的影响 配制底物浓度为 3%的油茶粕蛋白溶液,调节 pH=2.0,根据溶液中蛋白质的质量,以 7000 U/g 的加酶量加2602023年第9期中国食品添加剂China Food Additives分析测试入已经活化的胃蛋白酶,在 45 的水浴中分别酶解 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h,终止酶解反应,
15、在 5000 r/min 条件下离心 15 min,测定油茶粕多肽含量,确定最优酶解时间。1.3.2.2 加酶量对酶解效果的影响 配制底物浓度为 3%的油茶粕蛋白溶液,调节 pH=2.0,分别以 5000、6000、7000、8000、9000、10000 U/g 的加酶量加入已经活化的胃蛋白酶溶液,在 45 条件下以最优酶解时间酶解,终止酶解反应,5000 r/min 条件下离心 15 min,测多肽含量,确定最优加酶量。1.3.2.3 底物浓度对酶解效果的影响 分别配制底物浓度为 1%、2%、3%、4%、5%、6%的油茶粕蛋白溶液,调节 pH 为 2,以最优加酶量加入已经活化的胃蛋白酶,在
16、 45 条件下以最优酶切时间酶解,终止酶切反应,5000 r/min 条件下离心 15 min,测油茶粕多肽含量,确定最优底物浓度。1.3.3 油茶粕蛋白酶解响应面试验设计在单因素试验的基础上,通过 Design Expert 8.0.6 软件设计进行响应曲面试验设计以及数据分析。根据单因素试验结果,以酶切时间、加酶量、底物浓度三个因素为自变量,以油茶粕多肽含量为响应值,进行三因素三水平的响应面试验,共计 17 个试验点,5 个中心重复试验,以探究胃蛋白酶酶解油茶饼粕蛋白的最佳工艺条件。各因素水平见表 1。表 1 因素水平表Table1 Factors and levels 因素水平A 加酶量
17、/(U/g)600070008000B 底物浓度/%2.003.004.00C 酶解时间/h3.504.004.50在响应面试验完成后,以响应面所优化后的工艺条件连续酶切油茶粕蛋白,将所得的数值与响应面模型所得预测值进行比较,观察差异性。1.3.4 油茶粕多肽含量的测定1.3.4.1 标准曲线的绘制 取 0.01 g 经干燥的甘氨酸,加入蒸馏水至 10 mL,稀释得到 20 g/mL溶液,再分别稀释成 220 g/mL 的稀释液。各取 2 mL 稀释液,加入 1 mL 茚三酮显色指示剂,充分混匀后沸水浴 15 min,冷却后加入 5 mL 浓度为 40%的乙醇溶液,静置 15 min,在 57
18、0 nm处测定吸光度8。1.3.4.2 油茶粕蛋白多肽含量的测定方法 取 3 mL 水解液,加入 3 mL 质量浓度为 20%的三氯乙酸溶液,静置 15 min 后,在 5000 r/min 条件下离心 15 min,取 0.5 mL 离心液定容稀释 100 倍,取 14 mL 稀释液,采用 pH=8.0 的磷酸盐缓冲液和茚三酮作为指示剂,水浴后冷却定容。以水做参比液,在 570 nm 处测定吸光值,对照标准曲线,根据标准曲线方程,得到油茶粕多肽含量。1.3.5 油茶粕多肽抗氧化性能的测定1.3.5.1 羟基(OH)自由基清除能力测定 参照李晓博9的方法稍作修改,进行油茶粕蛋白多肽对羟基(OH
19、)自由基的清除能力测定,羟自由基清除计算公式如下:%100%/清除率0102AAAA%1001%/清除率021AAA%1001%/清除率01AA (2)式中:A0 为空白组吸光值;A1 为无双氧水对照组吸光值;A2 为样品清除自由基后吸光值。1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力测定 参考朱培等10的试验方法,略有修改,进行油茶粕蛋白多肽对 DPPH 自由基的清除能力测定,DPPH 自由基清除计算公式如下:%1001%/清除率021AAA%1001%/清除率01AA (3)式中:A0 为空白组吸光值;A1 为样品清除自由基后吸光值;A2 为无水乙醇对照组吸光值。1.3.5.3 ABTS+自由
20、基清除能力测定 参考刘薇等11的试验方法,略作修改,进行油茶粕蛋白多肽对 ABTS+自由基的清除能力测定,ABTS+自由基清除计算公式如下:%1001%/清除率01AA (4)式中:A1 为样品吸光度值;A0 为空白对照吸光度值。2612023年第9期中国食品添加剂China Food Additives分析测试1.3.6 油茶粕多肽降脂性能的测定1.3.6.1 油脂吸附能力的测定 参照龚受基等12的试验方法,稍作修改,吸油量计算公式如下:吸油量/(g/g)=(A2-A1)/A1 (5)式中:A1为油茶粕蛋白水解液的质量,g;A2为吸附油脂后油茶粕蛋白水解液的质量,g。1.3.6.2 胆酸钠结
21、合能力测定 参考刘淑敏等13的试验方法,略有修改,分别吸取 10、20、30、40、50 L 质量浓度为 0.05 mg/mL 的油茶粕蛋白酶解液,分别加入 6 mL 的 pH 值为 6.3 的磷酸盐缓冲溶液和 4 mL 的 0.6 mmol/L 甘胺胆酸钠和牛磺胆酸钠溶液(最后对应的浓度分别为 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL),于 37条件下震荡 2 h,离心后取 2.5 mL 上清液加入 7.5 mL 浓度为 60%的硫酸溶液,70 条件下水浴 20 min、冰水浴 5 min,在 378 nm 处测得其吸光度,由标准曲线求得样液中的胆酸盐。标准曲线的绘制:分别
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