生物技术制药第二章-发酵工程.ppt

第二章第二章 发酵工程制药发酵工程制药 第一节第一节 概述概述一、发酵工程一、发酵工程 微生物工程微生物工程:自催化自催化过程过程 完整的工业体系完整的工业体系(一一)发酵的定义发酵的定义1 1、传统发酵、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌最初发酵是用来描述酵母菌 作用于果汁或麦芽汁产生气作用于果汁或麦芽汁产生气 泡的现象，或者是指酒的生泡的现象，或者是指酒的生 产过程。产过程。2 2、生化和生理学意义的发酵、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出精并放出COCO2 2。3 3、工业上的发酵、工业上的发酵l泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,包括：包括：1.1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。氨基酸、酶制剂等。l产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。(二二)发酵工业发酵工业定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。发酵食品发酵食品有机酸有机酸氨基酸氨基酸核酸类物质核酸类物质酶制剂酶制剂医药工业（抗生素医药工业（抗生素）饲料工业（单细胞蛋白饲料工业（单细胞蛋白环境工程（废物处理）环境工程（废物处理）其它其它 （冶金工业（冶金工业）抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等生物农药、生物肥料等(1)(1)传统生物技术传统生物技术(2)(2)现代生物技术现代生物技术基因工程菌发酵基因工程菌发酵二、发酵类型二、发酵类型1 1、微生物菌体发酵、微生物菌体发酵定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。药用微生物制剂等。病用的疫苗等。药用微生物制剂等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。段，生长稳定期产量最高。2 2、微生物的酶、微生物的酶目前的酶多数来源于微生物发酵目前的酶多数来源于微生物发酵医用酶制剂的生产医用酶制剂的生产医药工业用酶医药工业用酶酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。产量。生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。以及发酵条件等方面需给予注意。3 3、微生物代谢产物发酵、微生物代谢产物发酵包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所停止生长时期即稳定期所 产生的，来自于中间代谢产生的，来自于中间代谢 产物和初级代谢产物。产物和初级代谢产物。1,3-1,3-丙二醇两步发酵法丙二醇两步发酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母酵母伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等4 4、微生物的生物转化、微生物的生物转化定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更多经济价值的化合物。但具有更多经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。一特定部位进行化学反应而形成的。三、微生物发酵生产药物的分类三、微生物发酵生产药物的分类（一）抗生素类（一）抗生素类90009000种种微生物发酵占微生物发酵占7070。有价值的抗生素，几乎全部。有价值的抗生素，几乎全部由微生物生产由微生物生产抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等（二）氨基酸类（二）氨基酸类单个氨基酸制剂：单个氨基酸制剂：复方氨基酸制剂：复方氨基酸制剂：微生物发酵法：微生物发酵法：酶转化法酶转化法黄色短杆菌合成赖氨酸的途径黄色短杆菌合成赖氨酸的途径（三）核苷酸类（三）核苷酸类肌苷酸，肌苷，肌苷酸，肌苷，AMPAMP，ATPATP，辅酶等，辅酶等（四）维生素类（四）维生素类维生素维生素C C的原料药的原料药2-2-酮基酮基-古龙酸，维生素古龙酸，维生素A A的前体的前体B-B-类胡萝卜素，维生素类胡萝卜素，维生素D2D2的前体麦角甾醇，维生的前体麦角甾醇，维生素素B2B2，B12B12等等（四）甾体类激素（四）甾体类激素甾体类激素的生产过程中，甾体类激素的生产过程中，一些特异反应需借助一些特异反应需借助微生物的反应。微生物的反应。（五）治疗酶及酶抑制剂（五）治疗酶及酶抑制剂药用酶药用酶酶抑制剂酶抑制剂四、发酵工程制药特点及发展趋势四、发酵工程制药特点及发展趋势（1 1）菌种是根本）菌种是根本（2 2）理论产量存在）理论产量存在“生物学变量生物学变量”（3 3）常温常压下反应，安全，条件简单）常温常压下反应，安全，条件简单（4 4）纯种培养，防污染）纯种培养，防污染（5 5）可制备复杂高分子化合物）可制备复杂高分子化合物（6 6）分子水平，定向发酵，组合生物合成等）分子水平，定向发酵，组合生物合成等（7 7）发酵工业成本低）发酵工业成本低菌种选育菌种选育自然界选种、诱变育种、自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程基因工程、细胞工程培养基配制培养基配制根据培养基的配制原则制备，根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方实践中需多次试验配方灭菌灭菌杀灭杂菌（胞体、孢子杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）及芽孢）扩大培养和接种扩大培养和接种发酵过程（中心阶段）发酵过程（中心阶段）检测进程，满足营养需要；检测进程，满足营养需要；严格控制温度、严格控制温度、pH、溶氧、溶氧、转速等转速等分离纯化分离纯化菌体：过滤、沉淀；代谢产物：菌体：过滤、沉淀；代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换蒸馏、萃取、离子交换发酵工程基本流程发酵工程基本流程发酵的基本过程发酵的基本过程发酵的基本过程发酵的基本过程:菌种菌种 种子制备种子制备 发酵发酵 预处理预处理 提取精制提取精制典型发酵过程典型发酵过程第二节、发酵工程中的微生物第二节、发酵工程中的微生物一、常见的药用微生物一、常见的药用微生物发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌细菌细菌放线菌放线菌（一）细菌（一）细菌主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等（二）（二）放线菌放线菌产抗生素最多的一类微生物产抗生素最多的一类微生物另外生产另外生产B12,B12,酶，甾体转化酶，甾体转化抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：代谢，目前发现的生物来源如下：放线菌（链霉素；四放线菌（链霉素；四环素；红霉素等）环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源链霉菌链霉菌（三）真菌（三）真菌抗生素抗生素维生素维生素酶制剂酶制剂有机酸等有机酸等药用真菌（大型真菌）药用真菌（大型真菌）1.1.藻状菌纲：根霉；犁头霉藻状菌纲：根霉；犁头霉2.2.子囊菌纲：酵母子囊菌纲：酵母3.3.担子菌纲：牛肝菌，灵芝担子菌纲：牛肝菌，灵芝4.4.半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶二、生产菌种的选育二、生产菌种的选育工业化菌种的要求工业化菌种的要求1.1.遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定2.2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体3.3.目标产物产量接近理论转化值目标产物产量接近理论转化值4.4.目标产物分泌到胞外目标产物分泌到胞外5.5.尽可能减少类似物产量尽可能减少类似物产量6.6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物效地合成产物自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为1010-8-81010-9-9一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退退和和生生产产质质量量的的下下降降，这这种种突突变变成成为为负负突变突变。另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产产有有利利，这种突变成为正突变。这种突变成为正突变。（1 1）自然选育）自然选育1采样采样2.2.分离菌株分离菌株自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。平板分离平板分离(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备挑选单菌落挑选单菌落礼来公司花了礼来公司花了1010年的时间从年的时间从4040万株微生物万株微生物中，发现了三中，发现了三种有潜力的新种有潜力的新抗生素。抗生素。（2)2)自发突变与定向育种自发突变与定向育种一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发突变体突变体结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。其作为自身的营养物质。筛选抗性株，可成为高产株筛选抗性株，可成为高产株抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产步的人工改造才能真正用于工业生产 菌种选育菌种选育突变、体内重组突变、体内重组体外重组（基因工程）体外重组（基因工程）（3 3）诱变育种）诱变育种用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛选，称为诱变育种筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,5-Br-U5-Br-U物物理理诱诱变变剂剂：紫紫外外线线、X-X-射射线线、-射射线线，快快中中子子；目目前前使使用用得得最最方方便便而而且且十十分分有有效效的的是是紫紫外外线线。许许多多高高产产菌菌株株的的选选育育都都用用过过紫紫外外线线，对对于于一一般般实实验室、中小型工厂都适用，也很安全。验室、中小型工厂都适用，也很安全。化化学学诱诱变变剂剂：碱碱基基类类似似物物、5-5-氟氟尿尿嘧嘧啶啶、烷烷化化剂剂等等。使使用用最最多多、最最有有效效的的是是烷烷化化剂剂。大大多多数数情情况况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效诱变育种步骤诱变育种步骤出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱变处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选筛选的方法筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选（4 4）杂交育种）杂交育种通过有性生殖进行通过有性生殖进行(5)(5)原生质体融合原生质体融合两个细胞融合两个细胞融合1.1.原生质体融合的一般程序原生质体融合的一般程序去细胞壁融合筛选去细胞壁融合筛选2.2.酶酶 溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶基因突变：基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组基因重组：杂交、原生质体融合、基因工杂交、原生质体融合、基因工程程基因的直接进化基因的直接进化：点突变、易错点突变、易错PCRPCR、同序法、同序法DNA ShufflingDNA Shuffling等等（6 6）基因重组进化育种）基因重组进化育种错位PCR基本步骤基本步骤 (1)(1)用用DNaseDNase I I消化功能消化功能相同的一组基因片段相同的一组基因片段(A)(A)，从而产生随机小片段，从而产生随机小片段(B)(B)。(2)(2)经提纯后，用无引物经提纯后，用无引物(经变经变性后可互为引物性后可互为引物)的类似的类似PCRPCR反反应重新装配这些小片段成完整应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段长度的重组基因片段(C)(C)，在，在装记过程中被证明有低水平点装记过程中被证明有低水平点突变产生。突变产生。3)3)克隆并选择正突变体克隆并选择正突变体(D)(D)，并将正突变体的重组基，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重因片段作新一轮的体外重组。组。项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNA ShufflingDNA Shuffling与常规定向进化的比较与常规定向进化的比较从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。选而产生的这些特性，称为遗传标记。1.1.自身耐药突变株自身耐药突变株2.2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株结构类似物或前体类似物的耐受突变株3.3.营养缺陷及其回复突变株营养缺陷及其回复突变株筛选筛选饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固体指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液碘液 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。质形成透明圈。利用一些有特别营养要利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕能力，工具菌就能围绕该菌生长该菌生长 待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制工具菌生长的物质的物质 三、菌种保藏三、菌种保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。对于一成功的工业发酵过程极为重要。斜面低温法：短期保存斜面低温法：短期保存石蜡油封存法：中期保存石蜡油封存法：中期保存沙土管：产孢子和芽孢的沙土管：产孢子和芽孢的麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用甘油悬液法：基因工程菌甘油悬液法：基因工程菌冻干保藏冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏在冻干状态下保藏1010年之久。且经冻干后的菌株年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输无需进行冷冻保藏，便于运输液氮法：最为有效，保藏液氮法：最为有效，保藏1515年以上，年以上，宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物第三节、发酵设备及消毒灭菌第三节、发酵设备及消毒灭菌一、发酵设备一、发酵设备发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一一个优良的培养装置应一个优良的培养装置应具有：具有：严密的结构严密的结构良好的液体混合性能良好的液体混合性能高的传质和传热速率高的传质和传热速率灵敏的检测和控制仪灵敏的检测和控制仪表表1 1、搅拌釜式反应器：目前使用、搅拌釜式反应器：目前使用最广泛的发酵反应器最广泛的发酵反应器机械搅拌发酵罐机械搅拌发酵罐1 1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高2 2）能耐受一定的压力）能耐受一定的压力3 3）搅拌通风装置）搅拌通风装置4 4）足够的冷却面积）足够的冷却面积5 5）罐内要减少死角）罐内要减少死角6 6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露罐体：罐体：培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为2.52.510105 5 PaPa形状，圆柱形，两端椭圆形形状，圆柱形，两端椭圆形,受力均匀，减少受力均匀，减少死角，物料容易排除，死角，物料容易排除，高度与直径比高度与直径比1.7-41.7-4：1 1，有力空气利用率，有力空气利用率搅拌器搅拌器档板档板 克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧速率速率消泡器消泡器锯齿式、梳状式及孔板式锯齿式、梳状式及孔板式装于搅拌轴上，齿面略高于液面装于搅拌轴上，齿面略高于液面直径罐径的直径罐径的0.80.9罐体表面各种装置：罐体表面各种装置：中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气或蒸汽吹管或蒸汽吹管罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管压力表接管罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计管和测控仪器接口管和测控仪器接口（二）发酵辅助设备（二）发酵辅助设备无菌空气系统：过滤除无菌空气系统：过滤除菌（使用活性炭，石棉菌（使用活性炭，石棉滤板，多孔合成树脂等）滤板，多孔合成树脂等）灭菌系统灭菌系统发酵车间的管道阀门等发酵车间的管道阀门等发酵对无菌空气的要求是发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。在工程设计中一般要求在工程设计中一般要求10001000次使用周期中只允许次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10N=10-3-3 高空取气管是远离地面几十米高空取气管是远离地面几十米的管子。的管子。地面附近空气中所含的微生物地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的和灰尘等均比高空空气中含的多，每升高多，每升高1010米，空气中杂菌米，空气中杂菌可降低一个数量级可降低一个数量级因此从高空取气要比从低空取因此从高空取气要比从低空取气有利得多。气有利得多。油水分离器油水分离器其内部同时采用直接拦截，其内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。命长。发酵车间的空气过滤器发酵车间的空气过滤器二、培养基和灭菌二、培养基和灭菌（一）培养基（一）培养基C C源：源：N N源：源：无机盐：无机盐：前体，促进剂，抑制剂前体，促进剂，抑制剂2.2.培养基的类型培养基的类型孢子培养基：一般用固体培养基，孢子培养基：一般用固体培养基，N N源不能丰富如：源不能丰富如：小米或麸皮培养基小米或麸皮培养基种子培养基：速效的种子培养基：速效的C,NC,N源，与发酵培养基过渡源，与发酵培养基过渡发酵培养基：迟效与速效的发酵培养基：迟效与速效的C,NC,N源搭配，加前体等源搭配，加前体等（二）灭菌方法（二）灭菌方法1.1.空罐灭菌：高压水空罐灭菌：高压水蒸气，消灭死角蒸气，消灭死角当培养基（或物料）当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行尚未进罐前对罐进行预先灭菌预先灭菌蒸汽下进上出蒸汽下进上出2.2.实罐灭菌：效果最好，实罐灭菌：效果最好，121121度，度，30-5030-50分钟分钟三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。的时间。3.3.连续灭菌：营养破坏最少，连续灭菌：营养破坏最少，128-138128-138度，度，8-128-12分钟分钟。发酵的流程空气空气空气净化处理空气净化处理保藏菌种保藏菌种斜面活化斜面活化扩大培养扩大培养种子罐种子罐主发酵主发酵碳源、氮源、碳源、氮源、无机盐等营养无机盐等营养物质物质灭菌灭菌产物分离纯化产物分离纯化成品成品二、种子的制备二、种子的制备 种种子子扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养,最最终终获获得得一一定定数数量量和和质质量量的的纯纯种种过过程程。这这些些纯纯种种培培养物称为种子。养物称为种子。谷氨酸生产的种子制备谷氨酸生产的种子制备斜面菌种斜面菌种 一级种子培养一级种子培养 二级种子培养二级种子培养 发酵发酵1 1、斜面、斜面培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次次2.2.一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培养培养12h培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基3.3.二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基实验室阶段实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。段。种子制备的过程种子制备的过程二、二、微生物的发酵方式微生物的发酵方式分批培养分批培养补料分批培养补料分批培养连续培养连续培养一、分批发酵一、分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。数都随时间变化。优点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握程和产品质量容易掌握缺点缺点 产率低，不适于测定动力学数据产率低，不适于测定动力学数据分批培养中微生物的生长分批培养中微生物的生长迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳稳 定定 期期死亡期死亡期迟滞期，菌体没有分裂只有生长。迟滞期，菌体没有分裂只有生长。对数生长期对数生长期,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快。到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快。随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。量合成。二、补料分批培养二、补料分批培养l在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。不足而导致的发酵过早结束的缺点。l在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多在工厂的实际生产中采用这种方法很多补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会菌机会三、半连续培养三、半连续培养补料分批培养基础上，加上间歇放掉部分发酵液补料分批培养基础上，加上间歇放掉部分发酵液进入下游提取的操作方式。某些品种采取这种方进入下游提取的操作方式。某些品种采取这种方式，如四环素发酵式，如四环素发酵优点优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大大四、连续培养四、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。限制性基质浓度都是恒定的。1.1.罐式连续发酵罐式连续发酵培培养养液液以以一一定定的的流流速速不不断断地地流流加加到到带带机机械械搅搅拌拌的的发发酵酵罐罐中中，与与罐罐内内发发酵酵液液充充分分混混合合，同同时时带带有有细细胞胞和和产产物物的的发发酵酵液液又又以以同同样样流流速速连连续续流流出出。如如果果用用一一个个装装置置将将流流出出的的发发酵酵液液中中部部分分细细胞胞返返回回发发酵酵罐，就构成循环系统。罐，就构成循环系统。2.2.管式连续发酵管式连续发酵发酵液通过没有混返的管状反应器向前流动发酵液通过没有混返的管状反应器向前流动管管道道的的形形式式有有多多种种，如如直直线线形形、S S形形、蛇蛇形形管管等等。培培养养液液和和从从种种子子罐罐来来的的种种子子不不断断流流入入管管道道发发酵酵器器内，使微生物在其中生长。内，使微生物在其中生长。这这种种连连续续发发酵酵的的方方法法主主要要用用于于厌厌氧氧发发酵酵。如如在在管管道道中中用用隔隔板板加加以以分分隔隔，每每一一个个分分隔隔等等于于一一台台发发酵酵罐，就相当于多罐串联的连续发酵。罐，就相当于多罐串联的连续发酵。连续培养的优缺点连续培养的优缺点 优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。通过改变稀释速发酵周期长，得到高的产量。通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。大增加。发挥菌种的最大生产潜力考虑之点发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点，生长速率、呼吸强度、菌种本身的代谢特点，生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性，温度、菌代谢与环境的相关性，温度、pHpH、渗透压、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等离子强度、溶氧浓度、剪切力等三、发酵过程中的中间分析项目三、发酵过程中的中间分析项目（一）产量（一）产量发酵液中发酵产物的积累，以发酵单位表示发酵液中发酵产物的积累，以发酵单位表示化学测定法：简单，但受结构类似物的影响，发化学测定法：简单，但受结构类似物的影响，发酵过程中采用。酵过程中采用。生物测定法：麻烦，人为误差大。发酵终点采用生物测定法：麻烦，人为误差大。发酵终点采用（二）（二）PHPHpHpH与微生物的生命活动密切相关与微生物的生命活动密切相关-酶催化活性酶催化活性pHpH的变化又是微生物代谢状况的综合反映的变化又是微生物代谢状况的综合反映-基质代基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况（三）糖（三）糖糖的消耗糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况；反映产生菌的生长繁殖情况；反映产物合成的活力反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节制补糖来调节pHpH，促进产物合成，不致于盲目补，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。糖含量测定包括总糖和还原糖。总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。糖。（四）氨基氮（四）氨基氮氨基氮指有机氮中的氮氨基氮指有机氮中的氮氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。提取过程。（五）菌丝形态（五）菌丝形态四、发酵过程的影响因素及控制四、发酵过程的影响因素及控制发酵过程控制是发酵的重要部分发酵过程控制是发酵的重要部分同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的必要的（一）菌体浓度的影响及控制（一）菌体浓度的影响及控制菌体浓度反应菌体细胞数和胜利特性菌体浓度反应菌体细胞数和胜利特性结构越复杂的生物，分裂所需时间越长结构越复杂的生物，分裂所需时间越长发酵中菌液需控制在合理浓度中，过高，营养消发酵中菌液需控制在合理浓度中，过高，营养消耗过快，有毒废物积累，改变菌体代谢途径，影耗过快，有毒废物积累，改变菌体代谢途径，影响溶氧；过低，产率下降响溶氧；过低，产率下降依靠调节培养基和补料控制菌体浓度依靠调节培养基和补料控制菌体浓度（二）（二）培养基的影响及其控制培养基的影响及其控制u1.1.碳源碳源葡萄糖速效碳源，生长菌体葡萄糖速效碳源，生长菌体淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。u2.2.氮源氮源氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。u3.3.磷酸盐和微量元素磷酸盐和微量元素微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根发酵中用来计算磷含量的是磷酸根抗生素对磷酸盐浓度很敏感抗生素对磷酸盐浓度很敏感生长浓度：生长浓度：0.32-300 M0.32-300 M生产浓度：生产浓度：1.0 M1.0 M采用生长亚适量磷酸盐浓度采用生长亚适量磷酸盐浓度u4.4.补料补料补基质和前体补基质和前体中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控制制PHPH，改善通气等